CN112147185A - 一种控制多肽穿过纳米孔速度的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种控制多肽穿过纳米孔的速度的方法及其在测定多肽的氨基酸序列中的应用，具体为将核酸连接到多肽上获得核酸‑多肽连接物，在核酸酶的存在下施加跨纳米孔的电压使所述连接产物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动进而控制所链接的多肽的在纳米孔中的运动，以达到控制多肽通过纳米孔速度的目的。本发明在对多肽控速的同时，读取多肽通过纳米孔过程中的纳米孔电流信号获得多肽的电信号波形，所述电线号波形可进一步用于获得所述多肽的氨基酸序列，或用于鉴定所述多肽或其部分，也可用于构建多肽的电信号波形库。

Description

一种控制多肽穿过纳米孔速度的方法及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质/多肽检测领域，具体涉及一种控制多肽穿过纳米孔的速度的方法及其在测定多肽的氨基酸序列中的应用。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，与各种生命活动息息相关，对蛋白质的氨基酸序列和其它特征进行表征对医学和生命科学有着重要意义。
传统的蛋白质测序方法包括Edman降解法和质谱法。专利CN106645437A公开了一种基于化学修饰改性和同位素标记的多肽氨基酸序列从头测序方法。专利CN104034791A公开了了一种基于碰撞诱导裂解(CID)与电子转移裂解(ETD)质谱谱图融合的多肽从头测序方法。
传统的蛋白质测序方法成本高、耗时长、操作复杂。因而，亟需一种高通量、低成本的蛋白质测序和检测方法。
纳米孔道分析技术是一种低成本、快速、无需标记的单分子检测技术，已成功用于核酸测序领域。纳米孔测序法是采用电泳技术，借助电泳驱动单个DNA或RNA分子逐一通过纳米孔来实现测序的。专利CN104694649A公开了一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件。专利CN106255551A公开了一种用于长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。专利CN108885649A公开了一种使用纳米孔技术对短DNA片段进行快速测序的方法。
另一方面，纳米孔技术实现核酸测序的一个关键因素是找到了合适的核酸酶，如合成酶或者解旋酶，可以沿着线性核酸聚合物的链进行移动，从而有效的控制核酸穿过纳米孔的速度。因此，寻找合适的可以控制多肽过孔速度的酶类是纳米孔检测肽链序列的关键。至今尚未发现合适的酶直接作用于多肽链上，可以较为均匀的控制多肽链的穿过纳米孔的速度。本发明提供了一种引导蛋白/多肽通过纳米孔并获得电信号的方法，具体为在多肽上连接一段核酸，通过核酸酶控制核酸的过孔从而间接控制多肽的过孔。所述方法获得的电信号可进一步用于测定多肽的氨基酸序列或表征多肽的其他特征。
发明内容
本发明提供了一种通过酶来控制蛋白/多肽通过纳米孔的速度的方法，具体为在多肽上连接核酸，通过核酸酶控制核酸的运动进而控制所连接的多肽的在纳米孔中的运动，以达到控制多肽通过纳米孔速度的目的。本发明在对多肽控速的同时，读取多肽通过纳米孔过程中的纳米孔电流信号获得待测多肽的电信号波形。所述电信号波形可进一步用于获得所述待测多肽的氨基酸序列，或用于鉴定所述待测多肽或其部分，例如鉴定突变位点或多肽/蛋白的翻译后修饰等。还可利用本发明方法测定已知多肽的电信号，构建多肽测定信号库。
本发明的第一方面，涉及一种通过酶来控制多肽穿过纳米孔的速度的方法，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而间接控制所连接多肽穿过纳米孔的速度(过孔速度)。
所述的核酸酶包括聚合酶、解旋酶或转位酶，优选地为解旋酶。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶为聚合酶，优选为Phi29。
在本发明的另一个实施方式中，所述核酸酶为转位酶。
在本发明的又一个实施方式中，所述核酸酶为解旋酶，优选能够引导核酸逆电场力方向运动的解旋酶，更优选Hel308家族的解旋酶，包括Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。
在本发明的又一个实施方式中，在所述核酸的反义核酸和解旋酶的存在下施加跨纳米孔的电压。
优选的，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。进一步优选的，所述核酸为DNA。更进一步优选的，所述核酸为单链DNA。
步骤1)中的核酸和多肽可以使用任何本领域已知的方式进行连接，例如所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。其中，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式包括但不限于通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。所述核酸与所述多肽共价键结合相连具体制备方法例如是参考“Chemical Strategies for the Synthesis of Peptide-Oligonucleotide Conjugates,K Lu etc.,Bioconjugate chemistry,2009,ACSPublications”中所描述的内容。
在本发明的一个实施方式中，核酸和多肽通过多肽N端的氨基与带醛基修饰的核酸在弱酸性条件下进行还原胺化反应的连接。在本发明的另一个实施方式中，对于末端带有半胱氨酸的肽链，优选的，使用马来酰胺-NHS双交联试剂，例如sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)，与带有氨基的DNA进行连接。
优选的，所述纳米孔是生物纳米孔。进一步优选的，所述纳米孔是MspA纳米孔。
本发明的第二方面，涉及一种测定多肽的电信号波形的方法，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而间接的控制所连接多肽的过孔速度；
3)读取纳米孔电流信号，获得多肽的电信号波形。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶为聚合酶，优选为Phi29。
在本发明的另一个实施方式中，所述核酸酶为转位酶。
在本发明的又一个实施方式中，所述核酸酶为解旋酶，优选能够引导核酸逆电场力方向运动的解旋酶，更优选Hel308家族的解旋酶，包括Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。
在本发明的又一个实施方式中，在所述核酸的反义核酸和解旋酶的存在下施加跨纳米孔的电压。优选的，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。进一步优选的，所述核酸为DNA。更进一步优选的，所述核酸为单链DNA。
步骤1)中的核酸和多肽可以使用任何本领域已知的方式进行连接，例如所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。其中，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式包括但不限于通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。
在本发明的一个实施方式中，核酸和多肽通过多肽N端的氨基与带醛基修饰的核酸在弱酸性条件下进行还原胺化反应的连接。在本发明的另一个实施方式中，对于末端带有半胱氨酸的肽链，优选的，使用马来酰胺-NHS双交联试剂，例如sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)，与带有氨基的DNA进行连接。
优选的，所述纳米孔是生物纳米孔。进一步优选的，所述纳米孔是MspA纳米孔。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
1)将ssDNA用Sulfo-SMCC活化，加入末端含有巯基的多肽，获得ssDNA-多肽连接产物；
2)混合ssDNA-多肽连接产物和反义ssDNA(ssDNA-R)，退火形成双链部分；
3)制备磷脂双分子层，嵌入单个纳米孔蛋白；
4)加入步骤2)的退火产物、解旋酶、ATP和镁离子，施加电压，记录所产生的电信号波形。
本发明的第三方面，涉及一种测定多肽的氨基酸序列的方法，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而间接控制所连接多肽的过孔速度；
3)读取纳米孔电流信号，对所述多肽的氨基酸序列的电流信号进行识别。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶为聚合酶，优选为Phi29。
在本发明的另一个实施方式中，所述核酸酶为转位酶。
在本发明的又一个实施方式中，所述核酸酶为解旋酶，优选能够引导核酸逆电场力方向运动的解旋酶，更优选Hel308家族的解旋酶，包括Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。
在本发明的又一个实施方式中，在所述核酸的反义核酸和解旋酶的存在下施加跨纳米孔的电压。
优选的，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。进一步优选的，所述核酸为DNA。更进一步优选的，所述核酸为单链DNA。
步骤1)中的核酸和多肽可以使用任何本领域已知的方式进行连接，例如所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。其中，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式包括但不限于通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。
在本发明的一个实施方式中，核酸和多肽通过多肽N端的氨基与带醛基修饰的核酸在弱酸性条件下进行还原胺化反应的连接。在本发明的另一个实施方式中，对于末端带有半胱氨酸的肽链，优选的，使用马来酰胺-NHS双交联试剂，例如sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)，与带有氨基的DNA进行连接。
优选的，步骤2)所述的纳米孔是生物纳米孔。进一步优选的，所述纳米孔是MspA纳米孔。
本发明的第四方面，涉及一种鉴定多肽或其部分的方法，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而间接控制所连接多肽的过孔速度；
3)读取纳米孔电流信号，获得多肽的电信号波形；
4)根据所述电信号波形对所述多肽或其部分进行鉴定。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶为聚合酶，优选为Phi29。
在本发明的另一个实施方式中，所述核酸酶为转位酶。
在本发明的又一个实施方式中，所述核酸酶为解旋酶，优选能够引导核酸逆电场力方向运动的解旋酶，更优选Hel308家族的解旋酶，包括Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。优选的，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。进一步优选的，所述核酸为DNA。更进一步优选的，所述核酸为单链DNA。
在本发明的又一个实施方式中，在所述核酸的反义核酸和解旋酶的存在下施加跨纳米孔的电压。步骤1)中的核酸和多肽可以使用任何本领域已知的方式进行连接，例如所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。其中，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式包括但不限于通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。
在本发明的一个实施方式中，核酸和多肽通过多肽N端的氨基与带醛基修饰的核酸在弱酸性条件下进行还原胺化反应的连接。在本发明的另一个实施方式中，对于末端带有半胱氨酸的肽链，优选的，使用马来酰胺-NHS双交联试剂，例如sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)，与带有氨基的DNA进行连接。
优选的，所述纳米孔是生物纳米孔。进一步优选的，所述纳米孔是MspA纳米孔。
步骤4)中对所述多肽或其部分的鉴定可以使用任何本领域已知的方法进行，例如获得多肽的氨基酸序列后与数据库进行比对。
在本发明的一个具体实施方式中，首先测定已知多肽的电信号波形并构建测定信号库，然后将所述多肽的电信号波形与信号库进行比对实现对所述多肽或其部分的鉴定。
本发明所述的鉴定可以是对多肽或其部分翻译后的修饰进行检测，所述的修饰包括但不限于泛素化、磷酸化、糖基化、酯基化、烷基化和乙酰化、谷氨酸化、硫辛酸化、异戊二烯化、甘氨酸化、硫酸化、腺苷酸化、ADP核糖基化。
本发明的第五方面，涉及一种构建多肽鉴定信号库的方法，具体为使已知多肽通过纳米孔传感器，收集电信号，获得电信号波形。在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
1)将已知多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而间接控制所连接多肽的过孔速度；
3)读取纳米孔电流信号，获得已知多肽的电信号波形；
4)使用步骤3)中获得的已知多肽的电信号构建多肽鉴定信号库。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶为聚合酶，优选为Phi29。
在本发明的另一个实施方式中，所述核酸酶为转位酶。
在本发明的又一个实施方式中，所述核酸酶为解旋酶，优选能够引导核酸逆电场力方向运动的解旋酶，更优选Hel308家族的解旋酶，包括Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。
在本发明的又一个实施方式中，在所述核酸的反义核酸和解旋酶的存在下施加跨纳米孔的电压。
优选的，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。进一步优选的，所述核酸为DNA。更进一步优选的，所述核酸为单链DNA。
步骤1)中的核酸和多肽可以使用任何本领域已知的方式进行连接，例如所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。其中，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式包括但不限于通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。
在本发明的一个实施方式中，核酸和多肽通过多肽N端的氨基与带醛基修饰的核酸在弱酸性条件下进行还原胺化反应的连接。在本发明的另一个实施方式中，对于末端带有半胱氨酸的肽链，优选的，使用马来酰胺-NHS双交联试剂，例如sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)，与带有氨基的DNA进行连接。
优选的，所述纳米孔是生物纳米孔。进一步优选的，所述纳米孔是MspA纳米孔。
本发明所用的术语“核酸”是指包含一个或多个核苷酸的聚合物或寡聚物。核酸可包含DNA多核苷酸或寡核苷酸、RNA多核苷酸或寡核苷酸，或DNA多核苷酸或寡核苷酸和/或RNA多核苷酸或寡核苷酸的一个或多个部分。如本文一般所用的，“核苷酸”或“碱基”可以是基本核苷酸或核苷酸类似物。基本核苷酸是脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、腺苷单磷酸(AMP)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟苷单磷酸(GMP)或尿苷单磷酸(UMP)。核苷酸类似物是在基本核碱基(A、C、G、T和U)、脱氧核糖/核糖结构、基本核苷酸的磷酸基团或其任意组合上具有修饰的基本核苷酸的类似物或模拟物。例如，核苷酸类似物可具有经修饰的碱基，无论是天然存在的还是人造的。经修饰的碱基的实例包括但不限于甲基化的核碱基、经修饰的嘌呤碱基(例如，次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、isodG)、经修饰的嘧啶碱基(例如，5,6-二氢尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶、isodC)、通用碱基(例如，3-硝基吡咯和5-硝基吲哚)、非结合性碱基模拟物(例如，4-甲基苯并咪唑和2,4-二氟甲苯或苯)以及无碱基(无碱基核苷酸，其中核苷酸类似物不含碱基)。具有经修饰的脱氧核糖(例如，双脱氧核苷，如双脱氧鸟苷、双脱氧腺苷、双脱氧胸苷和双脱氧胞苷)和/或磷酸结构(统称为骨架结构)的核苷酸类似物的实例包括但不限于乙二醇核苷酸、吗啉代和锁定核苷酸。
本发明所用的术语“纳米孔”可以是生物纳米孔或固态纳米孔。生物纳米孔的实例包括但不限于金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米孔、MspA纳米孔、Csgg纳米孔、phi29纳米孔、FraC纳米孔以及各种其他天然存在的、经修饰的天然的及合成的由生物大分子组成的纳米孔。固态纳米孔的实例包括但不限于氮化硅纳米孔、二氧化钛纳米孔、氧化铝纳米孔、石墨烯纳米孔等。可基于多肽的特性来选择合适的纳米孔。
本发明所用的术语“反义核酸”表示能够与所述核酸退火形成双链的核酸，可以与所述核酸完全匹配，也可以与所述核酸部分匹配。能够与所述核酸退火形成双链并在解旋酶的作用下控制所述核酸及其所连接的多肽通过纳米孔速度的均属于本发明范围的“反义核酸”。
本发明所用的术语“部分”可以是所述多肽的一段连续的氨基酸序列，例如一段保守序列或基序，也可以是一个或几个氨基酸残基，例如所述多肽的一个或几个突变位点。
本发明所用的术语“核酸酶”包括聚合酶、解旋酶或转位酶，优选地为解旋酶。
本发明所用的术语“聚合酶”可以是phi29(芽孢杆菌噬菌体φ29)或其变体、pol6(梭菌噬菌体phiCPV4；GenBank：AFH27113.1)或其变体、pol7(放线菌噬菌体Av-1；GenBank：ABR67671.1)或其变体。
本发明所用的术语“解旋酶”可以是选自Hel308解旋酶、如Tral解旋酶或TrwC解旋酶等、RecD解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶。解旋酶可以是Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。同时解旋酶可以是在以下国际申请号中公开的解旋酶、经修饰解旋酶或解旋酶构建体中的任一者：PCT/GB2012/052579、PCT/GB2012/053274、PCT/GB2012/053273、PCT/GB2013/051925、PCT/GB2013/051924、PCT/GB2013/051928、PCT/GB2014/052736、PCT/GB2014/052736、PCT/GB2015/052916和PCT/CN2018/108227。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1示出了ssDNA经Sulfo-SMCC活化后与末端带巯基的多肽连接形成ssDNA-多肽连接产物；
图2示出了在核酸酶的存在下，ssDNA-多肽连接产物通过纳米孔的过程：核酸-多肽连接物快速穿过纳米孔，然后在核酸酶的作用下，核酸牵引与其连接的多肽以受控的速度再次通过纳米孔，当多肽通过纳米孔时，对多肽进行测定；
图3示出了ssDNA测试信号预测结果；
图4示出了ssDNA的实际测试结果；
图5示出了ssDNA的实际测试结果；
图6示出了ssDNA的实际测试结果；
图7示出了ssDNA-多肽连接产物的15％变性凝胶电泳结果，第2-4泳道分别为ssDNA、ssDNA+Sulfo-SMCC、ssDNA+Sulfo-SMCC+E29C；
图8示出了ssDNA-多肽连接产物的15％变性凝胶电泳结果，第2-4泳道分别为ssDNA+Sulfo-SMCC+EGSLFL-60C、ssDNA、ssDNA+Sulfo-SMCC+EDSLFYD-60C；
图9-图10示出了ssDNA和E29C连接产物的测试结果；
图11-图12示出了ssDNA和EGSLFL-60C连接产物的测试结果；
图13-图14示出了ssDNA和EDSLFYD-60C连接产物测试结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1实验材料
Hel308解旋酶，ATP(100mM Thermo Fisher)
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(Avanti)
序列：
ssDNA(SEQ NO.1)：
NH2-CAAGAATACCTTTTTTTTTCCTTTTTTTTCCTCTACCACTTTTCAGATCTCACTATCGCATTCTCATGCAGGTCGTAGCTTTTTTCTTTTTTCATCATC
ssDNA-R(SEQ NO.2)：
TTTTTTTTTTTTTTTGCTACGACCTGCATGAGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-cholesterol
EGSLFL-60C(SEQ NO.3)：
EEEEGEEEEGGEEEGGEEESSEEEEGGEEELFEEGGGGEEEESSSSEEEELLEEEEEEEC
EDSLFYD-60C(SEQ NO.4)：
EDEDEEEDYDDDEEEDEEDEVEEEEEYGEVVGELGGGGSHHDHHSSSGSEEEYEEDDDDC
E29C(SEQ NO.5)：
EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEC
实施例2 ssDNA的测定
1、实验方法：
将实施例1中的ssDNA和ssDNA-R按照物质的量比例为1:1进行退火形成双链部分；在PEEK管横截面上使用磷脂与十六烷的混合物预涂，浸没在电解质溶液后使用移液器在peek管截面上吹打气泡再吸走，即形成磷脂双分子层。在400mMKCl，HEPES缓冲液pH7的体系里，向cis端加入MspA蛋白，在180mV下当出现嵌孔电流值在160pA左右时向50μl的cis端溶液中加入2μl上述退火产物和Hel308蛋白的混合液，再加入2μlATP后，施加180mV的电压,记录数据。
2、实验结果
如图4、图5和图6所示，可以看到在固定电压下纳米孔电流在时间轴上出现了台阶式的跳跃，这是ssDNA在解旋酶控速下的过孔电流信号。特别是这几段信号后半段出现了25pA左右的长的台阶信号，其中间出现了一个上升的电流台阶。这个变化与图3中80-90位的核苷酸序列过孔信号一致，对应于ssDNA靠近5端的TTTTTTTTTCCTTTTTTTT序列过孔信号。
实施例3 ssDNA与多肽的连接
1、实验方法：
取40μlDMSO溶解1mgSulfo-SMCC。充分溶解后，加入80μl150mM硼酸缓冲液(pH8.5)，混匀；将混合液迅速加入到10-16nmol的实施例1的ssDNA中，涡旋振荡混匀，金属浴30℃；之后通过透析、乙醇沉淀和脱盐柱去除未反应的SMCC。根据紫外吸收测量所得的ssDNA浓度，分别加入5倍浓度的含有巯基的多肽EGSLFL-60C、多肽EDSLFYD-60C和多肽E29C，室温振荡反应1.5h，-20℃待用。将上述连接产物用于15％Urea-page胶分析。
2、实验结果
图7、图8示出了ssDNA-多肽连接产物的15％Urea-page胶分析结果。图7第2-4泳道分别为ssDNA、ssDNA+Sulfo-SMCC、ssDNA+Sulfo-SMCC+E29C；图8第2-4泳道分别为ssDNA+Sulfo-SMCC+EGSLFL-60C、ssDNA、ssDNA+Sulfo-SMCC+EDSLFYD-60C。图中条带均处于期望的位置，其中与肽链连接后出现了高分子量的条带，显示ssDNA-多肽连接成功，ssDNA部分参与反应的反应效率均在50％以上。图8第3泳道ssDNA样品中出现的信号较弱的高分子量条带是由于样品加入过多引起，而非连接反应产物。
实施例4 ssDNA-多肽E29C连接产物的测定
1、实验方法：
将实施例3中得到的ssDNA-E29C连接产物和ssDNA-R按照物质的量比例为1:1进行退火形成双链部分；在PEEK管横截面上使用磷脂与十六烷的混合物预涂，浸没在电解质溶液后使用移液器在peek管截面上吹打气泡再吸走，即形成磷脂双分子层。在400mMKCl，HEPES缓冲液pH7的体系里，向cis端加入MspA蛋白，在180mV下当出现嵌孔电流值在160pA左右时向50μl的cis端溶液中加入2μl上述退火产物和Hel308蛋白的混合液，再加入2μlATP后，施加180mV的电压,记录数据。
2、实验结果
如图9所示，ssDNA-E29C连接产物先是出现了与图7、图8类似的电流信号，说明先是ssDNA部分的控速过孔，在这段信号后端出现了电流增长到70-75pA的抖动的平台，由于ssDNA在纳米孔中产生的电流在此测试条件下均处于60pA以下，因此这部分高电流的产生是由于肽链被拖入了纳米孔的最窄处而产生的电流，由于肽链本身在拉直的情况下直径较ssDNA拉直情况小，因此产生的纳米孔电流较大。图10是图9在肽链过孔时信号的放大图，可以看到70-75pA平台有近5pA的上下抖动，有可能是由于E29序列的肽链在过孔过程中的热运动造成。
实施例5 ssDNA-多肽EGSLFL-60C连接产物的测定
1、实验方法：
将实施例3中得到的ssDNA-EGSLFL-60C连接产物和ssDNA-R按照物质的量比例为1:1进行退火形成双链部分；在PEEK管横截面上使用磷脂与十六烷的混合物预涂，浸没在电解质溶液后使用移液器在peek管截面上吹打气泡再吸走，即形成磷脂双分子层。在400mMKCl，HEPES缓冲液pH7的体系里，向cis端加入MspA蛋白，在180mV下当出现嵌孔电流值在160pA左右时向50μl的cis端溶液中加入2μl上述退火产物和Hel308蛋白的混合液，再加入2μlATP后，施加180mV的电压,记录数据。
2、实验结果
如图11所示，ssDNA-EGSLFL-60C连接产物先是出现了与图7、图8类似的电流信号，说明先是ssDNA部分的控速过孔，在这段信号后端出现了电流增长到70-75pA的抖动的平台，由于ssDNA在纳米孔中产生的电流在此测试条件下均处于60pA以下，因此这部分高电流的产生是由于肽链被拖入了纳米孔的最窄处而产生的电流，由于肽链本身在拉直的情况下直径较ssDNA拉直情况小，因此产生的纳米孔电流较大。图12是图11在肽链过孔时信号的放大图，可以看到70-75pA平台初期一个近50pA的电流低峰，有可能是由于靠近C端的LL这疏水氨基酸造成的电流降低。这说明本方法可以对氨基酸序列有一定的分辨能力。
实施例6 ssDNA-多肽EDSLFYD-60C连接产物的测定
1、实验方法：
将实施例3中得到的ssDNA-EDSLFYD-60C连接产物和ssDNA-R按照物质的量比例为1:1进行退火形成双链部分；在PEEK管横截面上使用磷脂与十六烷的混合物预涂，浸没在电解质溶液后使用移液器在peek管截面上吹打气泡再吸走，即形成磷脂双分子层。在400mMKCl，HEPES缓冲液pH7的体系里，向cis端加入MspA蛋白，在180mV下当出现嵌孔电流值在160pA左右时向50μl的cis端溶液中加入2μl上述退火产物和Hel308蛋白的混合液，再加入2μlATP后，施加180mV的电压,记录数据。
2、实验结果
如图13所示，ssDNA-EGSLFL-60C连接产物先是出现了与图7、图8类似的电流信号，说明先是ssDNA部分的控速过孔，在这段信号后端出现了电流持续增长到80pA的平台，之后电流又降低到46pA，增加到55pA，又降低到45pA。这是由于EGSLFL-60C肽链由C端到N端的最初10-20个氨基酸的序列和种类比较实例4和实例5有更多的变化，因此产生了电流随时间的更复杂的变化。图14是图13在肽链产生的信号部分的放大图。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 一种控制多肽穿过纳米孔速度的方法及其应用
<130> P0102019060264
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caagaatacc tttttttttc cttttttttc ctctaccact tttcagatct cactatcgca 60
ttctcatgca ggtcgtagct tttttctttt ttcatcatc 99
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttttttt tttttgctac gacctgcatg agaatttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt ttttt 75
<210> 3
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Gly Gly
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ser Ser Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Leu Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Gly Gly Gly Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ser Ser Glu Glu
35 40 45
Glu Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys
50 55 60
<210> 4
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Glu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Gly Glu Val Val Gly
20 25 30
Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser His His Asp His His Ser Ser Ser Gly
35 40 45
Ser Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Asp Asp Asp Asp Cys
50 55 60
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys
20 25 30

Claims (22)

1.一种控制多肽穿过纳米孔速度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，所述的核酸酶控制核酸的运动，进而控制所连接多肽穿过纳米孔的速度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶是解旋酶、聚合酶或转位酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚合酶为phi29聚合酶。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述解旋酶为Hel308家族解旋酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述解旋酶为Hel308 Tga或其变体的序列，Hel308 Mbu或其变体的序列，Hel308 Pfu或其变体的序列，Hel308Mma或其变体的序列，Hel308Mok或其变体的序列，Hel308Fac或其变体的序列，Hel308Csy或其变体的序列，Hel308Mhu或其变体的序列，或F8813蛋白或其变体的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为单链DNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸与所述多肽共价键结合相连或通过连接基团相连形成核酸-多肽连接物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸与所述多肽共价键结合相连方式选自通过肟键结合相连、通过酰胺键结合相连、通过硫醚键结合相连、通过二硫键结合相连、通过磷酰键结合相连、通过腙键结合相连、通过酰脲键结合相连、通过click反应形成的环结合相连。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米孔为生物纳米孔或固态纳米孔。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物纳米孔选自金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米孔、MspA纳米孔、Csgg纳米孔、phi29纳米孔和FraC纳米孔，优选为MspA纳米孔。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固态纳米孔选自石墨烯纳米孔、氮化硅纳米孔、二氧化钛纳米孔、氧化铝纳米孔。
13.一种测定多肽的电信号波形的方法，所述的电信号波形由所述多肽通过纳米孔传感器形成，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而控制所连接多肽穿过纳米孔的速度；
3)读取纳米孔电流信号，获得多肽的电信号波形。
14.一种测定多肽的氨基酸序列的方法，其特征在于，通过测量所述多肽通过纳米孔传感器产生的电信号进行序列测定。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而控制所连接多肽穿过纳米孔的速度；
3)读取纳米孔电流信号，对所述多肽的氨基酸序列的电流信号进行识别。
16.一种鉴定多肽或其部分的方法，其特征在于，通过测量所述多肽通过纳米孔传感器产生的电信号进行鉴定。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多肽与核酸连接，获得核酸-多肽连接物；
2)在核酸酶的存在下，施加跨纳米孔的电压使所述核酸-多肽连接物通过纳米孔，通过核酸酶控制核酸的运动，进而控制所连接多肽穿过纳米孔的速度；
3)读取纳米孔电流信号，获得多肽的电信号；
4)根据所述电信号对所述多肽或其部分进行鉴定。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的鉴定为对多肽或其部分翻译后的修饰进行检测，优选的，所述的修饰选自泛素化、磷酸化、糖基化、酯基化、烷基化和乙酰化、谷氨酸化、硫辛酸化、异戊二烯化、甘氨酸化、硫酸化、腺苷酸化、ADP核糖基化。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的部分为所述多肽的连续的氨基酸序列。
20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的部分为所述多肽的一个或几个氨基酸残基。
21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的部分为所述多肽的一个或几个突变位点。
22.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤4)中通过将多肽的电信号波形与已知多肽的信号库进行比对鉴定所述多肽或其部分。
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