CN1121501C - 脂肪酶非水相中生物转化合成失水山梨醇单油酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化工，具体地说是一种利用微生物脂肪酶在非水相体系中转化合成糖酯类表面活性剂-失水山梨醇油酸酯的方法。利用适宜的条件，在非水相中催化合成该糖酯类表面活性剂，以取代目前工业生产中使用的化学催化剂在高温条件下催化合成的工艺方法。该方法具有反应条件温和，节约能耗；反应特异性强，可致敏、致癌的有毒害副产物少；非水相中进行酶促酯化反应效率更高等特点。
Description
本发明涉及生物化工，具体地说是一种利用微生物脂肪酶在非水相体系中转化合成糖酯类表面活性剂——失水山梨醇油酸酯的方法。
失水山梨醇单油酸酯作为一种重要的非离子表面活性剂，不仅具有良好的乳化性和稳定性，而且无毒、无刺激；其具有生物可降解性，对环境无害；原料来源广泛，价格便宜，已广泛地应用在纺织、造纸、皮革、塑料、农药等许多领域，其优质产品在食品、医药、化妆品中也有重要应用。
传统失水山梨醇脂肪酸酯的合成采用化学方法，以酸或碱作为催化剂，在高温条件下失水、酯化制成，这种方法不可避免地一些问题：一、生产中使用的无机催化剂易带入铅、砷等重金属，而且反应产物十分复杂，其中有些是致敏或致癌物质，在食品、化妆品及医药的高品质产品中应用上受到限制；二、在高温条件下反应，生产能耗高；三、化学法生产的产品品质较低，容易导致产品色泽加深，单酯含量不高；四、从产品安全性和环保角度看，应用生物技术替代传统化学合成途径生产化合物符合国际发展潮流。酶法合成具有高效性和特异性、反应条件温和、副产物较少等特点，近来发展很快。随着酶工程研究，特别是近期异常环境——非水相酶促反应研究的发展，利用生物催化剂为合成糖酸酯提供了新的方法。
但是由于糖或糖醇与脂肪酸的溶解性质相差较大，许多研究在水相中酶法合成酯，产率很低。利用脂肪酶以吡啶作溶剂合成了一些糖酸酯，产率比水相中要好些，但却是以有毒的吡啶或是二甲基甲酰胺作为溶剂，将产品应用于食品、医药等领域安全性不高。
因此，本发明的目的在于寻求一种脂肪酶非水相中生物转化合成失水山梨醇单油酸酯的方法，利用微生物脂肪酶，在无溶剂系统中催化酯化反应，合成Span80(即失水山梨醇)，通过减压蒸发除去水份，促进反应正向进行，经有机溶剂提取得到产物。该方法避免了高温及无机催化剂对人体可能造成的伤害，降低了能耗，改善了环境，提高了产品品质。
为实现上述发明目的而采取的主要技术方案是：
a、加料：将底物脂肪酸——油酸与底物脂肪醇——失水山梨醇按摩尔浓度比为1∶1～10的比例加入到酶反应器中，再加入500～2000单位/克(或称u/g)的失水山梨醇的脂肪酶后开始反应；
b、反应：在60±10℃，真空度低于-0.05Mpa的减压条件下，旋转搅拌反应48～72小时，至底物的摩尔转化率达平衡状态，通常可达95％以上；
c、分离：反应结束后，将n倍体积的有机溶剂分m次加入到反应器中，每次振荡h小时，过滤得到反应产物的有机溶剂溶液；不溶物为未反应的失水山梨醇和脂肪酶，可进行下一批反应；
d、蒸馏：将前述溶液液收集，于真空度-0.05～-0.07Mpa的条件下减压蒸馏，除去有机溶剂，得到产物——失水山梨醇单油酸酯。
需要指出的是本申请中出现的m、n、h均为正整数，该正整数一般为1-10之间，具体多少对本发明的影响不大。
本发明的第2个特征是所用的油酸为经过纯化的油酸，纯度大于99％，所用的脂肪酶为根霉(Rhizopus)脂肪酶，固定化假丝酵母(Candida)脂肪酶，米曲霉(Aspergillus)脂肪酶。
本发明的第3个特征是所用的失水山梨醇为山梨醇经加热脱水，得到失水山梨醇，其醚化度为1～1.2；具体制取方法为：70％山梨醇或固体山梨醇在酸性催化剂或碱性催化剂存在的条件下，在温度为150～230℃、真空状态、通氮气(N2)保护下反应1～3小时，分子内脱去一摩尔水即为失水山梨醇，失水山梨醇的羟值在1150～1400mgKOH/g之间，色泽较深时可采用双氧水(H2O2)、活性炭等脱色，使其色泽达到要求的黑曾值。本文中出现的mgKOH/g是指：毫克的氢氧化钾/克。
本发明的第4个特征是所用的脱色剂为双氧水或活性炭。
本发明的第5个特征是在加料工序a中，反应器中的反应体系为无溶剂体系，底物脂肪酸与底物脂肪醇的摩尔浓度比为1∶3。
本发明的第6个特征是在反应工序b中，温度为60℃，真空度低于-0.09Mpa。
本发明的第7个特征是在分离工序c中分离出的脂肪酶，经有机溶剂和缓冲液洗涤后，可再次用于催化反应。
本发明的第8个特征是在蒸馏工序d中蒸发出的有机溶剂经过冷凝、除水处理后，可回收使用；因此整个过程基本上无废物排放。
本发明的第9个特征是提取所用的有机溶剂为正己烷或正庚烷。
本发明的第10个特征是所述酸性催化剂为对甲苯磺酸、甲基磺酸、磷酸(H3PO4)，所述碱性催化剂为氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)。
本发明的反应方程式如下：
酶活单位定义为：在60℃反应条件下，每分钟消耗1摩尔(mol)月桂酸所需酶量定义为1个脂肪酶酯化合成活力单位(u)。
在底物中加入少量的与产物同类型的表面活性剂，有助于底物间的接触，从而促进了反应的进行。
提取所用的有机溶剂为正己烷，正庚烷效果也不错。
本发明与其它合成方法相比具有以下优点：
1、该反应是在无溶剂，减压条件下进行的。经过比较，无溶剂体系较有机溶剂和水相反应有较高的转化率；而减压条件有利于反应生成的水分的排除，在反应动力学上也有利于反应向产物生成的方向进行，从而提高了反应效率。
2、该合成方法反应条件温和，操作简单，而且在无溶剂体系中进行，脂肪酶催化活性保持较好，酶制剂的回收和重复使用也较为容易。并且下游工程也不复杂。较温和的反应条件也大大的减少了能耗，降低了生产成本。
3、失水山梨醇油酸酯由于采用生物技术——酶法催化生产，反应的特异性强，副产物少，产品具有较高的安全性，品质和档次比较高。
4、经HPLC(高压色相检测)分析，产品成分较为单一，单酯含量较高，较化学合成产品提高近一倍。
利用本发明所合成的产品，其成分较为单一，纯度较高，属高品质的生物制品，其各项质量指标均达到国家标准，绝大多数指标优于化学产品。本方法对于提升我国糖酯类表面活性剂产品的品质，增加其使用的安全性和有效性具有积极的社会和经济效益。
本发明得到的产品可应用于医药、化妆品及食品工业中。
下面详细描述本发明的实施例：
实施例一：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假丝酵母脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达96.4％，脂肪酶半衰期为921.4小时。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到81％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例二：
32.8g(0.2mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假丝酵母脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，65℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达95.6％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到78％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例三：
32.8g(0.2mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假丝酵母脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，55℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达93.2％，经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到81％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例四：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化米曲霉脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达91.5％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，色泽较同类产品明显较浅。
实施例五：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达90％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，色泽较同类产品明显较浅。
实施例六——失水山梨醇的制备：
固体山梨醇245g加入1.0％催化剂H3PO3，在N2保护下真空度0.09MPa、150～200℃反应2.0小时，得到产物206g，其羟值为1340mgKOH/g，色泽达Gardner值4。
实施例七：
16.4g(0.1mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假丝酵母脂酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应72h，反应转化率达97.0％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到78％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例八：
164g(1.0mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假丝酵母脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，65℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达93％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到81％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例九：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入25000u固定化假丝酵母脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应70h，反应转化率达93.0％，经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到80％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例十：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入50000u固定化米曲霉脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达92.5％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到81％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例十一：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入100000u固定化华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达96.2％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到82％，色泽较同类产品明显较浅。
实施例十二：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，50℃振荡(150r/min)反应70h，反应转化率达94％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，色泽较同类产品明显较浅。
实施例十三：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，70℃振荡(150r/min)反应48h，反应转化率达94％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，色泽较同类产品明显较浅。
实施例十四：
49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa减压条件下，60℃振荡(150r/min)反应72h，反应转化率达93.1％。经有机溶剂提取，产品失水山梨醇油酸酯质量符合国家标准GB 13481-92，其中单酯含量达到81％，色泽较同类产品明显较浅。
Claims (9)
1、脂肪酶非水相中生物转化合成失水山梨醇单油酸酯的方法，其特征是：a、加料：将底物油酸与底物失水山梨醇按摩尔浓度比1∶1～10的比例加入到酶反应器中，再加入500～2000u/克的失水山梨醇的脂肪酶后开始反应；b、反应：在60±10℃，真空度低于-0.05Mpa的减压条件下，旋转搅拌反应48～72小时，至底物的摩尔转化率达平衡状态；c、分离：反应结束后，将n倍体积的有机溶剂分m次加入到反应器中，每次振荡2小时，过滤得到含有有机溶剂的反应产物的溶液；d、蒸馏：收集前述溶液，于真空度-0.05～-0.07Mpa的条件下减压蒸馏，除去有机溶剂，得到失水山梨醇单油酸酯。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的油酸为经过纯化的油酸，纯度大于99％，所用的脂肪酶为根霉(Rhizopus)脂肪酶，或固定化假丝酵母(Candida)脂肪酶，或米曲霉(Aspergillus)脂肪酶。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的失水山梨醇为山梨醇经加热脱水，得到失水山梨醇，其醚化度为1～1.2；具体制取方法为：70％山梨醇在酸性催化剂或碱性催化剂存在条件下，在温度为150～230℃、真空状态、通氮气保护下反应1～3小时，分子内脱去1摩尔水即为失水山梨醇。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征是在加料工序a中，底物油酸与底物失水山梨醇的摩尔浓度比为1∶3。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征是在反应工序b中，温度为60℃，真空度低于-0.09Mpa。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征是在分离工序c中分离出的脂肪酶，经有机溶剂和缓冲液洗涤后，再次用于催化反应。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征是在蒸馏工序d中蒸发出的有机溶剂经过冷凝、除水处理后，回收使用。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征是提取所用的有机溶剂为正己烷或正庚烷。
9、根据权利要求3所述的方法，其特征是酸性催化剂为对甲苯磺酸或甲基磺酸或磷酸，所述碱性催化剂为氢氧化钠或氢氧化钾。
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