CN112143752B - 真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用 - Google Patents

真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用。所述载体其表达区包括用于表达组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白的重组融合蛋白表达序列，所述重组融合蛋白表达序列，包括含有核定位信号的组蛋白表达序列和荧光蛋白表达序列；所述组蛋白表达序列与荧光蛋白表达序列处于同一启动子的阅读框中，其中所述组蛋白表达序列缺失终止密码子且连接于荧光蛋白表达序列上游；所述重组融合蛋白表达序列具有核定位信号，用于表达重组融合蛋白。含有所述表达载体且具有侵染目标真菌细胞能力的重组体，可作为标记真菌细胞的细胞核的标记试剂，能准确地定位到细胞核中，经激发发出荧光，从而安全、永久的标记目标真菌细胞的细胞核。

Description

真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用
技术领域
本发明属于真菌生物技术领域，更具体地，涉及一种真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用，尤其是一种形成子实体的大型真菌的细胞核荧光标记表达载体、试剂、制备方法及应用。
背景技术
细胞核标记对于细胞核定位、细胞学研究、以及生物应用技术的开发有着重要意义。例如标记羊肚菌的细胞核，可以观察细胞核的行为，特别是在菌丝交配核迁移、以及食用菌杂交育种等方面的研究有着重要作用。
然而细胞核的标记方法，大多使用有机荧光染料进行标记，如4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)，有机荧光染料染色虽然灵敏度较高、特异性较强，使用方便，但是有机染料的标记原理是进入活细胞中与DNA结合，通过荧光激发光成像，因此不可避免的对生物体本身具有毒害作用，一方面在使用过程中可能造成环境污染、以及对实验人员可能造成伤害，另一方面其影响被标记的对象正常的生理活动，从而影响实验观测。同时采用荧光染料标记存在着荧光信号易淬灭的问题，多重因素造成现有的细胞核标记方法，不便于对活细胞菌丝体进行系统全面的观察。
中国专利文件CN109097397A提供了一种将荧光蛋白定位在细胞核中，从而永久标记活细胞的细胞核的标记方法。这种细胞核标记方法不影响细胞的正常生活，可以安全系统的观察细胞的活动。
然而这一方法，由于载体具有严格的选择性，因此只适合人类细胞的细胞核标记。真菌细胞的细胞核标记，由于真菌细胞结构复杂多样，进化上与动物、植物亲缘关系较远，因此适用于动植物的转基因方法简单的更换载体难以移植到真菌中。尤其是对于形成子实体的大型真菌，由于其生命周期的发育过程复杂，因此这一建立在转基因技术上的细胞核标记方法，难以成功地在形成子实体的大型真菌上实现。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用，其目的在于，通过采用组蛋白与荧光蛋白的融合蛋白表达序列代替现有的核定位信号修饰的荧光蛋白表达序列，更有效的将融合蛋白定位到细胞核中，由此将现有的转基因永久标记细胞核的技术移植到真菌中，解决无法准确地定位到细胞核的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种真菌细胞核荧光标记的表达载体，其表达区包括用于表达组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白的重组融合蛋白表达序列，所述重组融合蛋白表达序列，包括含有核定位信号的组蛋白表达序列和荧光蛋白表达序列；所述组蛋白表达序列与荧光蛋白表达序列处于同一启动子的阅读框中，其中所述组蛋白表达序列缺失终止密码子且连接于荧光蛋白表达序列上游；所述重组融合蛋白表达序列具有核定位信号，用于表达重组融合蛋白。
优选地，所述真菌细胞核荧光标记的表达载体，其所述重组融合蛋白表达序列用于表达重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括正确折叠的组蛋白亚基和荧光蛋白亚基。
优选地，所述真菌细胞核荧光标记的表达载体，其所述组蛋白为H2B蛋白；所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白，优选为红色荧光蛋白；优选，所述组蛋白表达序列连接与荧光蛋白表达序列之间具有多克隆位点。
优选地，所述真菌细胞核荧光标记的表达载体，其所述组蛋白的氨基酸序列为：
1)SEQ ID NO.1所示的序列；或
2)与序列SEQ IDNo.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
3)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
所述组蛋白表达序列为优选为：SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述真菌细胞核荧光标记的表达载体，其表达区还包括用于表达筛选标记的筛选标记基因序列；
还包括用于启动所述重组融合蛋白表达序列的第一启动子、以及用于启动所述筛选标记基因序列的第二启动子，所述第一、第二启动子，为待标记的目标真菌细胞的高保守基因强启动子，优选所述第一启动子与第二启动子为不同类型的启动子，分别调控融合蛋白的表达和筛选标记基因的表达。
优选地，所述真菌细胞核荧光标记的表达载体，其所述表达载体，用于标记羊肚菌细胞核，其表达区还包括用于表达用作筛选标记基因的潮霉素基因序列；所述第一、第二启动子优选为：羊肚菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子、或羊肚菌泛素基因启动子；所述表达载体改造自pCAMPIA 1300。
按照本发明的另一个方面提供了一种细胞核标记试剂，其包括含有本发明提供的真菌细胞核荧光标记的表达载体且具有目标真菌细胞侵染能力的重组体；优选，所述细胞核标记试剂，用于标记羊肚菌细胞核，所述重组体为农杆菌，优选为农杆菌EHA105。
按照本发明的另一个方面，提供了一种本发明提供的真菌细胞核荧光标记的表达载体的制备方法，其包括以下步骤：
克隆含有核定位信号序列的组蛋白基因序列，将所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列连接到含有荧光蛋白序列的表达载体的表达区上，使得所述组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游；
优选所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列为H2B基因序列，其核苷酸序列为：
4)SEQ ID NO.2；
5)与SEQ ID NO.2序列的同源性在80％以上翻译为1)、2)、3)所示氨基酸序列的核酸序列；
6)在中度严谨条件下能与4)的序列杂交的核酸序列；
优选地，还包括以下步骤：
以目标真菌DNA为模板，设计引物扩增第一和/或第二启动子，利用同源重组的方法，将扩增得到的两侧含有载体核苷酸序列的启动子连接到表达载体表达区的融合蛋白表达序列和/或筛选标记基因表达序列的上游。
优选，采用感受态细胞扩增所述表达载体，具体操作为将所述表达载体转化感受态细胞，繁殖提取质粒；所述感受态细胞优选为大肠杆菌感受态细胞。
具体为：
(1)克隆获得含有核定位信号序列的组蛋白基因序列；
(2)将步骤(1)所述序列连接到羊肚菌含有荧光蛋白序列的表达载体上，其中组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游，获得重组表达载体；
(3)将步骤(2)获得的重组表达载体扩增：转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒。
按照本发明的另一个方面，提供了本发明提供的细胞核标记试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用本发明提供的表达载体转化具有待标记的目标真菌细胞侵染能力的载体，获得重组体；优选还包括对所述微生物进行培养后筛选阳性重组体；具体为：
将重组表达载体转化可用于侵染羊肚菌的农杆菌，培养后筛选阳性农杆菌，获得含有重组表达载体的农杆菌。
按照本发明的另一个方面，提供了本发明提供的细胞核标记试剂的应用，其应用于标记真菌细胞的细胞核；特别地，应用于标记形成子实体的大型真菌的细胞核；更特别地，应用于标记羊肚菌的细胞核；包括步骤：采用所述细胞核标记试剂侵染并转化待标记的目标真菌细胞；具体为：
将所述农杆菌侵染羊肚菌菌丝，培养后筛选阳性转化子，获得荧光标记细胞核的目的细胞。
优选还包括步骤：将侵染后的目标真菌细胞置于针对筛选标记基因的培养环境中，筛选出表达筛选标记基因的目标真菌细胞转化子；具体为：
农杆菌侵染羊肚菌菌丝后，在含有潮霉素的CYM培养基上进一步筛选阳性转化子，获得含有核定荧光标记的羊肚菌菌丝；
优选侵染时所述农杆菌菌液OD600为0.6-0.8，侵染时间为40至60min；侵染后所述羊肚菌菌丝在含乙酰丁香酮200μmol/L的共培养培养基中培养。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的真菌细胞核荧光标记的表达载体，进入目标真菌细胞之后，能表达组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白，具有核定位信号，能准确的定位到细胞核中，经激发发出荧光，从而安全、永久的标记目标真菌细胞的细胞核。
优选方案，选择H2B组蛋白与荧光蛋白融合，荧光信号更强。尤其是H2B组蛋白与红色荧光蛋白融合形成的重组融合蛋白，在应用于羊肚菌细胞核标记时，呈现较高的荧光信号，成像清晰、定位准确，且不影响羊肚菌细胞的正常生理活动。
本发明提供的羊肚菌细胞核的表达载体，能安全、永久的标记其细胞核，从而系统、准确地观察活细胞在各种条件下的细胞核行为，不影响细胞的生长和活动，对于羊肚菌菌丝体交配过程中核迁移的研究具有很大帮助，对于羊肚菌杂交育种研究具有重要意义，因此具有良好的应用前景和发展空间。
附图说明
图1是本发明提供的真核细胞荧光标记表达载体结构示意图；
图2是本发明实施例1中H2B-F和H2B-R引物扩增后的电泳图。M：BM2000 Marker；泳道1-4分别为4个单菌落扩增结果；泳道5为无菌水阴性对照；
图3是实施例2中yzm-F和yzm-R引物扩增后的电泳图。M：BM2000 Marker；泳道1为M04M26 DNA阴性对照，泳道2为重组质粒pHYG-H2B-mCherry-MI阳性对照，泳道3-15分别为13个转化子DNA扩增结果；
图4是实施例2中羊肚菌转化子菌丝在白光和荧光视野下细胞核情况；
图5是实施例2中菌株M04M26和三代转化子菌丝在白光和荧光视野下细胞核情况；
图6是对比例采用SV40核定位序列和绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的荧光视野下图像。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的真菌细胞核荧光标记的表达载体，如图1所示，其表达区包括用于表达组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白的重组融合蛋白表达序列、以及用于表达筛选标记的筛选标记基因序列。
所述重组融合蛋白表达序列，包括含有核定位信号的组蛋白表达序列和荧光蛋白表达序列；所述组蛋白表达序列与荧光蛋白表达序列处于同一启动子的阅读框中，其中所述组蛋白表达序列缺失终止密码子且连接于荧光蛋白表达序列上游；所述重组融合蛋白表达序列用于表达重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括正确折叠的组蛋白亚基和荧光蛋白亚基，其具有核定位信号。
所述组蛋白为H2B蛋白；所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(mCherry)，优选为红色荧光蛋白；优选，所述组蛋白表达序列与荧光蛋白表达序列之间具有多克隆位点。
所述组蛋白的氨基酸序列为：
1)SEQ ID NO.1所示的序列；或
2)与序列SEQ IDNo.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
3)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
所述组蛋白表达序列为优选为：SEQ ID NO.2所示的序列。
现有的转基因永久标记方法，是将荧光蛋白基因上游连接SV40基因的核定位信号表达序列。然而实验显示，在真菌中融合表达SV40核定位序列，并不能使荧光蛋白成功定位到细胞核中，其分布在细胞核与细胞质中，造成背景荧光明显，不能准确标记细胞核，例如双色蜡蘑(Laccaria bicolor)。本发明采用含有核定位信号的组蛋白与荧光蛋白融合，可能是由于组蛋白高度的保守性，采用真菌内源性的组蛋白H2B，能成功地使组蛋白和荧光蛋白的融合蛋白定位到细胞核中，而不会由于荧光蛋白本身的外源性导致定位失败。
一般来说融合蛋白构建的关键问题在于两蛋白之间的接头序列，即连接肽，他的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。容易理解，如果融合蛋白的接头序列导致免疫原性问题，则会严重影响融合蛋白的细胞核定位，本发明采用H2B蛋白与荧光蛋白融合，其不需要连接肽即可获得正确折叠的组蛋白亚基和荧光蛋白亚基，有效避免了免疫原性，能够准确定位到细胞核中。
所述表达载体，还包括用于启动所述重组融合蛋白表达序列的第一启动子、以及用于启动所述筛选标记基因序列的第二启动子，所述第一、第二启动子，为待标记的目标真菌细胞的高保守基因强启动子，优选所述第一启动子与第二启动子为不同类型的启动子，分别调控融合蛋白的表达和筛选标记基因的表达。
组蛋白(histones)是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含有核定位信号(nuclear localization signal,NLS)，核定位信号通常含有4-8个氨基酸序列，使蛋白能进入细胞核，且完成核输入后不被切除。本发明的载体将融合表达组蛋白和荧光蛋白，其含有核定位信号序列，同时具有高度保守的一级、二级以及三级结构，使得其成功进入真菌细胞核的概率与核定位信号修饰的荧光蛋白相比大大增加，因此本发明提供的表达载体能更好的永久标记细胞核。
优选所述表达载体，用于标记羊肚菌细胞核，其表达区还包括用于表达用作筛选标记基因的潮霉素基因序列；所述第一、第二启动子优选为：羊肚菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)启动子、或羊肚菌泛素基因(ubiquitin)启动子；所述表达载体为pHYG-H2B-mCherry-MI载体，改造自pCAMPIA 1300。
本发明提供的真菌细胞核荧光标记载体，尤其适用于能形成子实体的大型真菌例如羊肚菌的表达载体，能安全、永久的标记其细胞核，从而系统、准确的观察活细胞在各种条件下的细胞核行为，不影响细胞的生长和活动。
一种细胞核标记试剂，包括含有本发明提供的真菌细胞核荧光标记的表达载体且具有目标真菌细胞侵染能力的重组体。
优选，所述细胞核标记试剂，用于标记羊肚菌细胞核，所述重组体为农杆菌，优选为农杆菌EHA105。
本发明提供的表达载体的制备方法，包括以下步骤：
克隆含有核定位信号序列的组蛋白基因序列，将所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列连接到含有荧光蛋白序列的表达载体的表达区上，使得所述组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游；
所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列为H2B基因序列，其核苷酸序列为：
4)SEQ ID NO.2；
5)与SEQ ID NO.2序列的同源性在80％以上翻译为1)、2)、3)所示氨基酸序列的核酸序列；
6)在中度严谨条件下能与4)的序列杂交的核酸序列。
本发明中采用在克隆序列的引物中人为加上含有限制性内切酶酶切位点的同源臂，这样所得的序列两侧可以引入酶切位点，方便载体构建。
优选地，克隆筛选标记基因插入到所述表达载体的表达区；
优选地，还包括以下步骤：
以目标真菌DNA为模板，设计引物扩增第一和/或第二启动子，利用同源重组的方法，将扩增得到的两侧含有载体核苷酸序列的启动子连接到表达载体表达区的融合蛋白表达序列和/或筛选标记基因表达序列的上游。
优选，采用感受态细胞扩增所述表达载体，具体操作为将所述表达载体转化感受态细胞，繁殖提取质粒；所述感受态细胞优选为大肠杆菌感受态细胞。
具体为：
(1)克隆获得含有核定位信号序列的组蛋白基因序列；
(2)将步骤(1)所述序列连接到羊肚菌含有荧光蛋白序列的表达载体上，其中组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游，获得重组表达载体；
(3)将步骤(2)获得的重组表达载体扩增：转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒；
本发明提供的细胞核标记试剂的制备方法，包括以下步骤：
采用本发明提供的表达载体转化具有待标记的目标真菌细胞侵染能力的载体，获得重组体，优选对所述微生物进行培养后筛选阳性重组体。所述载体携带外源基因在目标真菌细胞中具备独立复制和表达能力。
具体为：将重组表达载体转化可用于侵染羊肚菌的农杆菌，培养后筛选阳性农杆菌，获得含有重组表达载体的农杆菌；
所述细胞核标记试剂的应用，其应用于标记真菌细胞的细胞核；特别地，应用于标记形成子实体的大型真菌的细胞核；更特别地，应用于标记羊肚菌的细胞核；包括步骤：采用所述细胞核标记试剂侵染并转化待标记的目标真菌细胞；具体为：
将所述农杆菌侵染羊肚菌菌丝，培养后筛选阳性转化子，获得荧光标记细胞核的目的细胞。
优选还包括步骤：将侵染后的目标真菌细胞置于针对筛选标记基因的培养环境中，筛选出表达筛选标记基因的目标真菌细胞转化子；具体为：
农杆菌侵染羊肚菌菌丝后，在含有潮霉素的CYM培养基上进一步筛选阳性转化子，获得含有核定荧光标记的羊肚菌菌丝。
优选侵染时所述农杆菌菌液OD600为0.6-0.8，侵染时间为40至60min；侵染后所述羊肚菌菌丝在含乙酰丁香酮200μmol/L的共培养培养基中培养。
即使有良好的表达载体，由于物种特异性，转化体系的选择仍然是羊肚菌转基因技术成功的关键之一，影响转化效率的因素主要有农杆菌的种类、侵染时农杆菌的浓度和侵染时间、共培养的温度和时间、乙酰丁香酮(AS)的使用浓度等众多因素相关。
目标真菌细胞转化子，表达含有核定位信号的组蛋白和荧光蛋白组成的融合蛋白，由于定位信号的存在，所述融合蛋白进入细胞核中，并且能在激发光的照射下产生荧光，从而标记细胞核。所述融合蛋白由于具有组蛋白的特性，因此不仅能准确的标记细胞核的位置，同时能活体标记，便于观察后续的细胞核反应。
所述筛选标记基因能准确筛选出被标记的目标真菌细胞。例如对于羊肚菌细胞核进行标记，所述筛选标记基因选择潮霉素基因，因此被标记的羊肚菌细胞能表达潮霉素，在含有潮霉素的CYM培养基上进行筛选，即能获得阳性转化子，即含有核定位荧光标记的羊肚菌菌丝。
以下为实施例：
实施例1：表达载体构建
设计组蛋白H2B核苷酸序列的引物，送至武汉天一辉远生物科技公司合成，上游引物序列H2B-F如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列H2B-R如SEQ ID NO.4所示。以梯棱羊肚菌M04M26 DNA为模板，进行PCR扩增。扩增反应体系(50μL)：模板DNA 100ng，引物(10μM)各2μL，dNTP Mix(10mM)1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(1U/μL)1μL，补ddH2O至50μL。反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环数34，72℃延伸10min。产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，用San Prep柱式DNA回收试剂盒(生工)回收目的片段。
用限制性内切酶SmaI和HindⅢ(New England Biolabs)对质粒pHYG-mCherry进行双酶切，37℃完全酶切2h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用San Prep柱式DNA回收试剂盒(生工)回收大片段(约9.6kb)。利用同源重组的方法将H2B目的片段和质粒pHYG-mCherry酶切产物进行连接。连接反应体系(10μL)：H2B片段1μL，质粒酶切产物4μL，2×BasicAssembly Mix 5μL。将所有溶液轻柔混匀，于50℃反应15min后，立即转至冰水浴中冷却1min。将反应产物转化至大肠杆菌DH5α(唯地)中，转化方法按照DH5αChemicallyCompetent Cell产品说明书进行。
质粒pHYG-mCherry，改造自pCAMPIA 1300，增加了羊肚菌泛素基因启动子、三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子和红色荧光蛋白(mCherry)序列。
pCAMPIA 1300载体为植物高效双元表达载体，含有M13F和M13R引物序列，便于验证载体序列。
转化后挑取挑取单克隆菌落，利用H2B-F(SEQ ID NO.3)和H2B-R(SEQ ID NO.4)引物进行菌落PCR验证，扩增片段的大小与预期片段H2B大小相一致(图2)。提取阳性克隆的质粒，进行质粒酶切验证、测序验证，测序结果与SEQ ID NO:2所示一致，表明重组载体pHYG-H2B-mCherry-MI(如图1所示)构建成功，获得本发明的用于标记羊肚菌细胞核的表达载体。
实施例2：获得稳定细胞核荧光标记的羊肚菌菌丝
将重组质粒pHYG-H2B-mCherry-MI转化至农杆菌EHA105(唯地)中，转化方法按照EHA105 Chemically Competent Cell产品说明书进行。将含有重组质粒的农杆菌划线培养2d，挑取单菌落于1mL LB(20μg/mL Rif+，50μg/mL Kan+)培养液中，200r/min 28℃培养1d后加入到100mL MM(50μg/mL Kan+)液体培养基中200r/min 28℃培养1d。收集菌液，7000r/min离心5min，去上清后，用等体积IM培养液重悬，并用IM稀释至OD600＝0.4，添加乙酰丁香酮(AS)至浓度为200μmol/L，于200r/min 28℃培养6h至OD600＝0.6-0.8。
羊肚菌菌株M04M26菌丝在CYM固体培养基上活化后，用打孔器打取直径相同的菌块，浸入上述IM农杆菌菌液侵染40-60min，每隔5min摇匀一次。之后，将菌块用灭菌滤纸稍微吸干菌液后，转入含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的Co-IM固体培养基中，27℃正置培养。2d后，将菌块转移至含有10μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢噻肟霉素(Cef)的CYM固体培养基上，22℃正置培养，进行一筛。
筛选培养基上的菌丝萌发之后，用打孔器打取新鲜菌丝块于灭菌的匀浆器中，加入适量的无菌水充分研磨，用灭菌的涂布棒将研磨液均匀的涂抹于加有10μg/mL潮霉素(Hyg)的CYM固体培养基上，22℃正置培养进行第二次筛选(二筛)。
将二筛培养基上萌发的菌落转接至新的加有10μg/mL潮霉素的CYM培养基上继续培养观察，对生长稳定的转化子进行培养收集菌丝，采用CTAB法提取总DNA。以野生型M04M26和转化子DNA为模板，分别以yzm-F(SEQ ID NO.5)和yzm-R(SEQ ID NO.6)为引物对转化子进行PCR扩增，检测插入片段。扩增反应体系(20μL)：模板(DNA)1μL，引物(10μM)各1μL，2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 7μL。反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸130s，循环数34，72℃延伸10min。扩增得到的Ubi-hyg片段(856bp)与重组载体中片段大小相同(图3)。
将分子验证为阳性的转化子和未转化的M04M26分别转接到CYM培养基上22℃培养2d，然后在菌丝边缘插上灭菌的盖玻片，5d后菌丝长满盖玻片。在OLYMPUS荧光显微镜下观察红色荧光标记细胞核的情况，结果显示转化子菌丝细胞核中红色荧光明显(图4)。为了观察转化子的稳定性，将转化子在CYM培养基上转接培养三代，用菌丝爬片法分别收集三代菌丝观察红色荧光标记细胞核的情况，结果显示，三代转化子菌丝中均能检测到红色荧光信号，表明红色荧光蛋白在转化子中稳定表达(图5)。
表达载体以羊肚菌泛素基因(ubiquitin)启动子启动筛选标记基因潮霉素(hygromycin，hyg)，以羊肚菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)启动子启动组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白。含有表达载体的农杆菌侵染羊肚菌菌丝后，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使目的基因在菌丝中可稳定长期表达。本发明的表达载体利用的是羊肚菌泛素基因启动子和三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子，更换相应真菌的启动子，表达载体可以整合到不同种属的目标真菌的基因组中。
本发明对于羊肚菌菌丝体交配过程中核迁移的研究具有很大帮助，对于羊肚菌杂交育种研究具有重要意义，因此具有良好的应用前景和发展空间
对比例
采用SV40核定位序列和绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，其他操作与实施例1相同，在整个菌丝体都观察到了绿色荧光，不能准确定位到细胞核，如图6所示。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 真菌细胞核荧光标记的表达载体、试剂、制备方法及应用
<130> 无
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> Morchella importuna
<400> 1
Met Pro Pro Lys Ala Ala Glu Lys Lys Pro Thr Thr Ala Gly Lys Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Lys Lys Glu Ala Gly Lys Lys Thr Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Glu Lys Lys Lys Arg Ser Lys Thr Arg Lys Glu Thr
35 40 45
Tyr Ser Ser Tyr Ile Tyr Lys Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr
50 55 60
Gly Ile Ser Asn Arg Ala Met Ser Ile Leu Asn Ser Phe Val Asn Asp
65 70 75 80
Ile Phe Glu Arg Val Ala Thr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ala Tyr Asn
85 90 95
Lys Lys Ser Thr Ile Ser Ser Arg Glu Ile Gln Thr Ser Val Arg Leu
100 105 110
Ile Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys
115 120 125
Ala Val Thr Lys Tyr Ser Ser Ser Thr Lys
130 135
<210> 2
<211> 754
<212> DNA
<213> Morchella importuna
<400> 2
atgcctccaa aagctgctga gaagaagccc accaccgccg gaaaggcccc cgctggaaag 60
gcccctgaga agaaggtttg ttgtcctttt cccgcctcac ttttggattc cgacctattt 120
ttcggattcc aacctttgga ttccaacttt tttttttccg ctttgaacct tcatttggat 180
tcaatttgaa tccaacaccg agatggaatt ttaaaatcat ttactaatgc gattttttta 240
cccctcttta ggaagccgga aagaagactg ccgccgctgg tggtgagaag aagaagcgct 300
ccaagaccag aaaggagacc tactcttctt acatctacaa gggtttgtgg aatcaaattc 360
taattttttc gattgagtca tacagttcta actttttttt tttttaaata gttttgaagc 420
aggttcaccc tgacaccggt atctccaacc gtgctatgtc aatcttgaac tccttcgtca 480
acggtatgtc attcaaaata tactccgtat tttttttttt cctttcaaaa tagttgcagg 540
attctaattt cccctttttt ttctttcaga catcttcgag cgcgtcgcaa ctgaggcctc 600
caagcttgcc gcctacaaca agaagtccac catctcttcc cgcgagatcc agacctctgt 660
ccgccttatc ctccccggtg agcttgccaa gcacgccgtc tctgagggta ccaaggctgt 720
caccaagtac tcttcttcca ccaaataagg tgag 754
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
caaaccttcg tcgataatcc aaaacc 26
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
accaagtact cttcttccac caaacccggg attgcaggta tggtgag 47
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tccgtcagga cattgttgga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
taccattttc ggcctatcag a 21

Claims (19)

1.一种真菌细胞核荧光标记的表达载体，其特征在于，其表达区包括用于表达组蛋白和荧光蛋白的重组融合蛋白的重组融合蛋白表达序列，所述重组融合蛋白表达序列，包括含有核定位信号的组蛋白表达序列和荧光蛋白表达序列；所述组蛋白表达序列与荧光蛋白表达序列处于同一启动子的阅读框中，其中所述组蛋白表达序列缺失终止密码子且连接于荧光蛋白表达序列上游；所述重组融合蛋白表达序列具有核定位信号，用于表达重组融合蛋白；所述重组融合蛋白表达序列用于表达重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括正确折叠的组蛋白亚基和荧光蛋白亚基，组蛋白亚基和荧光蛋白亚基之间无连接肽；所述组蛋白为H2B蛋白；所述荧光蛋白为红色荧光蛋白；所述组蛋白表达序列为：SEQ ID NO.2所示的序列。
2.如权利要求1所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体，其特征在于，其表达区还包括用于表达筛选标记的筛选标记基因序列；
还包括用于启动所述重组融合蛋白表达序列的第一启动子、以及用于启动所述筛选标记基因序列的第二启动子，所述第一、第二启动子，为待标记的目标真菌细胞的高保守基因强启动子。
3.如权利要求2所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体，其特征在于，所述表达载体，用于标记羊肚菌细胞核，其表达区还包括用于表达用作筛选标记基因的潮霉素基因序列。
4.如权利要求2所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体，其特征在于，所述第一启动子与第二启动子为不同类型的启动子，分别调控融合蛋白的表达和筛选标记基因的表达。
5.如权利要求4所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体，其特征在于，所述第一启动子为：羊肚菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子；第二启动子为：羊肚菌泛素基因启动子。
6.一种细胞核标记试剂，其特征在于，包括含有权利要求1至5任意一项所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体且具有侵染目标真菌细胞能力的重组体。
7.如权利要求6所述的细胞核标记试剂，其特征在于，用于标记羊肚菌细胞核，所述重组体为农杆菌。
8.如权利要求7所述的细胞核标记试剂，其特征在于，所述重组体为农杆菌EHA105。
9.一种如权利要求1至5任意一项的真菌细胞核荧光标记的表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
克隆含有核定位信号序列的组蛋白基因序列，将所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列连接到含有荧光蛋白序列的表达载体的表达区上，使得所述组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游；
所述含有核定位信号序列的组蛋白基因序列为H2B基因序列，其核苷酸序列为：SEQ IDNO.2。
10.如权利要求9所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以目标真菌DNA为模板，设计引物扩增第一和/或第二启动子，利用同源重组的方法，将扩增得到的两侧含有载体核苷酸序列的启动子连接到表达载体表达区的融合蛋白表达序列和/或筛选标记基因表达序列的上游。
11.如权利要求10所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体的制备方法，其特征在于，采用感受态细胞扩增所述表达载体，具体操作为将所述表达载体转化感受态细胞，繁殖提取质粒；所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。
12.如权利要求11所述的真菌细胞核荧光标记的表达载体的制备方法，其特征在于，所述采用感受态细胞扩增所述表达载体具体为：
（1）克隆获得含有核定位信号序列的组蛋白基因序列；
（2）将步骤（1）所述序列连接到羊肚菌含有荧光蛋白序列的表达载体上，其中组蛋白基因序列连接于荧光蛋白序列上游，获得重组表达载体；
（3）将步骤（2）获得的重组表达载体扩增：转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒。
13.如权利要求6所述的细胞核标记试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1至5任意一项所述的表达载体转化具有待标记的目标真菌细胞侵染能力的载体，获得重组体。
14.如权利要求13所述的细胞核标记试剂的制备方法，其特征在于，还包括对所述重组体进行培养后筛选阳性重组体。
15.如权利要求14所述的细胞核标记试剂的制备方法，其特征在于，所述对所述重组体进行培养后筛选阳性重组体具体为：
将重组表达载体转化可用于侵染羊肚菌的农杆菌，培养后筛选阳性农杆菌，获得含有重组表达载体的农杆菌。
16.如权利要求6至8任意一项所述的细胞核标记试剂的应用，其特征在于，应用于标记羊肚菌的细胞核。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，包括步骤：采用所述细胞核标记试剂侵染并转化待标记的目标真菌细胞；具体为：
将农杆菌侵染羊肚菌菌丝，培养后筛选阳性转化子，获得荧光标记细胞核的目的细胞。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，还包括步骤：将侵染后的目标真菌细胞置于针对筛选标记基因的培养环境中，筛选出表达筛选标记基因的目标真菌细胞转化子；具体为：
农杆菌侵染羊肚菌菌丝后，在含有潮霉素的CYM培养基上进一步筛选阳性转化子，获得含有核定荧光标记的羊肚菌菌丝。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，侵染时所述农杆菌菌液OD600为0.6-0.8，侵染时间为40至60 min；侵染后所述羊肚菌菌丝在含乙酰丁香酮200 μmol/L的共培养培养基中培养。
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