JP2008504819A - ポリヌクレオチド配列検出アッセイにおいて反応能力を判定するためのコントロール - Google Patents

ポリヌクレオチド配列検出アッセイにおいて反応能力を判定するためのコントロール Download PDF

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Abstract

本教示は、試料中の１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法、組成物およびキットに関する。本教示のいくつかの実施形態では、プローブが、相補的な標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、連結することにより連結産物を形成する。本教示のいくつかの実施形態では、複合連結アッセイ混合物中の特異的な連結の発生に関する情報を提供するポジティブアッセイコントロールプローブを包含する。本教示のいくつかの実施形態では、複合連結アッセイ混合物中の非特異的な連結の発生に関する情報を提供するネガティブアッセイコントロールプローブを提供する。本教示のいくつかの実施形態では、単型性標的ポリヌクレオチド配列から２つの個別の信号の生成を行なう。

Description

分野：
本教示は、一般に、試料中の１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法、組成物およびキットに関する。より詳細には、これらの方法、キットおよび組成物は、ポリヌクレオチド配列検出アッセイにおいて反応能力を判定するためにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いる。
背景：
１つ以上の標的配列を含有する１つまたは複数の試料中における１つ以上の標的ポリヌクレオチドの有無（または量）を検出することは一般に行なわれている。例えば、癌ならびにエイズおよび肝炎等の多くの感染症の検出は、通常、生体試料を検査して、病状を示す核酸配列の有無を調べることを含む。また、核酸配列の有無の検出は、法科学、父性検査、遺伝カウンセリング、および臓器移植において用いられることも多い。
生物の遺伝子構造は、その生物のゲノム内に含まれる遺伝子によって判定される。遺伝子は、タンパク質を作るために必要とされる情報をコードする長鎖またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーから構成される。生物の特性、能力および特色は、その生物によって作り出されているか、または作り出されていないタンパク質の種類および量と関係する場合が多い。
タンパク質は、以下のようにして遺伝子から作り出すことができる。まず、タンパク質、例えば、タンパク質「Ｘ」をコードする遺伝子のＤＮＡを表す情報が、「転写」として知られる処理により、リボ核酸（ＲＮＡ）に変換される。転写時には、遺伝子の一本鎖の相補的ＲＮＡコピーが作られる。次に、細胞の生化学的機構により、このＲＮＡコピー（タンパク質ＸメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ぶ）が用いられ、タンパク質Ｘが作られる（この処理を「翻訳」と呼ぶ）。基本的に、この細胞のタンパク質製造機構は、ｍＲＮＡと結合し、ＲＮＡコードを「読み取って」、それをタンパク質Ｘのアミノ酸配列に「翻訳」する。要約すれば、ＤＮＡが転写されてｍＲＮＡを作り、それが翻訳されてタンパク質が作られる。
細胞により作り出されるタンパク質Ｘの量は、その細胞内に存在するタンパク質ＸｍＲＮＡの量に大きく依存する場合が多い。１つの細胞内のタンパク質ＸｍＲＮＡの量は、少なくとも部分的に、遺伝子Ｘが発現する度合いによる。特定の遺伝子または遺伝子変異型が存在するか否か、存在する場合にはコピーがいくつあるのかは、生物に大きな影響を与える可能性がある。特定の遺伝子または遺伝子変異型が発現するか否か、発現する場合にはそれがどの程度であるのかは、その生物に大きな影響を与える可能性がある。
概要：
いくつかの実施形態では、本教示は、単型性標的ポリヌクレオチド配列から１つより多くの信号を作り出す方法であって、該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２を用意する工程を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ１は、単型性標的ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部、および同定部を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ２は、単型性標的ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部、および同定部を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ１の同定部は、ポジティブコントロール第１プローブ２の同定部とは異なり；該方法は、ポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２を単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる工程と；ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブから分離する工程と；ポジティブコントロール第１プローブ１および単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしたポジティブコントロール第１プローブ２の同定部を検出することにより、単型性標的ポリヌクレオチド配列から１つより多くの信号を作り出す工程とを包含する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本教示は、連結アッセイにおいて連結特異性を評価する方法であって、該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびコントロールプローブセットを用意する工程を包含し、コントロールプローブセットは、ポジティブコントロール第１プローブおよびネガティブコントロール第１プローブ、および第２プローブを包含し、ポジティブコントロール第１プローブは、標的特異部を包含し、標的特異部は、識別領域および同定部を包含し、ネガティブコントロール第１プローブは、標的特異部を包含し、標的特異部は、識別領域および同定部を包含し、ポジティブコントロール第１プローブおよびネガティブコントロール第１プローブの同定部は異なり、コントロールプローブセットの第２プローブは、標的特異部を包含し；該方法は、第１のポジティブコントロールプローブ、第１のネガティブコントロールプローブ、および第２プローブを単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる工程であって、ポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールプローブは、隣接して単型性標的ポリヌクレオチド配列上の第２プローブとハイブリダイズすることができ、ポジティブコントロールプローブの識別領域は、単型性標的ポリヌクレオチドとの完全な相補性を得ることができ、ネガティブコントロールプローブの識別領域は、単型性標的ポリヌクレオチドとの完全な相補性を得ることを妨げる、工程と；ポジティブコントロール第１プローブを第２プローブと連結し、ネガティブコントロール第１プローブを第２プローブと連結することにより、異なる同定部を含む特異的連結産物および非特異的連結産物を生成する工程と；非特異的連結産物および特異的連結産物をハイブリダイズしていないコントロールプローブおよび連結していないコントロールプローブから分離する工程と；特異的および非特異的連結産物をそれらの個別の同定部に基づいて検出する工程と；特異的連結産物の量と非特異的連結産物を比較する工程とを包含することにより、連結アッセイにおいて連結を評価する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本教示の方法は、多型性ポリヌクレオチド標的配列および実験プローブセットをさらに包含し、実験プローブセットは、実験第１プローブ１、実験第１プローブ２および実験第２プローブを包含し、実験第１プローブ１は、同定部および多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、識別領域を包含し、実験第１プローブ２は、同定部および多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、識別領域を包含し、実験第１プローブ１の同定部は、実験第１プローブ２の同定部とは異なり、実験第１プローブ１の識別領域は、実験第１プローブ２の識別領域とは異なり、第２の実験プローブは、多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、実験第１プローブの識別領域は、単一ヌクレオチド多型の異なる対立遺伝子に対応する異なるヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、実験第１プローブは、多型性標的ポリヌクレオチド配列上の実験第２プローブと隣接してハイブリダイズし、該方法は、実験第１プローブ１と、接触してハイブリダイズした実験第２プローブを連結し、実験第１プローブ２と、接触してハイブリダイズした第２プローブを連結することにより、単一ヌクレオチド多型の２つの対立遺伝子に対応する異なる同定部を包含する特異的連結産物を生成する工程と；特異的連結産物および非特異的連結産物をハイブリダイズしていない実験第１プローブおよび実験第２プローブ、ならびに連結していない実験第１プローブおよび実験第２プローブから分離する工程と；特異的および非特異的連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と；特異的連結産物の量とコントロールプローブセットから生じた非特異的連結産物を比較する工程と；コントロールプローブセットから生じた連結産物と実験プローブセットから生じた連結産物とを比較することにより、連結アッセイにおいて連結を評価する工程をさらに包含する。
いくつかの実施形態では、本教示は、連結を評価する方法であって、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応を用意する工程であって、ポジティブコントロールプローブセットは、ポジティブコントロール第１プローブ１、ポジティブコントロール第１プローブ２、および第２プローブを包含する、工程を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ１は、同定部および単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、単型性ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドと相補的な識別領域を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ２は、同定部および単型性標的ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、単型性ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドと相補的な識別領域を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ１の同定部は、ポジティブコントロール第１プローブ２の同定部とは異なり、ポジティブコントロール第２プローブは標的特異部を包含し、該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列をポジティブコントロール第１プローブ１、ポジティブコントロール第１プローブ２、およびポジティブコントロール第２プローブとハイブリダイズさせる工程であって、ポジティブコントロール第１プローブは、第２プローブと隣接してハイブリダイズする、工程と；ポジティブコントロール第１プローブ１をポジティブコントロール第２プローブと連結し、ポジティブコントロール第１プローブ２をポジティブコントロール第２プローブと連結することにより、ポジティブコントロール第１プローブ１連結産物およびポジティブコントロール第１プローブ２連結産物を形成する工程と；ポジティブコントロール第１プローブ１連結産物およびポジティブコントロール第１プローブ２連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と、を包含することにより、連結を評価する、方法を提供する。
本教示のいくつかの実施形態は、第２の反応をさらに包含し、第２の反応は、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびネガティブコントロールプローブセットを包含し、ネガティブコントロールプローブセットは、ネガティブコントロール第１プローブ１、ネガティブコントロール第１プローブ２、およびネガティブコントロール第２プローブを包含し、ネガティブコントロール第１プローブ１は、同定部および単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的でない識別領域を包含し、ネガティブコントロール第１プローブ２は、同定部および単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、標的特異部は、単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的でない識別領域をさらに包含し、ネガティブコントロール第１プローブ１の同定部は、ネガティブコントロール第１プローブ２の同定部とは異なり、ネガティブコントロール第２プローブは、標的特異部を包含し、該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列をネガティブコントロール第１プローブ１、ネガティブコントロール第１プローブ２、およびネガティブコントロール第２プローブとハイブリダイズさせる工程であって、ネガティブコントロール第１プローブは第２プローブと隣接してハイブリダイズする、工程と；ネガティブコントロール第１プローブ１をネガティブコントロール第２プローブと連結し、ネガティブコントロール第１プローブ２をネガティブコントロール第２プローブと連結することにより、ネガティブコントロール第１プローブ１連結産物およびネガティブコントロール第１プローブ２連結産物を形成する工程と；ネガティブコントロール第１プローブ１連結産物およびネガティブコントロール第１プローブ２連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と；第１の反応において検出された非特異的連結産物と第２の反応において検出された特異的連結産物とを比較する工程と、をさらに包含することにより、連結アッセイにおいて非特異的連結を評価する。
いくつかの実施形態では、連結産物はＰＣＲにより増幅される。
いくつかの実施形態では、ＰＣＲは親和部分が標識されたプライマーを包含する。
いくつかの実施形態では、プローブの同定部は、得られたＰＣＲ単位複製配列に組み込まれ、該方法は、親和部分が標識された単位複製配列鎖を親和部分結合パートナーに固定する工程と；親和部分を有さない反応成分を除去する工程と；複数の移動度プローブを固定された親和部分が標識された単位複製配列鎖とハイブリダイズさせる工程であって、移動度プローブは、親和部分が標識された単位複製配列鎖の同定部または同定部相補体と相補的な領域をさらに包含する、工程と；ハイブリダイズしていない移動度プローブを除去する工程と；ハイブリダイズされた移動度プローブを溶出する工程と；溶出された移動度プローブを移動度依存分析技術を用いて分析し、移動度プローブの個別の移動度により同定部の同一性を判定して連結を評価する工程と、をさらに包含する。
いくつかの実施形態では、移動度プローブは、識別可能な標識をさらに包含し、識別可能な標識は、少なくとも１つの蛍光プローブをさらに包含し、蛍光プローブは、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｔａｍｒａ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｒｏｘ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである。
いくつかの実施形態では、移動度依存分析技術はキャピラリー電気泳動である。
いくつかの実施形態では、親和部分はビオチンである。
いくつかの実施形態では、親和部分結合パートナーはストレプトアビジンである。
いくつかの実施形態では、ユニバーサルフォワードプライマー部が第１プローブに組み込まれ、ユニバーサルリバースプライマー部が第２プローブに組み込まれ、ＰＣＲ増幅は、それぞれの対応するプライマー部とハイブリダイズする一組のユニバーサルプライマーを包含する。
いくつかの実施形態では、本教示は、連結アッセイにおいて連結特異性を判定する方法であって、該方法は、特異的ポジティブコントロール連結産物の量を非特異的ネガティブコントロール連結産物と比較する工程を包含し、特異的ポジティブコントロール連結産物は、第１のポジティブコントロールプローブを、単型性標的ポリヌクレオチド上にハイブリダイズさせた第２プローブと連結することにより得られ、非特異的ネガティブコントロール連結産物は、第１のネガティブコントロールプローブを、単型性標的ポリヌクレオチド上にハイブリダイズさせた第２プローブと連結することにより得られ、特異的連結産物の第１のポジティブコントロールプローブは、非特異的連結産物の第１のネガティブコントロールプローブとは識別領域のみが異なり、第１のポジティブコントロールプローブにより調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第１のネガティブコントロールプローブにより調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり；該方法は、特異的ポジティブコントロール連結産物の量と非特異的ネガティブコントロール連結産物の差を定量化する工程を包含し、それによって連結アッセイにおいて連結特異性を判定する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本教示の方法は、実験連結産物の量と特異的ポジティブコントロール連結産物の量および非特異的ネガティブコントロール連結産物の量とを比較する工程をさらに包含し、実験連結産物、特異的ポジティブコントロール連結産物、および非特異的ネガティブコントロール連結産物は同じ連結反応から得られ、それによって、連結アッセイにおいて実験連結産物の連結特異性を判定する工程をさらに包含する。
いくつかの実施形態では、並行連結アッセイにおいて特異的連結のばらつきが評価され、第１の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物の量と第２の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物を比較する工程が包含され、第１の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第２の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第１の反応の第１のポジティブコントロールプローブは、第２の反応の第１のポジティブコントロールプローブと相違せず、第１の反応の第２プローブは、第２の反応の第２プローブと相違せず、第１の反応においてポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応においてポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり；該方法は、第１の反応における特異的連結産物の量と第２の反応における特異的連結産物の量の差を定量化する工程が包含され、それによって、並行連結アッセイにおいて特異的連結のばらつきを評価する。
いくつかの実施形態では、第１の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、第１の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第２の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第１の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロールプローブセットのポジティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロールセットのポジティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第１の反応におけるポジティブコントロール第１プローブの同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第２の反応におけるポジティブコントロール第１プローブの同定部と同じである。
本教示のいくつかの実施形態では、各ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２を包含し、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２は各々、同定部を包含し、第１のポジティブコントロールプローブ１の同定部は、第１のポジティブプローブ２の同定部とは異なり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ１の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ１の同定部と同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ２の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ２の同定部と同じである。
いくつかの実施形態では、本教示は、並行連結アッセイにおいて非特異的連結のばらつきを評価する方法であって、該方法は、第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物の量と第２の反応おける非特異的ネガティブコントロール連結産物を比較する工程を包含し、第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第２の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第１の反応の第１のネガティブコントロールプローブは、第２の反応における第１のネガティブコントロールプローブとは相違せず、第１の反応の第２プローブは、第２の反応の第２プローブとは相違せず、第１の反応においてネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応においてネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり；該方法は、第１の反応における非特異的連結産物の量と第２の反応における非特異的連結産物の量の差を定量化する工程を包含し、それによって、連結アッセイにおける非特異的連結のばらつきを評価する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第２の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、第２の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第１の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロールプローブセットのネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロールセットのネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第１の反応におけるネガティブコントロール第１プローブの同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第２の反応におけるネガティブコントロール第１プローブの同定部と同じである。
いくつかの実施形態では、各ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２を包含し、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、第１のネガティブコントロールプローブ１の同定部は、第１のネガティブプローブ２の同定部とは異なり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ１の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ１の同定部と同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ２の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ２の同定部と同じである。
いくつかの実施形態では、本教示は、並行連結アッセイにおいて非特異的および特異的連結のばらつきを評価する方法であって、該方法は、第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物の量と第２の反応における特異的コントロール連結産物とを比較する工程を包含し、第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第２の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、第１の反応の第１のネガティブコントロールプローブは、第２の反応の第１のポジティブコントロールプローブとは識別領域が異なるだけであり、第１の反応の第２プローブは、第２の反応の第２プローブとは相違せず、第１の反応においてネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応においてポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり；該方法は、第１の反応における非特異的連結産物の量と第２の反応における特異的連結産物の量の差を定量化する工程を包含し、それによって、連結アッセイにおける特異的および非特異的連結のばらつきを評価する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第２の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、第１の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、第２の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロールプローブセットのネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロールセットのネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第１の反応におけるネガティブコントロール第１プローブの同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる第２の反応におけるポジティブコントロール第１プローブの同定部と同じである。
いくつかの実施形態では、第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２を包含し、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、第１のネガティブコントロールプローブ１の同定部は、第１のネガティブプローブ２の同定部とは異なり、第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２を包含し、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、ポジティブコントロール第１プローブ１の同定部は、第１のポジティブプローブ２の同定部とは異なり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ１の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ１の同定部と同じであり、第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロール第１プローブ２の同定部は、第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロール第１プローブ２の同定部と同じである。
いくつかの実施形態では、本教示は、ポジティブコントロールプローブセット、ネガティブコントロールプローブセット、実験プローブセット、およびそれらの組み合わせを包含する連結を評価するキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本教示は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含する連結を評価するキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本教示は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含する連結を評価するキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本教示のキットは、複数の単型性標的ポリヌクレオチド、複数の多型性標的ポリヌクレオチド、連結する手段、リン酸化する手段、増幅する手段、およびそれらの組み合わせをさらに包含する。
いくつかの実施形態では、本教示は、連結特異性を判定する方法であって、ハイブリダイズさせる工程と、連結する工程と、増幅する工程と、除去する工程と、分離する工程と、検出する工程と、比較する工程と、上記工程から連結特異性を判定する工程と、を包含する、方法を提供する。
例示的な実施形態の説明
本明細書中において用いる各セクションの見出しは、構成上の目的によるものであり、説明する主題を何ら限定するものではない。本願において引用する全ての文献および同様の資料は、特許文献、特許出願、記事、書籍、学術論文およびインターネット上のウェブページを含むがこれらに限定されるものではなく、その全てをあらゆる目的のために参考として援用することを明示しておく。援用した参考文献中の用語の定義は、本教示において提供する定義とは異なると思われる場合には、本教示中で提供する定義を優先するものとする。
前述した一般的な説明および以下の詳細な説明はともに例示および説明のためのものであり、本発明を制限するものではないことは言うまでもない。本願において、単数形を使用している場合、特に記載がない限り、複数形の場合も含む。例えば、「１つのプローブ」は、１つより多くのプローブが存在する可能性があることを意味し、例えば、特定のプローブ種について１つ以上のコピーが存在し、特定のプローブタイプについて１つ以上のバージョンが存在することを意味する。また、「または」を使用している場合、特に記載がない限り、「および／または」を意味する。同様に、「包含する」、「包含した」、「包含している」、「含む」、「含んだ」、および「含んでいる」は、限定を目的とするものではない。
基本定義
本明細書中において用いられるように、本教示の「プローブ」、「プライマー」、「標的」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸塩基配列」、および「オリゴマー」は、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つから構成することができ、一本鎖もしくは二本鎖であるか、または二本鎖および一本鎖配列の両方を部分的に適切に含有することができる。より詳細かつ非限定的な定義を以下に示す。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書中において用いられるように、下記で定義する以下の用語を総称するものである：ヌクレオチド塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドアナログ、伸張可能およびユニバーサルヌクレオチド。
「ヌクレオチド塩基」という用語は、本明細書中において用いるように、１つまたは複数の置換もしくは非置換の母体芳香族環を指す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、適切な相補的ヌクレオチド塩基とワトソンクリックおよび／またはフーグスティーン水素結合を形成してもよい。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ６−メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン（６ｓＧ）ヒポキサンチンおよびＯ６−メチルグアニン等のプリン類；７−デアザアデニン（７−デアザ−Ａ）および７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）等の７−デアザ−プリン類；シトシン（Ｃ）、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、チミン（Ｔ）、４−チオチミン（４ｓＴ）、５，６−ジヒドロチミン、Ｏ４−メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４−チオウラシル（４ｓＵ）および５，６−ジヒドロウラシル（ジヒドロウラシル；Ｄ）等のピリミジン類；ニトロインドールおよび４−メチルインドール等のインドール類；ニトロピロール等のピロール類；ネブラリン；塩基（Ｙ）等を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、ユニバーサルヌクレオチド塩基である。他の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５−３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．、および同文献において引用される参考文献に見られる。ユニバーサル塩基のさらなる例は、例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１，ｖｏｌ２９：２４３７−２４４７、およびＳｅｅｌａ Ｎ．Ａ．Ｒ．２０００，ｖｏｌ２８：３２２４−３２３２に見られる。
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書中において用いられるように、五炭糖のＣ−１’炭素と共有結合したヌクレオチド塩基を有する化合物を指す。いくつかの実施形態では、当該結合は、芳香族複素環窒素を介する。典型的な五炭糖としては、１つ以上の炭素原子が各々独立して１つ以上の同じまたは異なる−−Ｒ、−−ＯＲ、−−ＮＲＲまたはハロゲン基に置換され、各Ｒが独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールである五炭糖が挙げられるが、これらに限定されない。五炭糖は、飽和していても不飽和であってもよい。例示的な五炭糖およびそれらのアナログとしては、リボース、２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、および２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。また、例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０６７−７４）、２’−４’および３’−４’結合した二環式糖修飾ならびに他の「固定された」または「ＬＮＡ」二環式糖修飾（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）を参照されたい。「ＬＮＡ」または「固定された核酸」は、リボース環が２’−酸素と３’または４’−炭素のメチレン結合によって拘束されるように配座が固定されたＤＮＡアナログである。当該結合により課される配座制限は、相補的配列の結合親和力およびそのような二本鎖の熱安定性を増大させる場合が多い。
ポリヌクレオチド内の例示的なＬＮＡ糖アナログは以下の構造を含む：
Figure 2008504819
 但し、Ｂは任意の核酸塩基である。
糖は、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ等の２’または３’位に修飾を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ立体配置異性体（Ｄ型）、およびＬ立体配置異性体（Ｌ型）を含む（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。核酸塩基がプリン（例えばＡまたはＧ）である場合、リボース糖が核酸塩基のＮ９位に付着する。核酸塩基がピリミジン（例えばＣ、ＴまたはＵ）である場合、五炭糖が核酸塩基のＮ１位に付着する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄＥｄ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
ヌクレオシドの１つ以上のペントース炭素は、下記の式のリン酸エステルで置換されてもよい：
Figure 2008504819
 但し、αは０〜４の整数である。いくつかの実施形態では、αは２であり、リン酸エステルがペントースの３’または５’炭素に付着する。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基がプリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特異的ヌクレオチド塩基、またはそれらのアナログであるヌクレオシドである。
「ヌクレオチドアナログ」いとう用語は、本明細書中において用いられるように、五炭糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオシドのリン酸エステルのうちの１つ以上がそれぞれのアナログで置換され得る実施形態を指す。いくつかの実施形態では、例示的な五炭糖アナログは上記のものである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、上述したようなヌクレオチド塩基アナログを有する。いくつかの実施形態では、例示的なリン酸エステルアナログとして、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノフォスフェート等が挙げられるが、これらに限定されず、関連する対イオンを含んでもよい。他の核酸アナログおよび塩基は、例えば、挿入核酸（ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ，２００２に記載されるようなＩＮＡ）、およびイージス塩基（ＡＥＧＩＳ ｂａｓｅｓ）（Ｅｒａｇｅｎ、米国特許第５，４３２，２７２号）。各種の核酸アナログのさらなる説明は、例えば、（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５（１９９３）および同文献の参考文献）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１９１９８６））、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｉｏａｔｅ（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号でも見られる。他の核アナログは、ホスホロジチオエート類（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１ １：２３２１（１９８９）、０−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｏｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、陽性の骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７（１９９５）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号。Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９４）：Ｃｈａｑ．ｔｅｒｓ ２および３，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、および米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載のものを含む非リボース骨格を包含する。１つ以上の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６参照）。いくつかの核酸アナログもＲａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２，１９９７ ３５ページに記載されている。
「ユニバーサルヌクレオチド塩基」または「ユニバーサル塩基」という用語は、本明細書中において用いられるように、窒素原子を含有していても含有していなくてもよい芳香族環部分を指す。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、五炭糖のＣ−１’炭素に共有付着し、ユニバーサルヌクレオチドを形成してもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、他のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、最大で特定の標的ポリヌクレオチドの全てのヌクレオチド塩基まで、およびそれらを含むヌクレオチド塩基と水素結合する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、疎水性スタッキングにより、同じ核酸鎖上で隣接するヌクレオチド塩基と相互反応してもよい。ユニバーサルヌクレオチドとしては、デオキシ−７−アザインドールトリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシＩｍＰｙトリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰトリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、またはデオキシプロピニル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）を含むが、これらに限定されない。このようなユニバーサル塩基のさらなる例は、特に、米国特許出願第１０／２９０，６７２号の公開公報、および米国特許第６，４３３，１３４号で見られる。
本明細書中において用いられるように、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は相互互換的に用いられ、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連鎖（例えば、３’−５’および２’−５’）、逆結合（例えば、３’−３’および５’−５’）、分岐構造、またはヌクレオチド間アナログにより結合した、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋等の関連する対イオンを有する。ポリヌクレオチドは、全体がデオキシリボヌクレオチド、全体がリボヌクレオチド、またはそれらの異種混合体で構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログおよび／または糖アナログで構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、典型的には、例えば、当該分野でより一般的にオリゴヌクレオチドと称されることが多い、３〜４０の数モノマー単位から、数千のヌクレオチドモノマー単位までのサイズである。ポリヌクレオチド配列を表す場合には、特に記載しない限り、ヌクレオチドは、左から右に向かって、５’〜３’の順番であり、また特に記載しない限り、「Ａ」がデオキシアデノシン、「Ｃ」がデオキシシトシン、「Ｇ」がデオキシグアノシン、「Ｔ」がチミジンを示すと理解されたい。
本明細書中において用いられるように、「核酸塩基」は、核酸技術を利用するか、またはペプチド核酸技術を利用することにより、配列特異的に核酸と結合可能なポリマーを生成する当業者には一般に公知の天然型および非天然型複素環部分を意味する。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メトリルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が挙げられる。適切な核酸塩基の他の非限定的な例としては、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）および図２（Ｂ）に示す核酸塩基が挙げられる。
本明細書中において用いられるように、「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを包含するポリマーのあらゆる断片または２つ以上の断片の凝集体（例えば、２つ以上のオリゴマーブロックの凝集体核酸塩基配列）を意味する。適切なポリマーまたはポリマー断片の非限定的な例としては、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組み合わせオリゴマー、核酸アナログおよび／または核酸模倣物を含む。
本明細書中において用いられるように、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基サブユニットを包含する完全な単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の単一核酸鎖はポリ核酸塩基鎖である。
本明細書中において用いられるように、「核酸」は、ヌクレオチドまたはそのアナログから形成された骨格を有する核酸塩基配列含有ポリマーまたはポリマー断片である。好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡである。
本明細書中において用いられるように、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を包含するが核酸サブユニット（またはそれらのアナログ）を包含しないあらゆるオリゴマーまたはポリマー断片（例えば、ブロックオリゴマー）であって、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、および同第６，１０７，４７０号においてペプチド核酸として呼ばれるかまたは記載されるあらゆるオリゴマーまたはポリマー断片を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡという用語はまた、以下の出版物に記載の核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを包含するあらゆるオリゴマーまたはポリマー断片にも適用されるものとする：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示されるようなＳｈａｈらのペプチド系核酸模倣物（ＰＥＮＡＭ）。
いくつかの実施形態では、ＰＮＡは、米国特許出願第２００３／００７７６０８Ａ１号の第７６段落に見られる式の２つ以上の共有結合したサブユニットを包含するオリゴマーまたはポリマー断片であり、当該式において、各Ｊは同じであるかまたは異なっており、Ｈ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１ ２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。各Ｋは同じであるかまたは異なっており、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１からなる群から選択される。各Ｒ１は同じであるかまたは異なっており、ヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意で含有し得る１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。各Ａは、単結合、式中の−（ＣＪ２）ｓ−基、および式中の−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−基からなる群から選択される（ここで、Ｊは上記で定義したとおりであり、各ｓは１〜５の自然数である）。各ｔは１または２であり、各ｕは１または２である。各Ｌは同じであるかまたは異なっており、以下より独立して選択される：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、他の天然型核酸塩基アナログまたは他の非天然型核酸塩基。
他のいくつかの実施形態では、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合を介してＮ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素に付着した天然型または非天然型核酸塩基を包含しており、これは、現在最も一般的に用いられるペプチド核酸サブユニットの形態である。
本明細書中において用いられるように、「標的ポリヌクレオチド配列」は、判定されるべきポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。上記標的配列の性質は本発明を限定するものではないことは言うまでもない。上記標的配列を包含するポリ核酸塩基鎖は、あらゆる供給源から提供され得る。例えば、上記標的配列は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、核酸アナログまたは他の核酸模倣物の一部として存在してもよい。上記標的は、メチル化、非メチル化、またはその両方とすることができる。上記標的配列を含有する試料は、あらゆる供給源からのものであり、本教示を限定するものではない。さらに、「標的」とは、「標的ポリヌクレオチド配列」およびその代替物の両方を指し、例えば、連結産物、増幅産物、およびそれらにおいてコードされた配列とすることができることを理解されたい。
本明細書中において用いられるように、「プライマー部」という用語は、プライマーが当該分野で公知の種々のプライマーヌクレオチド伸張反応（例えば、ＰＣＲ）のいずれについてもアニーリングすることが可能なテンプレートとして直接またはそれを補うことで用いることが可能なポリヌクレオチド配列の領域を指す。当業者には、２つのプライマー部が単一のポリヌクレオチド（例えば、ＯＬＡ産物、ＰＣＲ産物等）上に存在する場合、当該２つのプライマー部の向きが一般に異なることが理解される。例えば、一方のＰＣＲプライマーは第１プライマー部と直接的にハイブリダイズすることが可能であり、他方のＰＣＲプライマーは第２プライマー部の相補体とハイブリダイズすることが可能である。換言すれば、第１プライマー部をセンス方向とし、第２プライマー部をアンチセンス方向とすることができる。また、本明細書中において用いられるような「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」プライマーおよびプライマー部は、一般に、特定のアッセイおよび宿主ゲノムを考慮して、当該アッセイの特異性を確保するためにできる限り固有のものとなるように選ばれる。しかしながら、当業者に理解されるように、異なる構成のプライマー部を用いることが可能であり、例えば、１回の反応において、第１プライマー部または一組の第１プライマー部を有する第１プローブを５００個、および第２プライマー部または一組の第２プライマー部を有する第２プローブをさらに５００個用いることが可能である。さらに、１回の反応における全ての標的について、ユニバーサルプライマー部の全てを同じにすることにより、例えば、単一の上流プライマーおよび単一の下流プライマーが全ての標的を増幅し、および／または単一のプライマーを上流および下流の両方のプライマーとして機能させ、全ての標的を増幅することができる。あるいは、「複数組の」ユニバーサル上流プライマー部および複数組のユニバーサル下流プライマー部を同時にまたは続けて用いることができる。いくつかの実施形態では、上記プライマー部の少なくとも１つは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ部位を包含するものとすることができる。
本明細書中において用いられるように、「フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）」および「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」は、標的上のプローブの相対的向きを示すために用いられ、一般に、標的ポリヌクレオチドの「最上部の」鎖の３’末端とハイブリダイズする５’〜３’に向かって「フォワード」に向けられたプライマー、および標的ポリヌクレオチドの最下部の鎖の３’末端とハイブリダイズする５’〜３’に向かって「リバース」に向けられたプライマーを指す。当業者に理解されるように、これらの用語は限定を目的とするものではなく、任意の実施形態において方向を例示するためのものである。
本明細書中において用いられるように、「試料」という用語は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列が由来する混合体を指し、そのような供給源は、原ウィルス（ｒａｗ ｖｉｒｕｓ）、原核生物、原生生物、真核生物、植物、菌類および動物を含むが、これらに限定されない。これらの試料源としては、全血、組織生検材料、リンパ液、骨髄、羊水、髪、皮膚、精液、細菌戦用液体、肛門分泌物、膣分泌物、汗、各種環境試料（例えば、農業用水および土）、一般の調査試料、一般の精製試料、および培養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の各種手順のいずれか、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＴＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ、およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＴＭ ６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号等を用いて試料から核酸を単離することが可能であることを理解されたい。機械力、超音波処理、制限酵素切断、または当該分野で公知のいずれかの方法を用いることを含めて、分析の前に核酸を切断またはせん断することが可能であることを理解されたい。
所与の標的ポリヌクレオチド配列を調べるためのプローブの選択、および所与の反応においてどの標的ポリヌクレオチド配列を採集するかの選択には、当該分野で一般に知られる手順を伴い、最小二次および三次構造を有する配列、ゲノムの他の領域との配列の重複が最も少ない標的、所望の熱力学的特性を有する標的領域、および目前の状況において望ましい他のパラメータについてアルゴリズムを選択して用いることが可能であることを理解されたい。いくつかの実施形態では、プローブは、副溝結合剤（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号参照）等の各種修飾物をさらに包含し、所望の熱力学的特性をさらに得ることができる。
本明細書中において用いられるように、「単型性標的ポリヌクレオチド配列」という用語は、反応時の配列のコピーの全てが同じ配列の核酸塩基を包含すると思われる核酸塩基配列を指す（すなわち、単型性標的ポリヌクレオチド配列はいずれの多型塩基も有さないと考えられる）。いくつかの実施形態では、単型性標的ポリヌクレオチド配列はゲノム遺伝子座を包含することが可能であるが、いずれの核酸塩基配列も単型性標的ポリヌクレオチド配列とすることが可能であることを理解されたい。単型性標的配列は以下のようにして得ることができる：数十の異なるゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）に対して、数千の推定（候補）ＳＮＰを配列することができる。いずれの多型性も示さない推定ＳＮＰ遺伝子座を、「偽」またはマイナー対立遺伝子頻度が低いと見なし、後に単型性標的ポリヌクレオチドとして用いることが可能である。このようにして作成された２つの試料配列は以下を含む：
ＰＣ１００４６８３（配列番号：１）
Figure 2008504819
 ＰＣ１００４７０６（配列番号：２）
Figure 2008504819
 本明細書中において用いられるように、「プローブセット」という用語は、共に所与の標的ポリヌクレオチド配列を調べる少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブを指す。
例えば、「ポジティブコントロールプローブセット」は、所与の単型性標的ポリヌクレオチド配列を調べることができる少なくとも１つのポジティブコントロール第１プローブおよび少なくとも１つのポジティブコントロール第２プローブを指し、所与のポジティブコントロールプローブセットのポジティブコントロール第１プローブは、それらの同定部のみが異なり、同じ標的特異部を包含する。プライマー部が存在する場合、いくつかの実施形態では、反応時の第１プローブの全てのプライマー部を同じにすることができ、反応時の第２プローブの全てのプライマー部を同じにすることができるが、必ずしもその必要がないことは言うまでもない。
例えば、「ネガティブコントロールプローブセット」は、所与の単型性標的ポリヌクレオチド配列を調べることができる少なくとも１つのネガティブコントロール第１プローブおよび少なくとも１つのネガティブコントロール第２プローブを包含し、所与のネガティブコントロールセットのネガティブコントロール第１プローブはそれらの同定部のみが異なり、同じ標的特異部を包含する。プライマー部が存在する場合、いくつかの実施形態では、反応時の第１プローブの全てのプライマー部を同じにすることができ、反応時の第２プローブの全てのプライマー部を同じにすることができるが、必ずしもその必要がないことは言うまでもない。
例えば、「実験プローブセット」は、所与の標的多型性標的ポリヌクレオチド配列を調べることができる少なくとも１つの実験第１プローブおよび少なくとも１つの実験第２プローブを包含し、所与の実験プローブセットの実験第１プローブは、標的特異部の識別領域および標的同定部が異なる。プライマー部が存在する場合、いくつかの実施形態では、反応時の第１プローブの全てのプライマー部を同じにすることができ、反応時の第２プローブの全てのプライマー部を同じにすることができるが、必ずしもその必要がないことは言うまでもない。
本明細書中において用いられるように、「第１プローブ」という用語は、一般に、第２プローブに隣接する標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能であり、一般に、識別領域、標的同定部および任意でプライマー部を包含する標的特異部を包含する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、「ポジティブコントロール第１プローブ」は、標的単型性標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。ポジティブコントロール第１プローブが、「ポジティブコントロール第２プローブ」と隣接および接触してハイブリダイズする場合、特異的連結を発生させることができる。１つより多くのポジティブコントロール第１プローブがセット内に存在する場合、ポジティブコントロール第１プローブは、それぞれ異なる同定部を有するようにすることができ、「ポジティブコントロール第１プローブ１、ポジティブコントロール第１プローブ２等と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「ネガティブコントロール第１プローブ」は、標的単型性標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。ネガティブコントロール第１プローブが、「ネガティブコントロール第２プローブ」と隣接および接触してハイブリダイズする場合、特異的連結は発生しないが、非特異的連結を発生させることができる。１つより多くのネガティブコントロール第１プローブがセット内に存在する場合、ネガティブコントロール第１プローブは、それぞれ異なる同定部を有するようにすることができ、ネガティブコントロール第１プローブ１、ネガティブコントロール第１プローブ２等と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「実験第１プローブ」は、標的多型性標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。実験第１プローブが「実験第２プローブ」と隣接および接触してハイブリダイズする場合、特異的連結を発生させることができる。１つより多くの実験第１プローブがセット内に存在する場合、実験第１プローブは、それらの識別ヌクレオチドおよび同定部が異なり、実験第１プローブ１、実験第１プローブ２等と呼ばれる。いくつかの実施形態では、第１プローブは第２プローブの５’（すなわち、上流）に位置し、第１プローブおよび第２プローブは同じ標的ポリヌクレオチド配列の隣接する領域とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１プローブは、反応時に第２プローブが存在しない標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能であり、例えば、コントロール第１プローブは、隣接する第２コントロールプローブとハイブリダイズする必要はないが、その場合でも、コントロール第１プローブと見なす。「上流」および「下流」という用語は、本教示の特定の実施形態を考慮して、読者に位置を確認させるための用語であり、例えば、標的の５’から３’に向かう方向が入れ替わった場合、例えば、第１プローブは、第２プローブの３’（すなわち、下流）に位置することとなるが、このようなことは本教示により明確に企図されることを理解されたい。さらに、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖であってもよいことを理解されたい。本明細書中において用いられるように、所与のプローブの同定部は、例えば、「Ａ」または「Ｂ」というように大文字で示すが、これは、当該プローブの同定部が識別可能であるとともに相互に異なることを示すためのものである。
本明細書中において用いられるように、「第２プローブ」という用語は、一般に、第１プローブに隣接する標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能であり、一般に、標的特異部および任意でプライマー部を包含する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書中において用いられるように、「同じ」という用語は、同じ分子ではなく、同じ核酸塩基配列を意味するものと認識されたい。例えば、本教示の標的ポリヌクレオチド配列は、所与の反応時に多数のコピーに存在させることが可能であることを理解されたい。この文脈における同じ配列とは、核酸塩基の同じ分子ではなく、同じ配列を指す。
本明細書中において用いられるように、「またはそれらの組み合わせ」という用語は、当該用語の前に列挙された項目の並べ替えおよび組み合わせの全てを意味する。例えば、「Ｘ、Ｙ、Ｚ、またはそれらの組み合わせ」は、以下のうちの少なくとも１つを含むことを意味する：Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＸＹ、ＸＺ、ＹＺ、またはＸＹＺ、特定の文脈において順序が重要な場合には、ＹＸ、ＺＸ、ＺＹ、ＺＹＸ、ＹＺＸ、またはＺＸＹ。この例をさらに続けると、明らかに含まれるのは、ＹＹ、ＸＸＸ、ＸＸＹ、ＹＹＺ、ＸＸＸＹＺＺＺＺ、ＺＹＹＸＸＸ、ＺＸＹＸＹＹ等１つ以上の項目または項の繰り返しを有する組み合わせである。当業者は、文脈から明白でない限り、典型的には、いずれの組み合わせにおいても項目または項の数は制限されないことを理解する。
本明細書中において用いられるように、「標的特異部」という用語は、プローブの標的ポリヌクレオチド配列と実質的に相補的な部分を指し、識別領域をさらに包含する場合もある。
本明細書中において用いられる「対応する」という用語は、当該用語が指す要素間の少なくとも１つの特異的関係を指す。例えば、プローブセットの少なくとも１つの第１プローブは、同じプローブセットの少なくとも１つの第２プローブに対応し、その逆の場合も同様である。少なくとも１つのプライマーは、少なくとも１つの対応するプローブ、少なくとも１つの対応する連結産物、少なくとも１つの対応する増幅連結産物、またはそれらの組み合わせのプライマー部とアニーリングするように設計される。特定のプローブセットのプローブの標的特異部は、対応する標的ポリヌクレオチド配列の相補的または実質的に相補的な領域とハイブリダイズするように設計することが可能である。特定の親和部分は、対応する親和部分結合剤と結合することが可能であり、例えば、親和部分ビオチンと結合する親和部分結合剤ストレプトアビジンが挙げられるが、これに限定されない。特定の移動度プローブは、対応する同定部分または同定部相補体とハイブリダイズすることが可能である。特定の識別領域は、例えば、標的ポリヌクレオチド上の対応する１つまたは複数のヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。
本明細書中において用いられるように、「接触する」という用語は、少なくとも２つの隣接してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端核酸塩基間に間隙がないため、当該少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが相互に触れ合って、潜在的に連結に適している状態を指す。
本明細書中において用いられるように、「併発反応」という用語は、一般に、ほぼ同時に異なる反応槽内で発生する少なくとも２つの反応を指す。例えば、マイクロタイタープレート内の２つの異なるウェルは併発反応を包含するが、併発反応が発生する時間および／または器具もしくは地理的場所が異なる可能性があるが、そのような場合も本教示の目的の併発反応とみなされるものと理解されたい。
本明細書中において用いられるように、「識別領域」という用語は、一般に、標的ポリヌクレオチド配列の対応する領域と相補的とすることができるかまたはそうできない第１プローブの標的特異部の領域を指す。いくつかの実施形態では、識別ヌクレオチドは、第１プローブの標的特異部の３’末端に位置するが、識別領域が第１プローブの他の領域にも同様に位置させることが可能であることを理解されたい。識別領域は、１つの単一ヌクレオチド、または１つより多くの単一ヌクレオチドを指すことが可能であることを理解されたい。ポジティブコントロール第１プローブの場合、識別領域は、一般に、単型性標的ポリヌクレオチドと相補的である。ネガティブコントロール第１プローブの場合、識別領域は、一般に、単型性標的ポリヌクレオチドとは相補的ではない。実験第１プローブの場合、第１プローブの識別領域は、一般に、異なる種類の多型性標的ポリヌクレオチドを調べる。さらに、実験第１プローブの場合、第１プローブの識別領域１は、第１プローブ２の識別領域とは異なり、これらは、第１プローブ１の「識別領域１」、および第１プローブ２の「識別領域２」と示すことができる。
本明細書中において用いられるように、「多型性標的ポリヌクレオチド配列」という用語は、潜在的に、少なくとも１つの核酸塩基変異型配列を包含すると思われる核酸塩基配列を指す（すなわち、多型性標的ポリヌクレオチド配列は、潜在的に、少なくとも１つの多型性核酸塩基を包含すると考えられる）。いくつかの実施形態では、多型性標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム遺伝子座を包含してもよく、変異型核酸塩基がＳＮＰ遺伝子座の特定の対立遺伝子変異型に対応することにより、ヘテロ接合多型性標的ポリヌクレオチド配列となるが、核酸塩基配列のいずれの変異型も多型性標的ポリヌクレオチド配列を提供することが可能であることを理解されたい。さらに、推定核酸塩基変異型は、例えば、同型接合体と同様に変化する必要がないことを理解されたい。本教示の多型性標的ポリヌクレオチドは、メチル化核酸、および任意で、亜硫酸水素で処理された核酸を包含するものとすることができ、非メチル化シトシンがチミンに変換されることを理解されたい。さらに、本教示の標的多型性標的ポリヌクレオチドは、所与の遺伝子の各種スプライス変異型を含む、ｍＲＮＡおよび／またはそのｃＤＮＡの変形をさらに包含するものとすることができる。
本明細書中において用いられるように、「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」という用語は相互互換的に用いられ、二本鎖、三本鎖、または他の高次構造を形成する１つの核酸と他の核酸との相補的塩基対合相互作用を意味する。いくつかの実施形態では、一次相互作用は塩基特異的であり、例えば、ワトソン／クリックおよびフーグスティーン型水素結合によるＡ／ＴおよびＧ／Ｃが挙げられる。いくつかの実施形態では、塩基の積み重ねおよび疎水性相互作用もまた、二本鎖の安定性に寄与し得る。核酸プローブおよびプライマーを相補的および実質的に相補的な標的配列とハイブリダイズするための条件は周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＪ．ＷｅｔｍｕｒおよびＮ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９以降（１９６８）に記載されている。一般に、このようなアニーリングが発生するか否かは、特に、プローブおよび相補的な標的配列の長さ、ｐＨ、温度、一価および二価陽イオンの有無、ハイブリダイゼーション領域におけるＧヌクレオチドとＣヌクレオチドの割合、媒体の粘度、および変性剤の有無によって影響される。このような可変条件は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を与える。よって、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存する。そのような条件は、しかしながら、通常、当業者が過度の実験を行なうことなく決定することができる。さらに、本教示のプローブおよびプライマーは、一般に、標的とプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションが生じるように、標的配列と相補的となるように設計される。しかしながら、この相補性は完全でなくてもよく、本教示の標的配列と一本鎖核酸のハイブリダイゼーションを妨げる塩基対の不一致がいくつか存在する可能性があることを理解されたい。しかしながら、塩基対の不一致数が多いため最も緩いハイブリダイゼーション条件下でさえハイブリダイゼーションが起こらない場合、該配列は相補的な標的配列ではない。よって、本明細書中において「実質的に相補的」とは、プローブまたはプライマーが標的配列と十分に相補的であり、選択された反応条件下でハイブリダイズすることを意味する。
本明細書中において用いられるように、「標識」という用語は、オリゴヌクレオチド、移動度プローブに付着できるか、または付着できない場合にはレポーター系に用いることができ、分子をある器具または方法により検出可能にすることが可能な検出可能部分を指す。例えば、標識は、以下のいずれかの部分とすることが可能である：（ｉ）検出可能信号を与える部分；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第１または第２の標識により与えられる検出可能信号を変更する部分；または（ｉｉｉ）捕獲機能、例えば、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン錯体生成機能を与える部分。当業者は、本教示において、多くの異なる種のレポーター標識を単独または１つ以上の異なる標識と組み合わせて用いることができることを理解する。例示的な標識としては、蛍光プローブ、放射性同位体、量子ドット、色原体、酵素、エピトープタグを含むがこれに限定されない抗原、重金属、色素、リン光基、化学発光基、電気化学検出部分、親和タグ、結合タンパク質、リン光体、希土類キレート、「Ｃｙ．７．ＳＰｈ．ＮＣＳ」、「Ｃｙ．７．ＯｐｈＥｔ．ＮＣＳ」、「Ｃｙ７．ＯｐｈＥｔ．ＣＯ２Ｓｕ」、およびＩＲＤ８００（例えば、Ｊ．Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：７５１−５６（１９９７）、およびＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＩＲＤ８００ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ，ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃１１１，ＬＩ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ参照）を含むがこれらに限定されない近赤外色素、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋としても知られるトリス（ビピリダル）ルテニウム（ＩＩ）、Ｏｓ（フェン）２（ｄｐｐｅｎｅ）２＋としても知られるＯｓ（１，１０−フェナンスロリン）２ビス（ジフェニルフォスフィノ）エタン２＋、過酸化ルミノール／水素、Ａｌ（ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸）、９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホン酸塩、およびＲｕ（ｖ−ｂｐｙ３ ２＋）としても知られるトリス（４−ビニル−４’−メチル−２，２’−ビピ−リダル）ルテニウム（ＩＩ）を含むがこれらに限定されない電気化学発光標識等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＥＣＬおよび電気化学発光部分の詳細な説明は、特に、Ａ．ＢａｒｄおよびＬ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００１）；Ｍ．ＣｏｌｌｉｎｓｏｎおよびＭ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２５７６以降（１９９３）；Ｄ．ＢｒｕｎｃｅおよびＭ．Ｒｉｃｈｔｅｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：３１５７以降（２００２）；Ａ．Ｋｎｉｇｈｔ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１８：４７以降（１９９９）；Ｂ．Ｍｕｅｇｇｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：１１０２以降（２００３）；Ｈ．Ａｂｒｕｎｄａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：２６４１以降（１９８２）；Ｋ．Ｍａｎｅｓｓら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１０６０９以降（１９９６）；Ｍ．ＣｏｌｌｉｎｓｏｎおよびＲ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１８８３以降（１９９５）；および米国特許第６．４７９，２３３号において見られる。
本明細書中において用いられるように、「蛍光プローブ」という用語は、第１の波長の光を吸収し、吸収が発生したことに応じて第２の波長の蛍光を発する共鳴非局在化系または芳香族環系を包含する標識を指す。当該分野では、そのような色素分子は数多く知られている。例えば、蛍光色素は、キサンテン類、ローダミン類、フルオレセイン類、シアニン類、フタロシアニン類、スクアレン類、およびｂｏｄｉｐｙ色素等、各種の蛍光化合物のいずれからも選択することが可能である。いくつかの実施形態では、当該色素は、以下の形態の縮合三環系を含有するキサンテン型色素を包含する：
Figure 2008504819
 この母体キサンテン環は非置換であってもよく（すなわち、全ての置換基がＨである）、あるいは後述するような各種の同じまたは異なる置換基のうちの１つ以上と置換することも可能である。いくつかの実施形態では、当該色素は、以下の一般構造を有する母体キサンテン環を含有する：
Figure 2008504819
 上に示した母体キサンテン環では、Ａ１はＯＨまたはＮＨ２であり、Ａ２はＯまたはＮＨ２ ＋である。Ａ１がＯＨであり、Ａ２がＯである場合、母体キサンテン環はフルオレセイン型キサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、Ａ２がＮＨ２ ＋である場合、母体キサンテン環はローダミン型キサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、Ａ２がＯである場合、母体キサンテン環はロードル型キサンテン環（ｒｈｏｄｏｌ−ｔｙｐｅ ｘａｎｔｈｅｎｅ ｒｉｎｇ）である。上に示した母体キサンテン環では、Ａ１およびＡ２（存在する場合）の一方または両方の窒素および／またはＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９位の炭素原子のうちの１つ以上を、多種多様な同じまたは異なる置換基と独立して置換することができる。いくつかの実施形態では、典型的な置換基として、−Ｘ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ、ペルハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＸ３、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲおよび−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（但し、各Ｘは独立してハロゲン（好ましくは、−ＦまたはＣｌ）であり、各Ｒは独立して水素である）、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリールアリール、ヘテロアリール、６〜２６員ヘテロアリールアルキル５〜２０員ヘテロアリール−ヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、リン酸塩、またはホスホン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｃ１およびＣ２置換基および／またはＣ７およびＣ８置換基は、これらを組み合わせて、置換または非置換ブタ［１，３］ジエノまたは（Ｃ５〜Ｃ２０）アリレノブリッジを形成することが可能である。一般に、母体キサンテン環の蛍光を消光する傾向がない置換基が好ましいが、いくつかの実施形態では、消光置換基が望ましい場合がある。母体キサンテン環の蛍光を消光する傾向がある置換基は、−ＮＯ２、−Ｂｒ、および−Ｉ等の電子求引性基である。いくつかの実施形態では、Ｃ９は非置換である。いくつかの実施形態では、Ｃ９はフェニル基と置換される。いくつかの実施形態では、Ｃ９はフェニル以外の置換基と置換される。Ａ１がＮＨ２であり、および／またはＡ２がＮＨ２ ＋である場合、これらの窒素は、例えば、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジイル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレノ、２〜１２員ヘテロアルキルジイルおよび／または２〜１２員ヘテロアルキレノブリッジ等の同じ窒素原子または隣接する炭素原子を伴う１つ以上のブリッジに含まれ得る。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９炭素および／またはＣ３および／またはＣ６（存在する場合）の窒素原子上の置換基のいずれもが、同じまたは異なる置換基の１つ以上とさらに置換することが可能であり、それらの置換基は、典型的には、−Ｘ、−Ｒ’、＝Ｏ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、＝Ｓ、−ＮＲ’Ｒ’、＝ＮＲ’、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＨＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’（ここで、各Ｘは独立してハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、各Ｒ’は独立して水素である）、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、２〜６員ヘテロアルキル、（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールまたはヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、リン酸塩、またはホスホン酸塩から選択される。
例示的な母体キサンテン環としては、ローダミン型母体キサンテン環およびフルオレセイン型母体キサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施形態では、上記色素は、以下の環系を含むローダミン型キサンテン色素を含有する：
Figure 2008504819
 上に示したローダミン型キサンテン環では、一方または両方の窒素および／またはＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７もしくはＣ８に位置する炭素のうちの１つ以上が、例えば、母体キサンテン環について上述したような多種多様な同じまたは異なる置換基と独立して置換することが可能である。Ｃ９は、水素、またはオルトカルボキシシフェニルもしくはオルト（スルホン酸）フェニル基等の他の置換基と置換しもよい。例示的なローダミン型キサンテン色素としては、米国特許第５，９３６，０８７号、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号、同第５，８４７，１６２号、同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／３６９６０およびＷＯ９９／２７０２０、Ｓａｕｅｒら、Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）：２４７−２６１（１９９５）、Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ、Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９３）、およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２４７１−２４８３（１９９２）に記載のローダミン色素のキサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。「ローダミン型キサンテン環」の定義に含まれるものとしては、１９９９年６月３日に出願された米国特許出願第０９／３２５，２４３号に記載の拡張ローダミン色素の拡張共役キサンテン環もある。
いくつかの実施形態では、上記色素は、下記の構造を有するフルオレセイン型母体キサンテン環を包含する：
Figure 2008504819
 上に示したフルオレセイン型母体キサンテン環では、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９に位置する炭素のうちの１つ以上が、母体キサンテン環について上述したような多種多様な同じまたは異なる置換基と独立して置換することが可能である。Ｃ９は、水素、またはオルトカルボキシシフェニルもしくはオルト（スルホン酸）フェニル基等の他の置換基と置換してもよい。例示的なフルオレセイン型母体キサンテン環としては、米国特許第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、同第５，０６６，５８０号（Ｌｅｅ）、同第５，１８８，９３４号、同第５，６５４，４４２号、同第５，８４０，９９９号、ＷＯ９９／１６８３２、およびＥＰ０５０６８４に記載のフルオレセイン色素のキサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。「フルオレセイン型母体キサンテン環」の定義に含まれるものとしては、米国特許第５，７５０，４０９号および同第５，０６６，５８０号に記載のフルオレセイン色素の拡張キサンテン環もある。
いくつかの実施形態では、上記色素は、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）と置換されるローダミン型キサンテン環を包含するローダミン色素を包含する。本明細書中では、このような化合物をオルトカルボキシシフルオレセインとも呼ぶ。いくつかの実施形態では、ローダミン色素のサブセットは、４，７，−ジクロロローダミンである。典型的なローダミン色素としては、ローダミンＢ、５−カルボキシローダミン、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、４，７−ジクロロローダミンＸ（ｄＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミン６Ｇ、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、４，７−ジクロロローダミン１１０（ｄＲ１１０）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および４，７−ジクロロ−テトラメチルローダミン（ｄＴＡＭＲＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ローダミン色素は、さらに、例えば、米国特許第５，３６６，８６０号（Ｂｅｒｇｏｔら）、同第５，８４７，１６２号（Ｌｅｅら）、同第６，０１７，７１２号（Ｌｅｅら）、同第６，０２５，５０５号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）、同第５，９３６，０８７号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，１１１，１１６号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，０５１，７１９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号、同第５，８４７，１６２号、米国特許第６，２４８，８８４号（Ｌａｍら）、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／３６９６０およびＷＯ９９／２７０２０、Ｓａｕｅｒら、１９９５，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）：２４７−２６１、Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ、１９９３，Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（１０）：２４７１−２４８３（１９９２）、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２８１６−２８２２（１９９７）、ならびにＲｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４５００−４５０４（１９９７）において見ることができる。いくつかの実施形態では、上記色素は、４，７−ジクロロ−オルトカルボキシシローダミンを包含する。いくつかの実施形態では、上記色素は、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）と置換されるフルオレセイン型キサンテン環を包含するフルオレセイン色素を包含する。フルオレセイン型色素の１つの典型的なサブセットは、４，７，−ジクロロフルオレセインである。典型的なフルオレセイン色素としては、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的なフルオレセイン色素は、さらに、例えば、米国特許第５，７５０，４０９号、同第５，０６６，５８０号、同第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、同第５，０６６，５８０号（Ｌｅｅ）、同第５，１８８，９３４号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第５，６５４，４４２号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第６，００８，３７９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第５，８４０，９９９号、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／１６８３２、ならびにＥＰＯ公報０５０６８４において見ることができる。いくつかの実施形態では、上記色素は、４，７−ジクロロ−オルトカルボキシシフルオレセインを包含する。いくつかの実施形態では、上記色素は、以下の参考文献および同文献において引用される参考文献に記載されるようなシアニン、フタロシアニン、スクアレン、またはｂｏｄｉｐｙ色素とすることができる：特許第５，８６３，７２７号（Ｌｅｅら）、同第５，８００，９９６号（Ｌｅｅら）、同第５，９４５，５２６号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅら）、同第５，４３６，１３４号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、米国特許第５，８６３，７５３号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、同第６，００５，１１３号（Ｗｕら）、およびＷＯ９６／０４４０５（Ｇｌａｚｅｒら）。
本明細書中において用いられるように、「同定部」という用語は、特定のプローブ種および標的ポリヌクレオチドを同定するために用いることが可能な１つまたは複数の部分を指し、例えば、標識、ジップコード、移動度修飾因子、公知の数の核酸塩基、およびそれらの組み合わせを含む各種の識別可能な部分を指す場合がある。いくつかの実施形態では、同定部は、結合する要素を分離すること（バルク分離を含むがこれに限定されない）；結合する要素を基質に繋げるかまたは付着すること（分離を含んでも含まなくてもよい）；移動度修飾因子、１つ以上の標識、およびそれらの組み合わせ等、少なくとも１つの部分を包含し得る同定部相補体をアニーリングすることに用いることができるオリゴヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、同じ同定部が、多数の異なる要素とともに用いて以下を行なう：バルク分離、基質付着、およびそれらの組み合わせ。「同定部相補体」という用語は、典型的には、対応する同定部と少なくとも実質的に相補的であり、かつハイブリダイズする核酸塩基の少なくとも１つの配列を包含する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、同定部相補体は、少なくとも１つの同定部分元素錯体を少なくとも１つの基質に付着する捕獲部分として作用するか、またはバルク分離手順のための「引き抜き（ｐｕｌｌ−ｏｕｔ）」配列として作用し、あるいは捕獲部分および引き抜き配列の両方として作用する（例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌら、米国特許第６，６３８，７６０号、同第６，５１４，６９９号、同第６，１４６，５１１号、および同第６，１２４，０９２号参照）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部相補体は、少なくとも１つのレポーター基を包含し、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、およびそれらの組み合わせのための標識として作用する。いくつかの実施形態では、判定する工程が、少なくとも１つの同定部相補体上の１つ以上のレポーター基の検出を包含する。
典型的には、同定部およびそれらの対応する同定部相補体は、以下を最小限に抑えるために選択される：内部的な自己ハイブリダイゼーション；異なる同定部種、ｇＤＮＡを含むがこれに限定されない反応組成物内のヌクレオチド配列、異なる種の同定部相補体またはプローブの標的特異部等との交差ハイブリダイゼーション；しかしながら、同定部とその対応する同定部相補体との間のハイブリダイゼーションを容易にするものでなければならない。同定部配列および同定部相補体配列は、任意の適切な方法によって選択することが可能であり、当該方法は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１２０１４号およびＷＯ９６／４１０１１号ならびに欧州特許公報ＥＰ７９９，８９７号に記載のコンピュータアルゴリズム；ならびにＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６０−６５（１９９８））のアルゴリズムおよびパラメータ等を含むが、これらに限定されない。同定部の説明は、特に、米国特許第６，３０９，８２９号（同文献では「タグセグメント（ｔａｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）」と呼ばれる）；同第６，４５１，５２５号（同文献では「タグセグメント（ｔａｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）」と呼ばれる）；同第６，３０９，８２９号（同文献では「タグセグメント（ｔａｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）」と呼ばれる）；同第５，９８１，１７６号（同文献では「グリッドオリゴヌクレオチド（ｇｒｉｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と呼ばれる）；同第５，９３５，７９３号（同文献では「同定タグ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ｔａｇｓ）」と呼ばれる）；およびＰＣＴ公報ＷＯ０１／９２５７９号（同文献では「アドレス可能支持体特異的配列（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｓｕｐｐｏｒｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」と呼ばれる）で見ることができる。
同定部は、少なくとも１つのプローブの少なくとも１つの端部、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、およびそれらの組み合わせ上に配置することが可能であり、あるいは内部に配置することも可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部は、少なくとも１つのリンカーアームを介して、少なくとも１つのプローブ、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、およびそれらの組み合わせに付着される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーアームは切断可能である。いくつかの実施形態では、上記同定部は、第１プローブの同定部上に位置する。
いくつかの実施形態では、同定部の長さは、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、１２〜６０塩基、または１５〜３０塩基である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部は、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、または６０塩基の長さである。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの同定部：同定部相補体二本鎖の融解温度は、相互にわずか１０℃以内の範囲ΔＴｍ（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）内にある。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの同定部：同定部相補体二本鎖の融解温度は、相互に５℃以下の範囲ΔＴｍ内にある。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの同定部：同定部相補体二本鎖の融解温度は、相互に２℃以下の範囲ΔＴｍ内にある。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部または少なくとも１つの同定部相補体は、結合する要素を、連結反応組成物、消化反応組成物、増幅連結反応組成物等のうちの少なくとも１つの成分から分離するために用いられる。いくつかの実施形態では、同定部は、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、またはそれらの組み合わせを、少なくとも１つの基質に付着するために用いられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、またはそれらの組み合わせは、同じ同定部を包含する。分離法の例としては、同じ同定部相補体を用いて多数の異なる要素：同定部種を分離すること、多数の異なる要素：同定部種を同じ同定部相補体を包含する基質に繋げるか、またはそれらの両方が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部相補体は、少なくとも１つの標識、少なくとも１つの移動度修飾因子、少なくとも１つの標識結合部、またはそれらの組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの同定部相補体は、少なくとも１つの対応する同定部にアニーリングされ、続いて、その同定部相補体の少なくとも一部が放出され検出される。
本明細書中において用いられるような「移動度修飾因子」という用語は、少なくとも１つの分子的実体を指し、例えば、少なくとも１つの要素（例えば、少なくとも１つのプローブ、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、少なくとも１つの移動度プローブ、またはそれらの組み合わせ）に加えられたときに、少なくとも１つの移動度依存分析技術において、共有または非共有でハイブリダイズまたは結合する要素の移動度に影響を与える少なくとも１つのポリマー鎖が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、移動度修飾因子は、当該要素とハイブリダイズまたは結合すると、電荷／並進摩擦抗力を変化させるか、または対応する要素とハイブリダイズまたは結合すると、例えば、クロマトグラフ分離媒体内での顕著な溶出特性またはふるいマトリックスまたは非ふるいマトリックスでの顕著な電気泳動移動度等を含むが、これらに限定されない特有の移動度を与えるか、あるいはそれらの両方を行なう（例えば、米国特許第５，４７０，７０５号および同第５，５１４，５４３号参照）。いくつかの実施形態では、移動度修飾因子を除く多数のプローブ、移動度修飾因子を除く多数のプライマー、移動度修飾因子を除く多数の連結産物、移動度修飾因子を除く多数の連結産物代替物、またはそれらの組み合わせは、少なくとも１つの移動度依存分析技術において、同じまたは実質的に同じ移動度を有する。各種の移動度度修飾因子の例については、例えば、米国特許第６，３９５，４８６号、同第６，３５８，３８５号、同第６，３５５，７０９号、同第５，９１６，４２６号、同第５，８０７，６８２号、同第５，７７７，０９６号、同第５，７０３，２２２号、同第５，５５６，７２９２号、同第５，５６７，２９２号、同第５，５５２，０２８号、同第５，４７０，７０５号、およびＢａｒｂｉｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４：１：５１−５７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、多数のプローブ、多数のプライマー、多数の連結産物、多数の連結産物代替物、またはそれらの組み合わせは、実質的に同様の顕著な移動度を有し、例えば、移動度修飾因子を包含する多数の要素が実質的に同様の顕著な移動度を有する場合、それらをバルク分離するか、または異なる顕著な移動度を有する移動度修飾因子を包含する他の要素から分離することが可能であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、移動度修飾因子を包含する多数のプローブ、移動度修飾因子を包含する多数のプライマー、移動度修飾因子を包含する多数の連結産物、移動度修飾因子を包含する多数の連結産物代替物、少なくとも１つの移動度プローブ、またはそれらの組み合わせは、異なる顕著な移動度を有する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの移動度修飾因子は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドポリマー鎖、少なくとも１つのポリヌクレオチドポリマー鎖、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドポリマー鎖および少なくとも１つのポリヌクレオチドポリマー鎖の両方を含むがこれらに限定されない少なくとも１つのヌクレオチドポリマー鎖を包含する（例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９６１５２７１Ａ１、および既知の数のヌクレオチドを用いて連結産物に移動度を与える例に関しては、Ｋｅｙｇｅｎｅ ＳＮＰＷａｖｅ（登録商標）の製品関連試料を参照）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの移動度修飾因子は、少なくとも１つの非ヌクレオチドポリマー鎖を包含する。例示的な非ヌクレオチドポリマー鎖としては、ペプチド、ポリペプチド、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマー鎖は、ＰＥＯ単位からなる鎖等の少なくとも１つの実質的に非荷電性の溶性鎖；ポリペプチド鎖；またはそれらの組み合わせを包含する。
上記ポリマー鎖は、ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、またはそれらの組み合わせを包含するものとすることができる。さらに、上記ポリマー鎖は、直線構造、櫛型構造、分岐構造、樹枝状構造（例えば、ポリアミドアミン分岐ポリマーを含有するポリマー、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ）、またはそれらの組み合わせを有してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマー鎖は親水性であるか、またはある要素とハイブリダイズまたは結合したときに少なくとも十分に親水性となることにより、確実に当該要素の移動度修飾因子を水媒体内で容易に溶解させることができる。移動度依存分析技術が電気泳動である場合、いくつかの実施形態では、上記ポリマー鎖は非荷電性であるか、または対応する要素よりも実質的に低い電荷／サブユニット密度を有する。
移動度修飾因子として有用なポリマー鎖の合成は、少なくとも部分的に、ポリマーの性質に依存する。適切なポリマーを調製する方法は、一般に、周知のポリマーサブユニット合成方法に従う。直接または荷電性もしくは非荷電性結合基を介して規定サイズのマルチサブユニットポリマー単位を相互に連結することを伴うこれらの方法は、一般に、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリウレタンポリマー、ポリペプチド、オリゴ糖、およびヌクレオチドポリマー等の多種多様なポリマーに適用可能である。このようなポリマー単位の連結方法はまた、例えば、ポリエチレンオキシド単位がポリプロピレン単位と交互するコポリマー等の選択された長さのコポリマーの合成にも適する。選択された長さのポリペプチド、およびホモポリマーまたは混合ポリマーのいずれかであるアミノ酸組成物は、標準的な固相法により合成することが可能である（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４（１９９０））。
選択された数のヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）単位を有するＰＥＯポリマー鎖を調製するための１つの方法、ＨＥＯ単位は、一端がジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護され、他端がメタンスルホン酸塩で活性化される。活性化されたＨＥＯは、次いで、第２のＤＭＴ保護ＨＥＯ基と反応し、ＤＭＴ保護ＨＥＯ二量体を形成する。この単位の追加は、所望のＰＥＯ鎖長が得られるまで続けて行なわれる（例えば、米国特許第４，９１４，２１０号；また、米国特許第５，７７７，０９６号も参照）。
本明細書中において用いられるように、「移動度プローブ」は、一般に、移動度修飾因子、標識、および連結産物または連結産物代替物とハイブリダイズすることが可能な同定部または同定部相補体を包含する分子を指し、これを検出することにより、標的ポリヌクレオチドを示すことが可能になる。
本明細書中において用いられるような「移動度依存分析技術」という用語は、本明細書中において用いられるように、１つ以上の分離技術において、異なる分子種の移動率の差に基づいて異なる分子種を分離するあらゆる手段を指す。例示的な移動度依存分析技術としては、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー、質量分光学、沈殿、例えば、勾配遠心沈殿、流動分別、多段階抽出技術等が挙げられる。移動度依存分析技術の説明は、特に、米国特許第５，４７０，７０５号、同第５，５１４，５４３号、同第５，５８０，７３２号，同第５，６２４，８００号、同第５，８０７，６８２号、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／９２５７９号、Ｆｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４：１：９６−１００、Ｄ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５），Ｂｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｍ．Ａ．Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．（２００３）；およびＡ．Ｐｉｎｇｏｕｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（２００２）において見ることができる。
本明細書中において用いられるように、本発明による「連結剤」という用語は、任意の数の酵素または非酵素試薬を包含し得る。例えば、リガーゼは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはハイブリッド内において、適切な条件下で、隣接するヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸塩との間にホスホジエステル結合を形成する酵素連結試薬である。例えば、温度感受性リガーゼとして、バクテリオファージＴ４リガーゼおよび大腸菌リガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼとしては、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、ＴｔｈＨＢ８リガーゼ、サーマス種ＡＫ１６ＤリガーゼおよびＰｆｕリガーゼ（例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ００／２６３８１、Ｗｕら、Ｇｅｎｅ，７６（２）：２４５−２５４，（１９８９）、Ｌｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１５）：３０７１−３０７８（１９９６）参照）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼを含む任意の数の熱安定性リガーゼが、例えば、ある種の真正細菌および古細菌等の好熱性または超好熱性生物から得ることができ、そのようなリガーゼを開示した方法およびキットで用いることができることを理解する。さらに、可逆的に不活性化された酵素（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号参照）を本教示のいくつかの実施形態で用いることが可能である。
化学的連結剤としては、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線光等の活性化、縮合、および還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。自動連結、すなわち、連結剤無しでの自然発生的連結もまた、本明細書中の教示の範囲内である。化学的連結方法の詳細な手順および適切な反応基の説明は、特に、Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１（１９９９）；ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；ＫａｎａｙａおよびＹａｎａｇａｗａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３−３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅおよびＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓおよびｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１−２４（１９９４）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；ＷａｎｇおよびＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９（１９９２）；ＡｓｈｌｅｙおよびＫｕｓｈｌａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：２９２７−３３（１９９１）；ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３２：１５３−５５（１９８８）；ＮａｙｌｏｒおよびＧｉｌｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：２７２２−２８（１９６６）；および米国特許第５，４７６，９３０号で見ることができる。
適切な波長の光を連結剤として用いる光連結もまた本教示の範囲内である。いくつかの実施形態では、光連結は、４−チオチミジン（ｓ４Ｔ）、５−ビニルウラシルおよびその誘導体、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないヌクレオチドアナログを包含するプローブを包含する。いくつかの実施形態では、連結剤は、（ａ）ＵＶ−Ａ範囲の光（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ範囲（約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍ）、またはそれらの組み合わせ、（ｂ）約３００ｎｍ〜約３７５ｎｍの間の波長の光、（ｃ）約３６０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長の光；（ｄ）約３６４ｎｍ〜約３６８ｎｍの波長の光、または（ｅ）約３６６ｎｍの波長の光を包含する。いくつかの実施形態では、光連結は可逆的である。光連結の説明は、特に、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：３９４０（１９９９）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．１：１８５−８６（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｓｕｐｐｌ．，２：１５５−５６（２００２）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９８）およびワールドワイドウェブ上のｓｂｃｈｅｍ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓａｉｔｏ−ｌａｂで見ることができる。
連結
本教示による連結は、ヌクレオチド間結合がテンプレートと隣接してハイブリダイズする核酸配列の両端間に形成される任意の酵素または非酵素処理を包含する。典型的には、アニーリングされた核酸プローブの両端が連結に適している（連結に対する適正は、用いられる連結手段に依存する）。いくつかの実施形態では、連結は、少なくとも１つの間隙充填手順も包含し、当該手順においては、２つのプローブの端部が隣接するが、最初は、接触してハイブリダイズすることがなく、第１プローブの３’末端が、典型的には、ポリメラーゼによって第２プローブの５’末端に接触するまで、１つ以上のヌクレオチドによって伸張される（例えば、米国特許第６，００４，８２６号参照）。ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合形成を含む得るが、これに限定されない。このような結合形成は、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼまたは少なくとも１つのＲＮＡリガーゼにより酵素的に生成されたものを含むが、これらに限定されない。また、これらは、可逆的に不活性化されたリガーゼ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号参照）ならびに酵素的に活性な変異体およびその変異型を含むがそれらに限定されず、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｔｓｃ）リガーゼ、ＴＳ２１２６（Ｔｓｃを感染させる好熱性ファージ）ＲＮＡリガーゼ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｌｕｇｉｄｕｓ（Ａｆｕ）リガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼ等が挙げられる。
他のヌクレオチド間結合は、チオホスホリルアセチルアミノ基、ホスホロチオエート、トシレートまたはヨージド基を形成し、５’−ホスホロチオエステルを形成するα−ハロアシル基とホスホチオエート基との間等の適切な反応基間の共有結合形成、およびピロリン酸塩結合を含むが、これらに限定されない。
化学的連結は、適切な条件化で、自動連結等により自然発生的に起こるようにすることができる。あるいは、「活性」または還元剤を用いることができる。活性剤および還元剤の例としては、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および光連結に用いられるような紫外線光が挙げられるが、これらに限定されない。
連結は、一般に、少なくとも１サイクルの連結を包含するが、これは、すなわち、第１プローブおよび対応する第２プローブの標的特異部を対応する標的核酸配列上のそれぞれの相補領域とハイブリダイズし；第１プローブの３’末端を第２プローブの５’末端と連結して連結産物を形成し；核酸二本鎖を変性させて、連結産物を連結産物：標的核酸配列二本鎖から放出する連続した手順である。連結サイクルは、例えば、連結反応に熱サイクリングを施し、連結プローブを用いて連結産物を増幅する（プライマーおよびポリメラーゼを用いて増幅された連結産物を発生することは除外する）ことによって、繰り返しても繰り返さなくてもよいが、これに限定されない。
間隙充填連結等の連結技術も本教示の範囲内にあり、これは、間隙充填式のＯＬＡ、ＬＤＲおよびＬＣＲ、ＦＥＮ切断が介在する方式のＯＬＡ、ＬＤＲおよびＬＣＲ、架橋オリゴヌクレオチド連結、矯正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）連結、および環状リンカーに基づく鎖状連結（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない。本教示内に含まれる非限定的な連結技術は、さらに、ＰＣＲをその後に伴うＯＬＡ（例えば、Ｒｏｓｅｍｂｌｕｍら、ＰＣＴ出願ＵＳ０３／３７２２７、Ｒｏｓｅｍｂｌｕｍら、ＰＣＴ出願ＵＳ０３／３７２１２およびＢａｒａｎｙら、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９７４５５９Ａ１参照）、移動度修飾因子を包含するＯＬＡ（例えば、米国特許第５，５１４，５４３号参照）、ＯＬＡをその後に伴うＰＣＲ、ＯＬＡをその後に伴う２回のＰＣＲ、単一の環状に変形可能なプローブ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｂｌｅ ｐｒｏｂｅｓ）を包含する連結（例えば、Ｌａｎｄｒｅｇｒｅｎら、ＷＯ９７４１２５４Ａ１参照）、パドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅｓ）のローリングサークル複製を包含するＯＬＡ（例えば、Ｌａｎｄｒｅｇｒｅｎら、米国特許第６５５８９２８号参照）を包含する。これらおよび関連する技術の説明は、特に、米国特許第５，１８５，２４３号および同第６，００４，８２６号、同第５，８３０，７１１号、同第６，５１１，８１０号、同第６，０２７，８８９号；欧州特許出願公開公報ＥＰ３２０３０８およびＥＰ４３９１８２；ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９０／０１０６９、ＷＯ０１／５７２６８、ＷＯ００５６９２７Ａ３、ＷＯ９８０３６７３Ａ１、ＷＯ２００１１７３２９、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８）、Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５）、ｄｅ Ａｒｒｕｄａら、ならびに米国特許出願第６０／５１７，４７０号において見ることができる。いくつかの実施形態では、連結により、後に続く増幅工程の前に試料の調製を行なうことが可能である。いくつかの実施形態では、連結により、増幅自体を行なうことが可能であり、かつその後に次の増幅を伴う最初の増幅も行なうことが可能である。
本教示のいくつかの実施形態では、従来にないヌクレオチド塩基を連結プローブに入れ、得られた産物を酵素（例えば、グリコシラーゼ類）および／または物理化学的手段により処理し、当該産物が増幅等の次の反応のためのテンプレートとして機能できないようにすることが可能である。いくつかの実施形態では、ウラシルを連結反応混合物内の核酸塩基として含むことにより、次の反応において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用により前回のウラシル含有産物の残留物による汚染を除去することが可能になる。グリコシラーゼ等を用いて汚染除去する種々の方法は、例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９２０１８１４Ａ２において見ることができる。
連結反応後にハイブリダイズしていないおよび／または連結されていないプローブを取り除く方法は当該分野で公知であり、下記においてさらに議論する。このような手順は、ヌクレアーゼを介した方法、希釈、サイズ排除法、親和部分を用いる手順、（例えば、米国仮出願第６０／５１７，４７０号、米国仮出願第６０／４７７，６１４号、およびＰＣＴ出願第２００３／３７２２７号参照）、標的ポリヌクレオチドの固定を伴う親和部分を用いる手順（例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ０３／００６６７７Ａ２参照）を含む。
増幅
本教示による増幅は、典型的には、核酸配列を直線的または飛躍的に増幅する多様な技術を含むがこれに限定されないテンプレートに依存した方法で少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド、連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を複製するいずれの方法も含む。増幅工程を行なうための例示的な工程は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、その後にＱ−レブリカーゼ増幅を伴う連結、ＰＣＲ、プライマー伸張、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、超分岐鎖置換増幅、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、２工程多重増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）等を含み、これらは、多数の種類およびそれらの組み合わせを含んでおり、例えば、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応（ＣＣＲ）としても知られる）等が挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の説明は、特に、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）（”Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ”）；Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２）（”Ｒａｐｌｅｙ”）；Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３ Ｆｅｂ；４（１）：４１−７、米国特許第６，０２７，９９８号；米国特許第６，６０５，４５１号、Ｂａｒａｎｙら、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／３１２５６号；Ｗｅｎｚら、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／９２５７９号；Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５）、Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；およびＲａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ、Ｂａｒａｎｙ、およびＬｕｂｉｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９５（ワールドワイドウェブ上のｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌから入手可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔ．＃２００５２０，Ｒｅｖ．＃０５０００２，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００２；Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３（１９９１）；ＢｉおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｒｖｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９）；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）；ＢａｒａｎｙおよびＧｅｌｆａｎｄ、Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；Ｐｏｌｓｔｒａら、ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２）；Ｌａｇｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｆｅｂ；１３（２）：２９４−３０７、およびＬａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８）、Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２ Ｎｏｖ；２（６）：５４２−８、Ｃｏｏｋら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｍａｙ；５３（２）：１６５−７４、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ Ｆｅｂ；１２（１）：２１−７、米国特許第５，８３０，７１１号、米国特許第６，０２７，８８９、米国特許第５，６８６，２４３号、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ００５６９２７Ａ３、およびＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９８０３６７３Ａ１において見ることができる。
いくつかの実施形態では、増幅は、以下の連続手順の少なくとも１サイクルを包含する：少なくとも１つのプライマーを、少なくとも１つの連結産物、少なくとも１つの連結産物代替物、またはそれらの組み合わせにおいて相補的または実質的に相補的配列とハイブリダイズさせる手順；テンプレートに依存する方法において、ヌクレオチドの少なくとも１つの鎖をポリメラーゼを用いて合成する手順；および新たに形成された核酸二本鎖を変性させ、上記鎖を分離する手順。このサイクルは、繰り返しても繰り返さなくてもよい。増幅は、熱サイクリングを包含するものとすることができ、また、等温的に行なうこともできる。いくつかの実施形態では、新たに形成された核酸二本鎖を最初に変性させることはせずに、後続する１つ以上の工程において二本鎖の形態で用いる。
プライマー伸張は、ポリメラーゼ等の増幅手段を用いてテンプレートにアニーリングされる少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを５’から３’の方向において引き延ばすことを包含する増幅工程である。いくつかの実施形態では、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、ならびにヌクレオチドトリホスフェートおよびそのアナログを用いる適切な条件下で、ポリメラーゼは、アニーリングされたプローブまたはプライマーの３’末端から始まるテンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを取り込み、相補鎖を生成する。いくつかの実施形態では、プライマー伸張は、少なくとも１つの標的核酸配列の標的配列とハイブリダイズするプローブセットの２つのプローブとの間の間隙を埋め、当該２つのプローブを連結するために用いることが可能である。いくつかの実施形態では、プライマー伸張に用いられるポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないかまたは実質的に有さない。
本教示のいくつかの実施形態では、従来にないヌクレオチド塩基を連結プローブに入れ、該産物を酵素（例えば、グリコシラーゼ類）および／または物理化学的手段により処理し、当該産物が次の増幅のテンプレートとして機能できないようにすることが可能である。いくつかの実施形態では、ウラシルを反応混合物内の核酸塩基として含むことにより、次の反応において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用により前回のウラシル含有産物の残留物による汚染を除去することが可能になる（例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９２０１８１４Ａ２参照）。本教示のいくつかの実施形態では、例えば、Ｒａｄｓｔｒｏｍら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ Ｆｅｂ；２６（２）：１３３−４６に記載されるように、種々の技術のいずれもが増幅の前に用いて増幅を容易に成功させることが可能である。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号に記載されるように、試料の調製および検出を包含する自己完結的な統合的方法において増幅を行なうことが可能である。
組み込まれていない、および／または、望ましくない反応成分の除去
多数の反応工程を用いる複雑な核酸混合を伴う反応により生じた各種の反応成分は組み込まれておらず、各種の複雑性を低減する手順のいずれかを用いてそのような組み込まれていない反応成分を除去することにより、効率および特異性または次に発生する反応を改良できることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、複雑性の低減は、標的核酸の選択的固定化を含む。例えば、標的核酸は、選択的に、固形支持体上に固定することが可能である。いくつかの実施形態では、フォトビオチンを標的核酸に付着することが可能であり、結果的に得られたビオチン標識核酸は、ストレプトアビジン等の親和部分結合剤を包含する固形支持体に固定される。固定された標的核酸は、プローブを用いて調べることが可能であり、ハイブリダイズしていないおよび／または連結されていないプローブは洗浄により除去される（このような複雑性を低減する方法のさらなる詳細については、例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ０３／００６６７７および米国特許出願番号第０９／９３１，２８５号を参照されたい）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、およびＭａｎｉａｔｉｓらの最新の文献に記載されているように、各種の洗浄条件を用いることが可能である。
いくつかの実施形態では、組み込まれていないプローブは、例えば、プローブの保護されていない３’末端を３’末端と反応を起こすヌクレアーゼで消化し、リン酸塩を支持するプローブの５’末端を５’末端と反応を起こすヌクレアーゼで消化することができる各種の酵素手段によって除去することができる。いくつかの実施形態では、このような連結プローブ等の組み込まれていない反応成分を除去するヌクレアーゼによる消化を介する方法は、例えば、米国特許出願第６０／５１７，４７０号に記載されるように、環状リンカープローブおよび／または環を有さないリンカーの使用をさらに包含しており、これに関しては、下記も参照されたい。
いくつかの実施形態では、未反応の連結プローブを混合物から除去することにより、第１プローブに標識を包含させ、第２プローブの３’末端をエキソヌクレアーゼブロック部分によりブロックすることが可能である。連結後にヌクレアーゼを入れた後、標識が付けられた連結してない第１プローブを消化し、連結産物および第２プローブを残すことが可能である。しかしながら、第２プローブには標識が付けられていないため、アッセイにおいては効果を奏さない。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドを固定し、連結産物を溶出して検出することが可能である。いくつかの実施形態では、第２プローブの３’末端は親和部分をさらに包含し、連結産物および組み込まれていない第２プローブを親和部分結合剤で固定することが可能である。いくつかの実施形態では、移動度プローブは、固定した連結産物とハイブリダイズすることが可能であり、ハイブリダイズしていない移動度プローブは洗い落とすことが可能であり、ハイブリダイズした移動度プローブは溶出して検出することが可能である。いくつかの実施形態では、第１プローブの５’末端は親和部分を包含し、連結産物および組み込まれていない第１プローブは、親和部分結合剤で固定することが可能である。
いくつかの実施形態では、例えば、同じ検査作業空間で行なわれた前回の反応産物は、今回対象とする反応を汚染する可能性がある。いくつかの実施形態では、例えば、ＰＣＲ増幅工程にウラシルを組み込むことにより、チミジンの代わりにまたはそれとともにウラシルを包含する反応産物を得ることが可能である。いくつかの実施形態では、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼをＯＬＡ反応混合物に含めて、ウラシル含有汚染物質を分解することが可能である。いくつかの実施形態では、連結混合物に関して、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを介した精製手順を実行することが可能である。
検出および定量化
検出および定量化は、例えば、移動度依存分析技術（例えば、キャピラリーまたはゲル電気泳動）アレイ捕獲オリゴヌクレオチドを包含する固形支持体、光ファイバーを含む種々のビーズを用いる方法（例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯＵＳ０２／３７４９９参照）、およびフローサイメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）を含む各種の手順を用いて行なうことが可能である。
標的ポリヌクレオチドの検出および定量化のためのキャピラリーおよびゲル電気泳動の使用は周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、”Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２１）：４５２７−３４（１９９４）、Ｓｌａｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４：１：５８−６４、アプライドバイオシステムズ社のキャピラリー電気泳動用器具３１００、３７００および３７３０の製品関連試料、および同じアプライドバイオシステムズ社のＳＮＰｌｅｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｕｉｄｅの製品関連試料を参照されたい）。
本教示による検出および定量化を行なうことが可能なさらなる移動度依存分析技術は、質量分光学技術（クロマトグラフィーを介したデコンボリューション工程を任意に包含する）、衝突誘起乖離（ＣＩＤ）フラグメンテーション解析、高速原子衝撃およびプラズマ脱離、ならびにエレクトロスプレー／イオンスプレー（ＥＳ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＬＤＩ質量分析を、飛行時間（ＴＯＦ）構成（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９７／３３０００参照）、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ（例えば、アプライドバイオシステムズ社の４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍの製品関連試料参照）とともに用いることが可能である。検出および定量化のためのさらなる質量分析方法は、例えば、アプライドバイオシステムズ社のＱｔｒａｐ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍの製品関連試料、アプライドバイオシステムズ社のＱＳＴＡＲ ＸＬ Ｈｙｂｒｉｄ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍの製品関連試料、アプライドバイオシステムズ社のＱ ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍの製品関連試料、およびアプライドバイオシステムズ社のＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（登録商標）ＰＲＯ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎの製品関連試料に記載されている。
固形支持体を捕獲オリゴヌクレオチドのアレイとともに用いることは、特に、係属中の米国仮特許出願第６０／０１１，３５９号に十分に開示されている。いくつかの実施形態では、そのようなアレイを用いる際、本明細書中において記載したＰＣＲおよび／またはＬＤＲ段階でそれぞれ用いるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、アドレス可能なハイブリダイゼーションタグ（例えば、同定部）を有することが可能である。ＬＤＲまたはＰＣＲ段階が終了すると、そのような処理の産物のアドレス可能ハイブリダイゼーションタグは、一本鎖のままであり、捕獲段階中に捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせられる。例えば、Ｃ．Ｎｅｗｔｏｎら、”Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｗｉｔｈ ５’ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔａｉｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１１５５−６２（１９９３）、Ｃａｒｒｉｎｏ ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ０９６１５２３７１Ａ１を参照されたい。本教示は、さらに、当該分野で公知の各種のアレイに基づくさらなる手順を想定しており、これらは、ドットブロット（例えば、ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ．７３−１１１，１９８５、およびＥＰＡ０２２８０７５参照、さらに、重複する連続体の検出およびゲノム地図の作成に関してはＥｖａｎｓ，Ｇ．Ａ．米国特許第５，２１９，７２６号を参照）、逆ドットブロット、およびマトリックスハイブリダイゼーション（Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｔｈｅ １９９２ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１９９２参照）、フォトリソグラフィーにより生成されたアレイ（例えば、Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７、およびアフィメトリクス社のＧｅｎｅｆｌｅｘ Ｔａｇ Ａｒｒａｙｓを参照）、例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９７３１２５６Ａ２、ＷＯ０１７９５４８Ａ２、ＷＯ００５６９２７Ａ３、アジレント社より市販されているスポットアレイに関する製品関連試料、アプライドバイオシステムズ社より市販されているＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍに関する製品関連試料に記載のユニバーサルアレイ、ヒューレットパッカード社およびＲｏｓｅｔｔａ−Ｍｅｒｃｋ社より市販されている印刷を用いたアレイ、電極アレイ、三次元「ゲルパッド」アレイ、およびＦＡＣＳ等の三次元アレイ方法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出および定量化は、ビーズに基づく各種の形態で実行することが可能であるが、これは、例えば、ＰＣＴ出願公開公報ＵＳ９８／２１１９３、ＵＳ９９／１４３８７、ＵＳ９８／０５０２５、ＷＯ９８／５０７８２、米国特許出願第０９／２８７，５７３号、同第０９／１５１，８７７号、同第０９／２５６，９４３号、同第０９／３１６，１５４号、同第６０／１１９，３２３号、および同第０９／３１５，５８４号に記載されている。また、ビーズおよびミクロスフェアに関する考察については、Ｇａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮの”Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ”を参照されたい。いくつかの実施形態では、検出および定量化は、米国特許出願第０８／９４４，８５０号および同第０８／５１９，０６２号、ＰＣＴ ＵＳ９８／０５０２５、およびＰＣＴ ＵＳ９８／０９１６３、ならびに米国特許出願第０９／４７３，９０４号において一般に記載されるファイバー束またはアレイで実行することが可能である。
いくつかの実施形態では、本処理の捕獲段階中に、適切な温度で最大６０分間、混合物を固形支持体に接触させるようにしてもよい。いくつかの実施形態では、本処理の捕獲段階中に、一晩またはそれ以上の間、混合物を固形支持体に接触させるようにしてもよい。ハイブリダイゼーションは、陽イオン、体積排除化合物、またはカオトロピック剤を加えることにより加速させることが可能である。アレイが数十から数百のアドレスから構成される場合、正確な連結産物配列は、適切なアドレスとハイブリダイズすることが可能になる。これは、アレイ表面と接する流動体の機械的な動き、または電界によりオリゴヌクレオチドをアレイ全体に渡って移動させることで、使用する高温でのオリゴヌクレオチドの熱運動を利用して行なうことができる。ハイブリダイゼーション後、アレイは、低ストリンジェントな洗浄緩衝液、および高ストリンジェントな洗浄緩衝液を連続して用いて洗浄することができる。
いくつかの実施形態では、安定してハイブリダイズする捕獲オリゴヌクレオチドおよびアドレス可能なヌクレオチド配列が選ばれる。これは、オリゴヌクレオチドセットおよび捕獲オリゴヌクレオチドを伴っており、これらは、オリゴヌクレオチドセットが捕獲オリゴヌクレオチドがアドレス可能なハイブリダイゼーションタグとハイブリダイズするよりも低い温度で標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように構成することができる。オリゴヌクレオチドがこのように設計されない限り、標的とハイブリダイズする同じオリゴヌクレオチドセットの隣接する未反応のオリゴヌクレオチドが捕獲されることにより、誤った陽性の信号が生じる。
捕獲オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾リン酸塩−糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、およびそれらの混合物の形態とすることができる。
アレイを利用する場合、本処理の検出段階は、ＯＬＡ、ＬＤＲ、および／またはＰＣＲ産物等が生成された場合、走査および同定を伴い、さらに、そのような産物の存在と試験試料中の標的ヌクレオチド配列の有無とを対応づける。走査は、走査電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、電荷結合素子、走査トンネル電子顕微鏡法、赤外顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、電気伝導度、および蛍光またはリン光体イメージングによって行なうことが可能である。対応づけは、コンピュータを用いて行なわれる。
本教示は、例えば、Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ａ．Ｐ．２００２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｌｅｓｓ ｉｓ Ｍｏｒｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”に記載されるような各種のナノテクノロジーに基づく方法の使用をさらに想定しており、例えば、種々の磁気タグ、金粒子、カンチレバー、量子ドット、および微小流体を用いた方法（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４：１：１３−２２，Ｏｂａｔａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２ Ｓｅｐ；３（５）：６９７−７０８、Ｐａｅｇｅｌら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；１４（１）：４２−５０、米国特許第６，６７０，１５３号、同第６，６４８，０１５号、同第６，６３２，６５５号、同第６，６２０，６２５号、同第６，６１３，５８１号参照）、ならびにＣａｌｉｐｅｒ社およびＦｌｕｉｄｉｇｍ社から一般に入手可能な市販製品も含まれる。
本教示のいくつかの実施形態では、検出された産物の分析は、種々のソフトウェア手順を適用して行なうことが可能である。例えば、キャピラリー電気泳動産物の分析は、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒバージョン３．５およびＢｉｏＴｒｅｋｋｅｒバージョン１．０等、アプライドバイオシステムズ社から市販される種々のソフトウェアパッケージを用いて行なうことが可能である。
一般に、検出および定量化に用いられる処理が本教示を限定するものではないことは言うまでもない。
本教示の局面は、以下の例を参照することにより、さらに理解を深めることができるが、それらの例が決して本教示の範囲を限定するものではないことは言うまでもない。
例示的な実施形態
分子生物学の多くの分野が、標的ポリヌクレオチド配列の検出を必要としている。ゲノム学以降、科学者が利用可能な配列情報の量が増加することにより、複合核酸試料を調べるための迅速で信頼でき安価で大量処理が可能で高感度で正確な方法に対する要望が増大している。ハイブリダイゼーション、連結および増幅は、標的ポリヌクレオチドを検出するために頻繁に用いられる手順である（例えば、最近の総説に関しては、Ｃａｏ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：１：３８−４４を参照されたい）。反応混合物の複雑性、およびそのような手順の工程の多様性により、複雑なデータセットが生じており、偽陽性率の程度、偽陰性率、および他の反応の完全性を評価するためのパラメータは、大規模な反応制御がなければ判定が困難である場合がある。
連結アッセイは、陰性の結果を解釈することが困難であり得る場合の一例である。例えば、連結アッセイにおける陰性の結果により、反応混合物内に特定の標的ポリヌクレオチド配列がない（例えば、特定の対立遺伝子変異型がない）ことを示すことが可能である。しかしながら、連結アッセイにおける陰性の結果はまた、非機能的な反応成分を示している可能性がある。実験者は、反応が非機能的な反応成分を包含する場合に、特定の標的ポリヌクレオチド配列に対する陰性の結果が実際には特定の標的ポリヌクレオチド配列が反応混合物に存在しないことを表すことを必ずしも正確に推論することができない。
本教示のいくつかの実施形態は、非特異的連結産物を検出するコントロール組成物、キット、および方法を提供する。本教示のいくつかの実施形態は、連結アッセイにおけるネガティブコントロールプローブを提供する。そのようなネガティブコントロールプローブは、単型性標的ポリヌクレオチドをそれらの標的特異部とハイブリダイズさせることができるが、識別領域とはハイブリダイズさせることができず、実験者に、非特異的連結が発生する範囲の測定値を提供することができる。ネガティブコントロールプローブからの信号の存在によって、実験者は、非特異的連結の測定値を得ることができる。このような非特異的連結の測定値は、非特異的連結および他の不必要な効果がアッセイの結果を汚染している見込みおよび／または程度を評価するために用いることができる。
また、連結アッセイにおける陽性の結果を解釈することも困難であり得る。例えば、連結アッセイにおける陽性の結果は、反応混合物内における特定の標的ポリヌクレオチド配列の存在を示すことが可能である。しかしながら、連結アッセイにおける陽性の結果はまた、反応成分間の非特異的相互作用を示す場合もある。例えば、陽性の結果は、反応成分間の非特異的連結を示すとともに、前回の反応からの増幅可能なポリヌクレオチド配列による汚染を示す可能性もある。実験者は、そのような非特異的相互作用が反応において発生する可能性を考慮して、特定の標的ポリヌクレオチド配列の陽性の結果が、当該特定の標的ポリヌクレオチド配列が反応混合物内に存在するということを実際に表していることを必ずしも正確には推論することができない。
本教示のいくつかの実施形態は、特異的連結産物を検出するためのコントロール組成物、キット、および方法を提供する。本教示のいくつかの実施形態は、連結アッセイにおけるポジティブコントロールプローブを提供する。そのようなポジティブコントロールプローブは、単型性標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であり、必要な反応成分が陽性の信号を提供するように機能しているということを実験者に証明することが可能である。ポジティブコントロールプローブからのそのような陽性の信号の存在によって、実験者は、他の変数を陰性の結果の原因として無視することができる。そのような特異的連結の測定値は、非特異的連結および他の不必要な効果がアッセイの結果を汚染している見込みおよび／または程度を評価するために用いることができる。
オリグノウクレオチド連結アッセイにおいて特異的および非特異的連結を評価する際の困難さは、反応の複雑さが増すにつれて悪化する可能性がある。例えば、連結アッセイを他の技術と組み合わせる種々の方法（例えば、Ｃａｏら、２００４参照）、および複数の標的ポリヌクレオチド配列を調べる非常に多重化された反応を実施したいという要望の増大により、反応の複雑さが増し、反応の正確さを判定するための正確な方法の重要性の認識が高まった。
本教示のいくつかの実施形態では、コントロールプローブを連結アッセイに関して用いる一方で、本教示はまた、標的ポリヌクレオチド配列から１つより多くの信号を生成する能力により大きく関与することが可能であり、必ずしも連結アッセイを伴う必要がないことを理解されたい。図１に示す１つの非限定的な実施形態では、、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２は、それぞれ、同一の標的特異部（ＴＳＰ）、および単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な識別領域（ここでは、Ｇ）を包含し得る。第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２は、個別の同定部（ここでは、第１のポジティブコントロールプローブ１のＩＰ Ａおよび第１のポジティブコントロールプローブ２のＩＰ Ｂ）をさらに包含し得る。第１のポジティブコントロールプローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、これらの単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしたポジティブコントロールプローブを単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしなかったプローブから分離する１つ以上の工程を行なうことができる。単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしたポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２の検出により、１つの単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を作成することが可能である。
本教示のいくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブは、連結アッセイに関して、１つの標的ポリヌクレオチド配列から１つより多くの信号を生成するために用いることができる。図２に示す１つの非限定的実施形態では、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２は、それぞれ、同一の標的特異部（ＴＳＰ）、および単型性標的ポリヌクレオチド配列Ｘとハイブリダイズすることが可能な識別ヌクレオチド（ここでは、Ａ）を含み得る。第２のポジティブコントロールプローブもまた、単型性標的ポリヌクレオチド配列Ｘとハイブリダイズすることができる。第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２は、個別の同定部（ここでは、第１のポジティブコントロールプローブ１のＩＰ Ａおよび第１のポジティブコントロールプローブ２のＩＰ Ｂ）をさらに包含し得る。第１のポジティブコントロールプローブおよび第２のポジティブコントロールプローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列Ｘ上の隣接する領域とハイブリダイズした後、連結剤によって、第１プローブと第２プローブを連結することができる。これらのハイブリダイズし連結された第１プローブおよび第２プローブをハイブリダイズおよび／または連結しなかった第１プローブおよび第２プローブから分離する１つ以上の工程を行なわれ得る。結果得られた連結産物、または連結産物代替物を検出することにより、１つの単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を作成することができる。
本教示のいくつかの実施形態は、連結アッセイにおいて特異的連結および非特異的連結を検出する方法に関する（図３〜図４参照）。図３に示すように、ポジティブコントロール第１プローブ１およびネガティブコントロール第１プローブ１は、それぞれ、単型性標的ポリヌクレオチド配列Ｘとハイブリダイズすることが可能な標的特異部を包含し得る。ネガティブコントロール第１プローブ１の標的特異部は、単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドとハイブリダイズしない識別領域（ここでは、Ａ）をさらに含み、ポジティブコントロール第１プローブ１の標的特異部は、単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドとハイブリダイズする識別領域（ここでは、Ｇ）をさらに包含し得る。ポジティブコントロール第１プローブおよびネガティブコントロール第１プローブは、異なる同定部（ここでは、ポジティブコントロール第１プローブ１のＩＰ Ａおよびネガティブコントロール第１プローブ１のＩＰ Ｂ）をさらに包含し得る。ポジティブコントロール第１プローブ１およびネガティブコントロール第１プローブ１、および第２プローブは、単型性標的ポリヌクレオチド配列のある領域上で隣接してハイブリダイズすることが可能である。ポジティブコントロール第１プローブ１および第２プローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、連結が発生することにより、ポジティブコントロール第１プローブ１および第２プローブを包含する特異的連結産物を生じ得る。ネガティブコントロール第１プローブ１および第２プローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、非特異的連結が発生することにより、ネガティブコントロール第１プローブ１および第２プローブを包含する非特異的連結産物を生じ得る。ポジティブコントロール第１プローブ１のＩＰ Ａを包含する連結産物を検出することにより、特異的連結の発生を示す個別の信号を生成することができる。ネガティブコントロールフィストプローブのＩＰ Ｂを包含する連結産物を検出することにより、非特異的連結の発生を示す個別の信号を生成することができる。ポジティブコントロール第１プローブ１産物からの信号とネガティブコントロール第１プローブ１産物からの信号とを比較することにより、実験者は、連結反応内の特異性の度合いを示され得る。
図４に示すように、単型性標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図３のポリヌクレオチドＸ）を調べるコントロールプローブ反応は、多型性標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図４のＹ）を調べる実験プローブ反応と同じ反応で発生し得る。実験第１プローブ１および実験第１プローブ２は、それぞれ、多型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な標的特異部を包含し得る。実験第１プローブ１の標的特異部は、多型性標的ポリヌクレオチド（ここでは、Ａ）の対応するヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能な識別領域をさらに包含し、実験第１プローブ２の標的特異部は、多型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド（ここでは、Ｇ）とハイブリダイズしない識別領域をさらに包含し得る。実験第１プローブ１および実験第１プローブ２は、異なる同定部（ここでは、実験第１プローブ１のＩＰ Ｃ、および実験第１プローブ２のＩＰ Ｄ）をさらに包含し得る。実験第１プローブ１および実験第１プローブ２は、多型性標的ポリヌクレオチド配列上の実験第２プローブと隣接してハイブリダイズすることができる。実験第１プローブ１および第２プローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、連結が発生することにより、ポジティブコントロール第１プローブ１および第２プローブを包含する特異的連結産物を生じ得る。実験第１プローブ２および第２プローブが多型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、非特異的連結が発生することにより、実験第１プローブ２および第２プローブを包含する非特異的連結産物を生じ得る。実験第１プローブ１のＩＰ Ｃを包含する連結産物を検出することにより、特異的連結の発生を示す個別の信号を生成することができる。実験フィストプローブ２のＩＰ Ｄを包含する連結産物を検出することにより、非特異的連結の発生を示す個別の信号を生成することができる。実験第１プローブ１産物からの信号を実験第１プローブ２産物からの信号と比較することにより、実験者は、連結反応における特異性の度合いを示され得る。さらに、ポジティブコントロールプローブ産物とネガティブコントロールプローブ産物との間の相違と、実験プローブ１産物と実験プローブ２産物との間の相違とを比較することにより、実験者は、実験プローブ２から発生した信号が特異的連結産物ではなく非特異的連結産物を示す見込みを示され、多型性標的ポリヌクレオチド配列の同一性の正確な評価を得る確実性を測定する手段を得ることができる。
いくつかの実施形態では、多型性標的ポリヌクレオチド配列は、特定のゲノム遺伝子座（例えば、遺伝子）の異なる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）変異型をさらに包含する。各実験第１プローブの標的特異部は、特定の対立遺伝子変異型と相補的な識別領域を包含し得る。ハイブリダイゼーションおよび連結の後、実験プローブを包含する連結産物または連結産物代替物の同定部の検出および定量化により、ＳＮＰを同定することができる。さらに、コントロールプローブを包含する連結産物または連結産物代替物の同定部の検出および定量化により、特異的および非特異的連結の範囲を判定し、多型性標的ポリヌクレオチド配列の同一性の正確な評価を得る確実性を測定する手段を得ることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの単型性標的ポリヌクレオチド配列を調べる少なくとも１つのコントロールプローブセットと同じ反応で発生する複数の多型性標的ポリヌクレオチド配列を調べる連結アッセイにおいて複数の実験プローブセットが包含される。いくつかの実施形態では、連結アッセイにおける複数の実験プローブが、それぞれが単一ヌクレオチド多型を包含する多型性対立遺伝子変異型を包含し得る複数のＳＮＰ遺伝子座を調べる。いくつかの実施形態では、１〜１０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が調べられる。いくつかの実施形態では、１〜５０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が調べられる。いくつかの実施形態では、１〜１００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が調べられる。いくつかの実施形態では、１〜２００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が調べられる。いくつかの実施形態では、２００よりも多くの多型性標的ポリヌクレオチド配列が調べられる。
いくつかの実施形態では、１〜１０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜５０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、１つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜１００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、１つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜２００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、１つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、２００個よりも多くの多型性標的ポリヌクレオチド配列が、１つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。
いくつかの実施形態では、１〜１０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、２つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜５０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、２つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜１００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、２つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜２００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、２つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、２００個よりも多くの多型性標的ポリヌクレオチド配列が、２つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。
いくつかの実施形態では、１〜１０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも３つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜５０個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも３つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜１００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも３つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、１〜２００個の多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも３つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。いくつかの実施形態では、２００個よりも多くの多型性標的ポリヌクレオチド配列が、少なくとも３つのコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。
本教示のいくつかの実施形態では、少なくとも２つの単型性標的ポリヌクレオチドが、（図５に示すような）少なくと２つのポジティブコントロールプローブセットを用いた第１の反応で調べられる。遺伝子座Ｘを調べる第１のポジティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べる第２のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応で生じた産物を比較することにより、所与の反応内での異なる単型性標的ポリヌクレオチド配列について特異的連結が変化する範囲の測定値を得ることができる。遺伝子座Ｘを調べる第１のポジティブコントロールプローブセットおよび第１の反応において遺伝子座Ｙを調べる第２のポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応から生じる産物と、遺伝子座Ｘを調べる第１のポジティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べる第２のポジティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応で生じる産物を比較することにより、異なる反応間での同じ単型性標的ポリヌクレオチド配列について特異的連結が変化する範囲の測定値を得ることができる。
図５は、遺伝子座Ｘを調べるポジティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べるポジティブコントロールプローブセットを包含する反応を示す。遺伝子座Ｘを調べるポジティブコントロールプローブセットは、それぞれ単型性標的ポリヌクレオチド配列（遺伝子座Ｘ）とハイブリダイズすることが可能な同一の標的特異部を包含するポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２を包含する。ポジティブコントロール第１プローブ１は、ポジティブコントロール第１プローブ２の同定部（ここでは、ＩＰ Ｂ）とは異なる同定部Ａ（ＩＰ Ａ）を包含するが、遺伝子座Ｘを調べるポジティブコントロールプローブセットのポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２はともに、同じ３’識別領域（ここでは、Ｃ）を包含する。遺伝子座Ｙを調べるポジティブコントロールプローブセットは、それぞれ単型性標的ポリヌクレオチド配列（遺伝子座Ｙ）とハイブリダイズすることが可能な同一の標的特異部を包含するポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２を包含する。ポジティブコントロール第１プローブ１は、ポジティブコントロール第１プローブ２の同定部（ここでは、ＩＰ Ｄ）とは異なる同定部Ｃ（ＩＰ Ｃ）を包含するが、遺伝子座Ｙを調べるポジティブコントロールプローブセットのポジティブコントロール第１プローブ１およびポジティブコントロール第１プローブ２はともに、同じ３’識別領域（ここでは、Ａ）を包含する。
ポジティブコントロール第１プローブおよび第２プローブは、それらの対応する単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能であり、識別領域が単型性標的ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、ポジティブコントロール第１プローブがそれらの対応する単型性標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能になる。ポジティブコントロール第１プローブおよびポジティブコントロール第２プローブが単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、連結剤を与えることにより、連結を発生させて、第１のポジティブコントロールプローブ１および第２プローブ、ならびに第１のポジティブコントロールプローブ２および第２プローブを包含し、遺伝子座Ｘを調べるポジティブコントロールプローブセットから特異的連結産物を生じ、さらに、第１のポジティブコントロールプローブ１および第２プローブ、ならびに第１のポジティブコントロールプローブ２および第２プローブを包含し、遺伝子座Ｙを調べるポジティブコントロールプローブセットから特異的連結産物を生じることができる。連結産物内のＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂを検出することにより、単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を生成し、特異的連結の測定値を得ることができる。連結産物内のＩＰ ＣおよびＩＰ Ｄを検出することにより、単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を生成し、特異的連結の測定値を得ることができる。ＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂから生成した信号を比較することにより、反応内の標的ポリヌクレオチド（ここでは、遺伝子座Ｘ）の特異的連結の測定値を得ることができる。ＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂから生成された信号をＩＰ ＣおよびＩＰ Ｄから生成された信号と比較することにより、反応内の異なる標的ポリヌクレオチド（ここでは、遺伝子座Ｘおよび遺伝子座Ｙ）の特異的連結の測定値を得ることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子座Ｘを調べる同じポジティブコントロールセットおよび遺伝子座Ｙを調べるポジティブコントロールセット、ならびに同じ単型性標的ポリヌクレオチド（遺伝子座Ｘおよび遺伝子座Ｙ）を包含する併発反応により、複数の反応に渡る所与の１つまたは複数の遺伝子座の特異的連結の測定値を得ることができる。
いくつかの実施形態では、１〜１０個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１〜１０個のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１０〜５０個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１０〜５０個のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、５０〜１００個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、５０〜１００個のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、４８個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、４８個のポジティブコントロールセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、９６個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、９６個のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１９２個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１９２個のポジティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１９２個より多くの単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１９２個より多くのポジティブコントロールセットを包含する反応において調べられる。これらいずれの反応のシナリオもその他のシナリオも全て併発反応で同時に行なうことができることは言うまでもない。いくつかの実施形態では、併発反応は、同じポジティブコントロールプローブセットおよび標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、異なるポジティブコントロールプローブセットおよび異なる標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、ポジティブコントロールプローブセットと同じ標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロールプローブセット（下記参照）を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、ポジティブコントロールプローブセットとは異なる標的ポリヌクレオチドを調べるネガティブコントロールプローブセット（下記参照）を包含することができる。
本教示のいくつかの実施形態では、少なくと２つの単型性標的ポリヌクレオチドが、（図６に示すような）少なくと２つのネガティブコントロールプローブセットを用いた反応で調べられる。遺伝子座Ｘを調べる第１のネガティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べる第２のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応から生じる産物を比較することにより、所与の反応内の異なる単型性標的ポリヌクレオチド配列について非特異的連結が変化する範囲の測定値を得ることができる。遺伝子座Ｘを調べる第１のネガティブコントロールプローブセットおよび第１の反応において遺伝子座Ｙを調べる第２のネガティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応から生じる産物と、遺伝子座Ｘを調べる第１のネガティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べる第２のネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応から生じる産物とを比較することにより、異なる反応間の同じ単型性標的ポリヌクレオチド配列について非特異的連結が変化する範囲の測定値を得ることができる。
図６は、遺伝子座Ｘを調べるネガティブコントロールプローブセットおよび遺伝子座Ｙを調べるネガティブコントロールプローブセットを包含する反応を示す。遺伝子座Ｘを調べるネガティブコントロールプローブセットは、それぞれが単型性標的ポリヌクレオチド配列（遺伝子座Ｘ）とハイブリダイズすることが可能な同一の標的特異部および標的単型性標的ポリヌクレオチド（遺伝子座Ｘ）上の対応するヌクレオチド（ここでは、Ｇ）と相補的でない標的特異部の同一の識別領域（ここでは、Ｔ）を包含するネガティブコントロール第１プローブ１およびネガティブコントロール第１プローブ２を包含する。ネガティブコントロール第１プローブ１は、ネガティブコントロール第１プローブ２の同定部（ここでは、ＩＰ Ｂ）とは異なる同定部Ａ（ここでは、ＩＰ Ａ）を包含する。遺伝子座Ｙを調べるネガティブコントロールプローブセットは、それぞれが単型性標的ポリヌクレオチド配列（遺伝子座Ｙ）とハイブリダイズすることが可能な同一の標的特異部および標的単型性ポリヌクレオチド（遺伝子座Ｙ）上の対応するヌクレオチド（ここでは、Ｔ）と相補的でない標的特異部の同一の識別領域（ここでは、Ｃ）を包含するネガティブコントロール第１プローブ１およびネガティブコントロール第１プローブ２を包含する。ネガティブコントロール第１プローブ１は、ネガティブコントロール第１プローブ２の同定部（ここでは、ＩＰ Ｄ）とは異なる同定部Ｃ（ここでは、ＩＰ Ｃ）を包含する。
ネガティブコントロール第１プローブおよび第２プローブは、それらの対応する単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能であり、識別領域が単型性標的ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドと相補的でないため、ネガティブコントロール第１プローブがそれらの対応する単型性標的ポリヌクレオチドと完全にハイブリダイズすることを防ぐことができる。ネガティブコントロール第１プローブおよびネガティブコントロール第２プローブを単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズした後、連結剤を与えることにより、非連結（ｎｏｎ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を発生させ、第１のネガティブコントロールプローブ１および第２プローブ、ならびに第１のネガティブコントロールプローブ２および第２プローブを包含し、遺伝子座Ｘを調べるネガティブコントロールプローブセットから非特異的連結産物を生じさせ、および第１のネガティブコントロールプローブ１および第２プローブ、ならびに第１のネガティブコントロールプローブ２および第２プローブを包含し、遺伝子座Ｙを調べるネガティブコントロールプローブセットから非特異的連結産物を生じさせることができる。連結産物内のＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂを検出することにより、単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を生成し、非特異的連結の測定値を得ることができる。連結産物内のＩＰ ＣおよびＩＰ Ｄを検出することにより、単型性標的ポリヌクレオチドから２つの個別の信号を生成し、非特異的連結の測定値を得ることができる。ＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂから生成された信号を比較することにより、反応内の標的ポリヌクレオチド（ここでは、遺伝子座Ｘ）の非特異的連結の測定値を得ることができる。ＩＰ ＡおよびＩＰ Ｂから生成された信号とＩＰ ＣおよびＩＰ Ｄから生成された信号とを比較することにより、反応内の異なる標的ポリヌクレオチド（ここでは、遺伝子座Ｘおよび遺伝子座Ｙ）の非特異的連結の測定値を得ることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子座Ｘを調べる同じネガティブコントロールセットおよび遺伝子座Ｙを調べるネガティブコントロールセット、ならびに同じ単型性標的ポリヌクレオチド（遺伝子座Ｘおよび遺伝子座Ｙ）を包含する併発反応により、複数の反応に渡る所与の１つまたは複数の遺伝子座の特異的連結の測定値を得ることができる。
いくつかの実施形態では、１〜１０個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１〜１０個のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１０〜５０個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１０〜５０個のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、５０〜１００個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、５０〜１００個のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、４８個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、４８個のネガティブコントロールセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、９６個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、９６個のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１９２個の単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１９２個のネガティブコントロールプローブセットを包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、１９２個より多くの単型性標的ポリヌクレオチド配列が、１９２個より多くのネガティブコントロールセットを包含する反応において調べられる。これらいずれの反応のシナリオもその他のシナリオも全て併発反応で同時に行なうことができることは言うまでもない。いくつかの実施形態では、併発反応は、同じネガティブコントロールプローブセットおよび標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、異なるネガティブコントロールプローブセットおよび異なる標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、ネガティブコントロールプローブセットと同じ標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロールプローブセット（上記参照）を包含し得る。いくつかの実施形態では、併発反応は、ネガティブコントロールプローブセットとは異なる標的ポリヌクレオチドを調べるポジティブコントロールプローブセット（上記参照）を包含することができる。
本教示のいくつかの実施形態では、複数の単型性標的ポリヌクレオチド配列が併発反応で調べられ、この場合、複数の単型性標的ポリヌクレオチド配列が複数のポジティブコントロールプローブセットを用いた第１の反応で調べられ、複数の単型性標的ポリヌクレオチド配列が複数のネガティブコントロールプローブセットを用いた第２の反応で調べられる。いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールプローブセットを包含する反応における非特異的連結の範囲と、ポジティブコントロールプローブを包含する反応における特異的連結の範囲を比較することにより、異なる反応に渡って発生している非特異的連結の範囲の測定値を得ることができる。
いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールプローブを用いて得られた非特異的連結の測定値を、実験プローブによって調べられる多型性標的ポリヌクレオチドを包含する併発反応と比較することにより、実験プローブを包含する併発反応における特異的および非特異的連結の見込みを評価することができる。いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールプローブを用いて得られた非特異的連結の測定値を、実験プローブにより調べられる多型性標的多型性標的ポリヌクレオチドを包含する他の非併発反応と比較することにより、実験プローブを包含する非併発反応における特異的および非特異的連結の見込みを評価することができる。
いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応における単型性標的ポリヌクレオチド配列は、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の併発反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じである。いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列は、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列のいくつかは、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応において調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列のいくつかと同じである一方、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列のいくつかは、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列のいくつかとは異なる。
いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応における単型性標的ポリヌクレオチド配列は、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じであり、さらに、第１の反応のポジティブコントロールプローブセットの同定部は、第２の反応のネガティブコントロールプローブセットの同定部と同じである。いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応における単型性標的ポリヌクレオチド配列は、ネガティブコントロールプローブを包含する第２の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じであり、さらに、第１の反応のポジティブコントロールプローブセットの同定部は、第２の反応のネガティブコントロールプローブセットの同定部とは異なる。いくつかの実施形態では、ポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応における単型性標的ポリヌクレオチド配列は、ネガティブコントロールプローブセットを包含する第２の反応で調べられる単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じであり、さらに、第１の反応のポジティブコントロールプローブセットの同定部のいくつかは、第２の反応のネガティブコントロールプローブセットの同定部とは異なるが、全てが異なるわけではない。
よって、ポジティブコントロールプローブセットを包含する反応とネガティブコントロールプローブセットを包含する反応との間の単型性標的ポリヌクレオチド配列の種々の順列、およびポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールプローブの同定部が全て同じ、全て異なる、または同じであったり異なったりするという範囲が変化したとしても、本教示の範囲内であることは言うまでもない。
また、ポジティブコントロールプローブセットを包含する反応とネガティブコントロールプローブセットを包含する反応との間の単型性標的ポリヌクレオチド配列の種々の順列、および標的単型性配列が全て同じ、全て異なる、または同じであったり異なったりするという範囲が変化したとしても、本教示の範囲内であることは言うまでもない。
ポジティブコントロールプローブセットを包含する反応とネガティブコントロールプローブセット包含する反応との間の単型性標的ポリヌクレオチド配列の種々の順列、およびポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールプローブの同定部が全て同じ、全て異なる、または同じであったり異なったりする範囲が変化したとしても、本教示の範囲内であり、ポジティブコントロール反応およびネガティブコントロール反応の標的単型性標的ポリヌクレオチド配列が全て同じ、全て異なる、または同じであったり異なったりする範囲が変化し、同定部と標的単型性ポリヌクレオチドとの間でのそれらの組み合わせが変化したとしても、本教示の範囲内であることは言うまでもない。
本教示のいくつかの実施形態では、連結反応の前に、ゲノム増幅反応全体を行なうことが可能である。
本教示のいくつかの実施形態では、例えば、米国特許仮出願第６０／５１７，４７０号に記載されるように、実験第１プローブおよび／またはコントロール第１プローブおよび／または実験第２プローブおよび／またはコントロール第２プローブは、環状リンカー組成物、および／または非環状リンカー組成物を包含し得る。本教示のいくつかの実施形態では、移動度プローブは、連結産物または連結産物代替物の同定部分（または同定部分相補体）とハイブリダイズし、標的の同一性は、例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ２００３３７２２７において教示されるような移動度依存分析技術において、溶出した移動度プローブから判定される。
環状リンカーを包含するいくつかの実施形態では、まず、各種プローブをリン酸化し得る（図７の様々な種の例示を参照）。次いで、リン酸化されたプローブは、図８に模式的に示すように、本教示のいくつかの実施形態に従って連結反応において用いられ得る。例えば、第２プローブ環状リンカーは、第２プローブの下流（３’に位置する）と見なすことができる。第２プローブ環状リンカーは、３’一本鎖ＰＣＲユニバーサルリバースブライマー部、内部ブロック部分（図７および図８において、環の中央を通る水平線として示されている）、および５’二本鎖ＰＣＲユニバーサルリバースブライマー部を包含する。第２プローブ環状リンカーの一本鎖部分は、第２プローブのユニバーサルリバースブライマー部とアニーリングすることにより、環状リンカーのユニバーサルリバースプライマー領域を第２プローブのユニバーサルリバースブライマー部と連結することができる。さらに、第１プローブ環状リンカーは、第１プローブの上流（５’に位置する）と見なすことができる。第１プローブ環状リンカーは、３’二本鎖ＰＣＲユニバーサルフォワードブライマー部、内部ブロック部分、および５’一本鎖部分同定部２をさらに包含する。第１プローブ２環状リンカーは、第１プローブ２の同定部２とアニーリングすることにより、第１プローブ環状リンカーのユニバーサルフォワードブライマー部と第１プローブの標的同定部を連結することができる。
環状リンカー（図８、左側の図参照）を包含するいくつかの実施形態では、第１プローブの環状リンカーは、連結産物に組み込み可能かおよび連結産物がどのような種類のものかによって、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗の度合いを可変的に与えることが可能な内部に配置されたブロック部分をさらに包含し得る。例えば、鎖状連結産物に組み込まれる第１プローブ環状リンカーは、５’末端からブロック部分に向かって進行する５’末端と反応を起こすヌクレアーゼによる消化に敏感であるため、ＰＣＲプライマーが最終的にハイブリダイズすることが可能な一本鎖領域を生成することができる。さらに、鎖状連結産物に組み込まれない第１プローブ環状リンカーは、５’リン酸塩端からブロック部分に向かって進行する５’リン酸塩と反応を起こすヌクレアーゼによる消化に敏感であり、さらに、自由な３’末端から進行する３’末端と反応を起こすヌクレアーゼによる消化に敏感である。さらに、ＡＳＯと連結されるが、完全な連結産物には組み込まれない第１プローブ環状リンカーも第１プローブを介した３’との反応による劣化、および５’リン酸塩との直接的な反応の両方に敏感である。
環状リンカーを包含するいくつかの実施形態（図８、右側の図参照）では、第２プローブ環状リンカーは、連結産物に組み込み可能かおよび連結産物がどのような種類のものなのかによって、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗の度合いを可変的に与えることが可能な内部に配置されたブロック部分を包含し得る。例えば、連結産物に組み込まれる第２プローブ環状リンカーは、それらの３’末端からブロック部分に向かって進行する３’末端と反応を起こすヌクレアーゼによる消化に敏感であることにより、ＰＣＲプライマーが最終的にハイブリダイズすることが可能な一本鎖領域を生成することができる。さらに、鎖状連結産物に組み込まれない第２プローブ環状リンカーは、５’ホスペート末端からブロック部分に向かって進行する５’リン酸塩と反応を起こすヌクレアーゼによる消化と、自由な３’末端からブロック部分に向かって進行する３’末端と反応を起こすヌクレアーゼによる消化の両方に敏感である。さらに、第２プローブに連結されるが、完全な連結産物には組み込まれない第２プローブ環状リンカーもまた、直接３’末端と反応を起こすヌクレアーゼに敏感であり、同様に、第２プローブを介して劣化により５’末端と反応を起こすヌクレアーゼに敏感である。組み込まれた反応成分の除去により、ＰＣＲ等の下流での反応が容易になる。
環状リンカーを包含するいくつかの実施形態では、例示的なブロック部分は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、テトラメトキシウラシルから市販されているＣ３、Ｃ９、Ｃ１２、およびＣ１８、ならびに例えば、米国特許第５，５１４，５４３号、およびＷｏｏら、米国特許出願第０９／８３６、７０４号に記載される部分を包含する。例示的なヌクレアーゼは、一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端および５’リン酸塩端と反応を起こすエキソヌクレアーゼ１およびラムダエキソヌクレアーゼを包含する。本教示の実施に適した他の酵素がさらに企図されており、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、Ｒｏｃｈｅ、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ等の供給元より市販されている。
本教示のいくつかの実施形態では、第２の連結反応により、例えば、米国仮出願第６０／４７７，６１４号において教示されるような移動度プローブを導入することが可能である。
本教示のいくつかの実施形態では、連結反応は、例えば、除染反応および／またはリン酸化反応と同時に行なうことが可能である。本教示のいくつかの実施形態では、連結反応は、例えば、第１の除染反応および／またはリン酸化反応と同時に行なうことができ、その後に、リガーゼが熱活性化可能なリガーゼである連結が行なわれる。このような方法のさらなる例示的な教示については、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、米国仮出願第６０／５８４，６８２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｇａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、および同出願と同時に出願され優先権を主張する非仮出願を参照されたい。
本教示のいくつかの実施形態では、コントロールプローブおよび／または実験プローブはプライマー部をさらに包含し、連結反応の後に増幅反応が行なわれる。いくつかの実施形態では、増幅反応はＰＣＲである。いくつかの実施形態では、コントロール第１プローブおよび／または実験第１プローブのプライマー部は、ユニバーサルフォワードプライマー部を包含し得る。いくつかの実施形態では、コントロール第２プローブおよび／または実験第２プローブのプライマー部は、一組のユニバーサルプライマーが実験第１プローブと実験第２プローブの連結産物およびコントロール第１プローブとコントロール第２プローブの連結産物から得られた全ての連結産物を増幅することができるように、ユニバーサルリバースプライマー部を包含し得る。いくつかの実施形態では、コントロールプローブおよび／または実験プローブのプライマー部は、一連のユニバーサルプライマーが実験プローブセットの連結産物およびコントロールプローブセットの連結産物から得られた全ての連結産物を増幅できるように、複数のユニバーサルプライマー部配列を包含し得る。いくつかの実施形態では、本教示のコントロールプローブセットは、例えば、Ｃｈｅｎら、米国非仮特許出願第１０／０９０，８３０号、およびＬａｏら、同第１１／０９０，４６８号で議論されているように、数連のユニバーサルアドレスプライマーセットを用いて標的ポリヌクレオチドを検出する各種の連結を介したコード化および解読戦略に関連して用いることができる。
本教示のいくつかの実施形態では、コントロールおよび実験連結産物はＰＣＲにより増幅され、その結果得られる単位複製配列は移動度プローブとハイブリダイズし、それによって標的ポリヌクレオチドの同一性が同定部の同一性に基づいて判定される。本教示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単型性標的ポリヌクレオチド配列は、コントロールプローブを、複数の多型性標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの対応する実験プローブとともに包含する反応において調べられる。いくつかの実施形態では、単型性標的ポリヌクレオチド配列から得られる連結産物および多型性標的ポリヌクレオチド配列から得られる連結産物は、連結反応においてプローブによって導入された同定部（または同定部相補体）と相補的な移動度プローブとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション反応に含まれる移動度プローブのいくつかは、連結産物および／または連結産物代替物のいずれかに見られる同定部とハイブリダイズしない。連結反応のプローブに含まれる同定部と対応しないそのような移動度プローブを含むことにより、例えば、非常に多重化されたアッセイの手順上の工程を容易にすることができる。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、例えば、推定単型性標的ポリヌクレオチド配列に不要な多型が存在する場合、第１プローブおよび／または第２プローブの標的特異部に組み込むことができる。このようなユニバーサル塩基は、例えば、第１プローブおよび／または第２プローブの推定単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力に影響を与え、本教示のいくつかの実施形態に従って所望のハイブリダイゼーションを行なうことができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基を、多型性標的ポリヌクレオチド配列を調べる実験プローブの標的特異部に組み込むことにより、多型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、本教示のいくつかの実施形態に従って所望のハイブリダイゼーションを行なう能力を実験プローブに与えることができる。例えば、ユニバーサル核酸塩基をプローブに組み込んで、注目する多型に近い多型を明らかにすることにより、近くにある多型と混同することなく、プローブが当該多型を調べることが可能になるが、これは、プローブのユニバーサル塩基は、近くにある多型と、その同一性に関係なくハイブリダイズすることができるためである。
多重連結反応のいくつかの実施形態では、本教示は、連結プローブの同定部に対応する複数のプライマーを用いて実施することができる。例えば、ＳＮＰ検出に関しては、連結プローブ１と、ＳＮＰ遺伝子座の２つの対立遺伝子変異型に対応する連結プローブは異なる場合がある。第２プローブは、ユニバーサルプライマー部を包含し得る。連結反応後に、ＰＣＲを行なうことができるが、ＰＣＲのプライマーは、連結プローブ１の同定部に対応するフォワードＰＣＲ、連結プローブ２の同定部に対応するフォワードＰＣＲプライマー、および第２プローブのユニバーサルプライマー部に対応するユニバーサルリバースプライマーを包含する。このような方法により、第１の連結プローブの長さを短縮することが可能である。
多重連結反応のいくつかの実施形態では、本教示は、連結プローブの部分的な同定部に対応する複数のプライマーを用いて実施することができる。例えば、ＳＮＰ検出に関しては、連結プローブ１と、ＳＮＰ遺伝子座の２つの対立遺伝子変異型に対応する連結プローブは、部分的な同定部が異なる。第２プローブは、部分的なユニバーサルプライマー部を含むことができる。連結反応後に、ＰＣＲを行なうことができるが、ＰＣＲのプライマーは、連結プローブ１の部分的な同定部およびプローブ１のさらなる同定部配列に対応するフォワードＰＣＲ、連結プローブ２の部分的な同定部およびプローブ２のさらなる同定部配列に対応するフォワードＰＣＲプライマー、ならびに第２プローブの部分的なユニバーサルプライマー部およびプローブ２のさらなる同定部配列に対応するユニバーサルリバースプライマーを包含する。結果として、ＰＣＲにより、産物中に存在する同定部全体が得られる。次いで、例えば、同定部全体を包含する移動度プローブを用いた検出を行なうことができる。
いくつかの実施形態では、同定部（または部分的な同定部）に対応するプライマー配列は、さらに、同じ５’ユニバーサルプライマー配列を包含し得る。このような方法は、非常に多重化した増幅反応において、異なる同定部に基づくプライマーが多いため、プライマー二量体が過剰に形成されるという問題を減少することができる。ユニバーサルプライマー配列は、同定部プライマー配列よりも高いＴｍを有するように設計することができる。ユニバーサルプライマーおよび同定部プライマーの両方を増幅反応に用いることで、最初の数サイクル（例えば、２〜４回）は、同定部プライマーが連結産物のリバース鎖とアニーリングして伸張させるより低いアッセイ温度で行うことができる。その後、アッセイ温度を上昇させて、反応を推し進め、ユニバーサルプライマーを使用する。
キット
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの連結を評価するキットも本教示において提供される。いくつかの実施形態では、キットは、開示した方法を実施するために必要な２つ以上の成分を組み合わせて、当該方法の性能を高める役割をする。いくつかの実施形態では、キットは、一般に、予め測定した単位量の成分を含有し、エンドユーザによる測定の必要性を最小限に抑える。いくつかの実施形態では、キットは、開示した方法のうちの１つ以上を行なうための指示を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、キットの成分は、相互に協働するように最適化される。
いくつかの実施形態では、ポジティブコントロール連結キットは、ポジティブコントロールプローブセット、実験プローブセット、連結剤、標的ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを包含し得る。いくつかの実施形態では、ネガティブコントロール連結キットは、ネガティブコントロールプローブセット、実験プローブセット、連結剤、標的ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを包含し得る。いくつかの実施形態では、コントロール連結キットは、ネガティブコントロールプローブセット、ポジティブコントロールプローブセット、実験プローブセット、連結剤、標的ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを包含し得る。いくつかの実施形態では、実験連結キットは、実験プローブセット、連結剤、標的ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを包含し得る。いくつかの実施形態では、増幅キットは、プライマー、親和部分プライマー、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを包含する。いくつかの実施形態では、精製キットは、ヌクレアーゼ、グリコシラーゼ、およびそれらの組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ精製キットは、親和部分結合剤および固形支持体を包含する。いくつかの実施形態では、リン酸化キットは、キナーゼを包含する。いくつかの実施形態では、移動度プローブキットは、移動度プローブを包含する。
いくつかの実施形態では、キットは、ポジティブコントロール連結キット、ネガティブコントロール連結キット、コントロール連結キット、実験連結キット、増幅キット、精製キット、ＰＣＲ精製キット、リン酸化キット、移動度プローブキット、およびそれらの組み合わせをまったく包含しないか、またはそれらのうちのいくつかもしくは全てを包含する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの連結手段、少なくとも１つの増幅手段、組み込まれていないおよび／または不要な反応成分を除去する少なくとも１つの手段、少なくとも１つの検出手段、およびそれらの組み合わせを包含するキットが開示される。いくつかの実施形態では、本教示によるキットの構成は、例えば、アプライドバイオシステムズ社のＳＮＰｌｅｘ（登録商標）Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｕｉｄｅで見ることができる。
本教示をこれらの例および例示的な実施形態について説明したが、当業者は、これらの例示的な実施形態に過度の実験を要することなく多くの変形および修正が可能であることを容易に理解する。そのような変形および修正の全てが本教示の範囲内である。
図１は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図２は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図３は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図４は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図５は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図６は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。 図７は、本教示の方法の実施形態のいくつかに有用な組成物を示す。 図８は、本教示のいくつかの方法の実施形態を示す。

Claims (36)

  1. 連結アッセイにおいて連結を判定する方法であって、
    該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列、コントロールプローブセットおよび第２プローブを用意する工程であって、該コントロールプローブセットは、ポジティブコントロール第１プローブおよびネガティブコントロール第１プローブを包含する、工程を包含し、
    前記ポジティブコントロール第１プローブは、標的特異部および同定部を包含し、該標的特異部は識別領域を包含し、
    前記ネガティブコントロール第１プローブは、標的特異部および同定部を包含し、該標的特異部は識別領域を包含し、
    前記ポジティブコントロール第１プローブと前記ネガティブコントロール第１プローブの前記同定部は異なり、
    前記コントロールプローブセットの前記第２プローブは、標的特異部を包含し、
    該方法は、前記第１のポジティブコントロールプローブ、前記第１のネガティブコントロールプローブおよび前記第２プローブを前記単型性標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる工程であって、前記ポジティブコントロールプローブおよび前記ネガティブコントロールプローブは、該単型性標的ポリヌクレオチド配列上の前記第２プローブと隣接してハイブリダイズすることができ、該ポジティブコントロールプローブの前記識別領域は、該単型性標的ポリヌクレオチドとの完全な相補性を得ることができ、該ネガティブコントロールプローブの前記識別領域は、該単型性標的ポリヌクレオチドとの完全な相補性を得ることを妨げる、工程と、
    前記ポジティブコントロール第１プローブを前記第２プローブと連結し、前記ネガティブコントロール第１プローブを該第２プローブと連結することにより、異なる同定部を包含する特異的連結産物および非特異的連結産物を生成する工程と、
    前記非特異的連結産物および前記特異的連結産物を前記ハイブリダイズしていないコントロールプローブおよび連結していないコントロールプローブから分離する工程と、
    前記特異的および非特異的連結産物をそれらの個別の同定部に基づいて検出する工程と、
    特異的連結産物の量と非特異的連結産物を比較する工程と、
    を包含する、連結アッセイにおいて連結を評価する、方法。
  2. 多型性ポリヌクレオチド標的配列および実験プローブセットをさらに包含し、該実験プローブセットは、実験第１プローブ１、実験第１プローブ２および実験第２プローブを包含し、
    前記実験第１プローブ１は、同定部および前記多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、識別領域を包含し、
    前記実験第１プローブ２は、同定部および前記多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、識別領域を包含し、
    前記実験第１プローブ１の前記同定部は、前記実験第１プローブ２の前記同定部とは異なり、
    前記実験第１プローブ１の前記識別領域は、前記実験第１プローブ２の前記識別領域とは異なり、
    前記第２の実験プローブは、前記多型性ポリヌクレオチド標的配列と相補的な標的特異部を包含し、
    前記実験第１プローブの前記識別領域は、単一ヌクレオチド多型の異なる対立遺伝子に対応する異なるヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、
    前記実験第１プローブは、前記多型性標的ポリヌクレオチド配列上の前記実験第２プローブと隣接してハイブリダイズし、
    該方法は、前記実験第１プローブ１と前記接触してハイブリダイズした実験第２プローブを連結し、前記実験第１プローブ２と前記接触してハイブリダイズした第２プローブを連結することにより、単一ヌクレオチド多型の２つの対立遺伝子に対応する異なる同定部を包含する特異的連結産物を生成する工程と、
    前記特異的連結産物および前記非特異的連結産物を前記ハイブリダイズしていない実験第１プローブおよび実験第２プローブ、ならびに連結していない実験第１プローブおよび実験第２プローブから分離する工程と、
    前記特異的および非特異的連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と、
    特異的連結産物の量と前記コントロールプローブセットから生じた非特異的連結産物を比較する工程と、
    前記コントロールプローブセットから生じた前記連結産物と前記実験プローブセットから生じた前記連結産物とを比較する工程と、
    をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記連結産物はＰＣＲにより増幅される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＰＣＲは親和部分が標識されたプライマーを包含する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記プローブの前記同定部は、得られたＰＣＲ単位複製配列に組み込まれ、該方法は、
    親和部分が標識された単位複製配列鎖を親和部分結合パートナーに固定する工程と、
    前記親和部分を有さない反応成分を除去する工程と、
    複数の移動度プローブを前記固定された親和部分が標識された単位複製配列鎖とハイブリダイズさせる工程であって、該移動度プローブは、該親和部分が標識された単位複製配列鎖の前記同定部または同定部相補体と相補的な領域をさらに包含する、工程と、
    ハイブリダイズしていない移動度プローブを除去する工程と、
    ハイブリダイズされた移動度プローブを溶出する工程と、
    前記溶出された移動度プローブを移動度依存分析技術を用いて分析し、該移動度プローブの個別の移動度により前記同定部の同一性を判定する工程と、
    をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記移動度プローブは、識別可能な標識をさらに包含し、該識別可能な標識は、少なくとも１つの蛍光プローブをさらに包含し、該蛍光プローブは、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｔａｍｒａ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｒｏｘ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記移動度依存分析技術はキャピラリー電気泳動である、請求項５に記載の方法。
  8. 前記親和部分はビオチンである、請求項４に記載の方法。
  9. 前記親和部分結合パートナーはストレプトアビジンである、請求項５に記載の方法。
  10. ユニバーサルフォワードプライマー部が前記第１プローブに組み込まれ、ユニバーサルリバースプライマー部が前記第２プローブに組み込まれ、前記ＰＣＲ増幅は、それぞれの対応するプライマー部とハイブリダイズする一組のユニバーサルプライマーを包含する、請求項５に記載の方法。
  11. 連結アッセイにおいて連結を検出する方法であって、
    該方法は、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびポジティブコントロールプローブセットを包含する第１の反応を用意する工程であって、該ポジティブコントロールプローブセットは、ポジティブコントロール第１プローブ１、ポジティブコントロール第１プローブ２、および第２プローブを包含する、工程を包含し、
    前記ポジティブコントロール第１プローブ１は、同定部および前記単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、該単型性ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドと相補的な識別領域を包含し、
    前記ポジティブコントロール第１プローブ２は、同定部および前記単型性標的ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、該単型性ポリヌクレオチド配列上の対応するヌクレオチドと相補的な識別領域を包含し、
    前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部とは異なり、
    前記第２プローブは標的特異部を包含し、
    該方法は、前記単型性標的ポリヌクレオチド配列を前記ポジティブコントロール第１プローブ１、前記ポジティブコントロール第１プローブ２、および前記ポジティブコントロール第２プローブとハイブリダイズさせる工程であって、該ポジティブコントロール第１プローブは、前記第２プローブと隣接してハイブリダイズする、工程と、
    前記ポジティブコントロール第１プローブ１を前記ポジティブコントロール第２プローブと連結し、前記ポジティブコントロール第１プローブ２を前記ポジティブコントロール第２プローブと連結することにより、ポジティブコントロール第１プローブ１連結産物およびポジティブコントロール第１プローブ２連結産物を形成する工程と、
    前記ポジティブコントロール第１プローブ１連結産物および前記ポジティブコントロール第１プローブ２連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と、
    を包含することにより、連結を評価する、方法。
  12. 請求項１１に記載の方法であって、第２の反応をさらに包含し、該第２の反応は、単型性標的ポリヌクレオチド配列およびネガティブコントロールプローブセットを包含し、該ネガティブコントロールプローブセットは、ネガティブコントロール第１プローブ１、ネガティブコントロール第１プローブ２、および第２プローブを包含し、
    前記ネガティブコントロール第１プローブ１は、同定部および前記単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、該単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的でない識別領域を包含し、
    前記ネガティブコントロール第１プローブ２は、同定部および前記単型性ポリヌクレオチド配列と相補的な標的特異部を包含し、該標的特異部は、前記単型性標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的でない識別領域をさらに包含し、
    前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部とは異なり、
    前記第２プローブは、標的特異部を包含し、
    該方法は、前記単型性標的ポリヌクレオチド配列を前記ネガティブコントロール第１プローブ１、前記ネガティブコントロール第１プローブ２、および前記ネガティブコントロール第２プローブとハイブリダイズさせる工程であって、該ネガティブコントロール第１プローブは該第２プローブと隣接してハイブリダイズする、工程と、
    前記ネガティブコントロール第１プローブ１を前記ネガティブコントロール第２プローブと連結し、前記ネガティブコントロール第１プローブ２を前記ネガティブコントロール第２プローブと連結することにより、ネガティブコントロール第１プローブ１連結産物およびネガティブコントロール第１プローブ２連結産物を形成する工程と、
    前記ネガティブコントロール第１プローブ１連結産物および前記ネガティブコントロール第１プローブ２連結産物を、それらの個別の同定部に基づいて検出する工程と、
    前記第１の反応において検出された非特異的連結産物と前記第２の反応において検出された特異的連結産物とを比較する工程と、
    をさらに包含することにより、連結アッセイにおいて非特異的連結を評価する、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、前記連結産物はＰＣＲにより増幅され、該ＰＣＲは親和部分を含有するプライマーを包含し、前記プローブの前記同定部および該プライマーの該親和部分がＰＣＲ単位複製配列に組み込まれることにより、親和標識されたＰＣＲ単位複製配列鎖を形成し、該方法は、
    前記親和部分が標識された単位複製配列鎖を親和部分結合パートナーに固定する工程と、
    前記親和部分を有さない反応成分を除去する工程と、
    移動度プローブを前記固定された親和部分が標識された単位複製配列鎖とハイブリダイズさせる工程であって、該移動度プローブは、該親和部分が標識された単位複製配列鎖の前記同定部または同定部相補体と相補的な領域をさらに包含する、工程と、
    ハイブリダイズしていない移動度プローブを除去する工程と、
    ハイブリダイズした移動度プローブを溶出する工程と、
    前記溶出した移動度プローブを、移動度依存分析技術を用いて分析し、該移動度プローブの前記個別の移動度により、前記同定部の同一性を判定して連結を評価する工程と、
    をさらに包含する、方法。
  14. 前記移動度プローブは、識別可能な標識をさらに包含し、該識別可能な標識は、少なくとも１つの蛍光プローブをさらに包含し、該蛍光プローブは、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｔａｍｒａ、ＢｉｇＤｙｅ−Ｒｏｘ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記移動度依存分析技術はキャピラリー電気泳動である、請求項１３に記載の方法。
  16. ユニバーサルフォワードプライマー部が前記第１プローブに組み込まれ、ユニバーサルリバースプライマー部が前記第２プローブに組み込まれ、前記ＰＣＲ増幅は、それぞれの対応するプライマー部とハイブリダイズする一組のユニバーサルプライマーを包含する、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記ポジティブコントロールプローブセットを用いた前記第１の反応において調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチド配列は、前記ネガティブコントロールプローブセットを用いて前記第２の反応において調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じである、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記第１のポジティブコントロールプローブセット内の前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記第１のネガティブコントロールプローブセット内の前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部と同じであり、該第１のポジティブコントロールプローブセット内の前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部は、該第１のネガティブコントロールプローブセット内の前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部と同じである、請求項１２に記載の方法。
  19. 前記第１のポジティブコントロールプローブセットを用いて前記第１の反応において調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチド配列は、前記ネガティブコントロールプローブセットを用いて前記第２の反応において調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチド配列と同じであり、該第１のポジティブコントロールプローブセット内の前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、該第１のネガティブコントロールプローブセット内の前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部と同じであり、該第１のポジティブコントロールプローブセット内の前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部は、該第１のネガティブコントロールプローブセット内の前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部と同じである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１の反応および第２の反応は、同じマイクロタイタープレートの２つの異なるウェルで行なわれる、請求項１９に記載の方法。
  21. 連結アッセイにおいて連結特異性を判定する方法であって、該方法は、
    特異的ポジティブコントロール連結産物の量を非特異的ネガティブコントロール連結産物と比較する工程を包含し、
    前記特異的ポジティブコントロール連結産物は、第１のポジティブコントロールプローブを、単型性標的ポリヌクレオチド上にハイブリダイズさせた第２プローブと連結することにより得られ、
    前記非特異的ネガティブコントロール連結産物は、第１のネガティブコントロールプローブを、単型性標的ポリヌクレオチド上にハイブリダイズさせた第２プローブと連結することにより得られ、
    前記特異的連結産物の前記第１のポジティブコントロールプローブは、前記非特異的連結産物の前記第１のネガティブコントロールプローブとは識別領域のみが異なり、
    前記第１のポジティブコントロールプローブにより調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチドは、前記第１のネガティブコントロールプローブにより調べられる前記単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    該方法は、前記特異的ポジティブコントロール連結産物の量と前記非特異的ネガティブコントロール連結産物の差を定量化する工程を包含し、
    それによって連結アッセイにおいて連結特異性を判定する、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法であって、
    実験連結産物の量と前記特異的ポジティブコントロール連結産物の量および前記非特異的ネガティブコントロール連結産物の量とを比較する工程を包含し、
    前記実験連結産物、前記特異的ポジティブコントロール連結産物、および前記非特異的ネガティブコントロール連結産物は同じ連結反応から得られ、
    それによって、連結アッセイにおいて前記実験連結産物の連結特異性を判定する工程を包含する、方法。
  23. 並行連結アッセイにおいて特異的連結のばらつきを評価する方法であって、
    該方法は、第１の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物の量と第２の反応における特異的ポジティブコントロール連結産物を比較する工程を包含し、
    前記第１の反応における前記特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、該ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第２の反応における前記特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、該ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第１の反応の前記第１のポジティブコントロールプローブは、前記第２の反応の前記第１のポジティブコントロールプローブと相違せず、該第１の反応の前記第２プローブは、該第２の反応の前記第２プローブと相違せず、
    前記第１の反応において前記ポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、前記第２の反応において前記ポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    該方法は、前記第１の反応における前記特異的連結産物の量と前記第２の反応における前記特異的連結産物の量の差を定量化する工程を包含し、
    それによって、並行連結アッセイにおいて特異的連結のばらつきを評価する、方法。
  24. 前記第１の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、該第１の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、前記第２の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、該第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、該第１の反応において調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドは、該第２の反応で調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロールプローブセットの前記ポジティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    前記第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロールセットの前記ポジティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第１の反応における前記ポジティブコントロール第１プローブの前記同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第２の反応における前記ポジティブコントロール第１プローブの前記同定部と同じである、請求項２３に記載の方法。
  25. 各ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２を包含し、該第１のポジティブコントロールプローブ１および該第１のポジティブコントロールプローブ２は各々、同定部を包含し、該第１のポジティブコントロールプローブ１の該同定部は、該第１のポジティブプローブ２の該同定部とは異なり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部と同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部と同じである、請求項２４に記載の方法。
  26. 並行連結アッセイにおいて非特異的連結のばらつきを評価する方法であって、該方法は、
    第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物の量と第２の反応おける非特異的ネガティブコントロール連結産物を比較する工程を包含し、
    前記第１の反応における前記非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、該ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第２の反応における前記非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、該ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第１の反応の前記第１のネガティブコントロールプローブは、前記第２の反応における前記第１のネガティブコントロールプローブとは相違せず、該第１の反応の前記第２プローブは、該第２の反応の前記第２プローブとは相違せず、
    前記第１の反応において前記ネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、前記第２の反応において前記ネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    該方法は、前記第１の反応における前記非特異的連結産物の量と前記第２の反応における非特異的連結産物の量の差を定量化する工程を包含し、
    それによって、連結アッセイにおける非特異的連結のばらつきを評価する、方法。
  27. 前記第１の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、該第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、前記第２の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、該第２の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、該第１の反応において調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドは、該第２の反応において調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロールプローブセットの前記ネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    前記第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロールセットの前記ネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第１の反応における前記ネガティブコントロール第１プローブの前記同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第２の反応における前記ネガティブコントロール第１プローブの前記同定部と同じである、請求項２６に記載の方法。
  28. 各ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２を包含し、該第１のネガティブコントロールプローブ１および該第１のネガティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、該第１のネガティブコントロールプローブ１の該同定部は、該第１のネガティブプローブ２の該同定部とは異なり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部と同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部と同じである、請求項２７に記載の方法。
  29. 並行連結アッセイにおいて非特異的および特異的連結のばらつきを評価する方法であって、該方法は、
    第１の反応における非特異的ネガティブコントロール連結産物の量と第２の反応における特異的コントロール連結産物とを比較する工程を包含し、
    前記第１の反応における前記非特異的ネガティブコントロール連結産物は、ネガティブコントロールプローブセットから得られ、該ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第２の反応における前記特異的ポジティブコントロール連結産物は、ポジティブコントロールプローブセットから得られ、該ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブおよび第２プローブを包含し、
    前記第１の反応の前記第１のネガティブコントロールプローブは、前記第２の反応の前記第１のポジティブコントロールプローブとは識別領域が異なるだけであり、該第１の反応の前記第２プローブは、該第２の反応の前記第２プローブとは相違せず、
    前記第１の反応において前記ネガティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドは、前記第２の反応において前記ポジティブコントロールプローブセットによって調べられる単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    該方法は、前記第１の反応における前記非特異的連結産物の量と前記第２の反応における前記特異的連結産物の量の差を定量化する工程を包含し、
    それによって、連結アッセイにおける特異的および非特異的連結のばらつきを評価する、方法。
  30. 前記第１の反応は、複数のネガティブコントロールプローブセットを包含し、該第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、前記第２の反応は、複数のポジティブコントロールプローブセットを包含し、該第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、異なる単型性標的ポリヌクレオチドを調べ、該第１の反応において調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドは、該第２の反応において調べられる該単型性標的ポリヌクレオチドと同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロールプローブセットの前記ネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    前記第２の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロールセットの前記ネガティブコントロール第１プローブは、同定部を包含し、
    所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第１の反応における前記ネガティブコントロール第１プローブの前記同定部は、同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記第２の反応における前記ポジティブコントロール第１プローブの前記同定部と同じである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第１の反応における各ネガティブコントロールプローブセットは、第１のネガティブコントロールプローブ１および第１のネガティブコントロールプローブ２を包含し、該第１のネガティブコントロールプローブ１および該第１のネガティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、該第１のネガティブコントロールプローブ１の該同定部は、該第１のネガティブプローブ２の該同定部とは異なり、
    前記第２の反応における各ポジティブコントロールプローブセットは、第１のポジティブコントロールプローブ１および第１のポジティブコントロールプローブ２を包含し、該第１のポジティブコントロールプローブ１および該第１のポジティブコントロールプローブ２の各々は、同定部を包含し、該ポジティブコントロール第１プローブ１の該同定部は、該第１のポジティブプローブ２の該同定部とは異なり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ１の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ１の前記同定部と同じであり、
    前記第１の反応において所与の単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ネガティブコントロール第１プローブ２の前記同定部は、前記第２の反応において同じ単型性標的ポリヌクレオチドを調べる前記ポジティブコントロール第１プローブ２の前記同定部と同じである、請求項３０に記載の方法。
  32. ポジティブコントロールプローブセット、ネガティブコントロールプローブセット、実験プローブセット、およびそれらの組み合わせを備える、連結を評価するキット。
  33. 複数のポジティブコントロールプローブセットを備える、連結を評価するキット。
  34. 複数のネガティブコントロールプローブセットを備える、連結を評価するキット。
  35. 複数の単型性標的ポリヌクレオチド、複数の多型性標的ポリヌクレオチド、連結する手段、リン酸化する手段、増幅する手段、およびそれらの組み合わせをさらに備える、請求項３２、３３、３４のいずれかに記載のキット。
  36. 連結特異性を判定する方法であって、
    ハイブリダイズさせる工程と、
    連結する工程と、
    増幅する工程と、
    除去する工程と、
    分離する工程と、
    検出する工程と、
    比較する工程と、
    上記工程から連結特異性を判定する工程と、
    を包含する、方法。
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