CN112138012A - Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用，以及在制备抗冠状病毒感染的药物中的应用，Trazodone对冠状病毒的靶点3C样蛋白酶的酶活性具有抑制作用，尤其是新冠病毒的靶点3C样蛋白酶的酶活性有较强抑制作用，具有发展为治疗和预防冠状病毒尤其是抗新冠病毒的药物的潜力。

Description

Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用。

背景技术

冠状病毒属于单正链RNA病毒，冠状病毒家族主要包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，SARS冠状病毒(SARS-CoV)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63、HCoV-HKU。冠状病毒通常导致呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。2003年，严重的上呼吸道疾病(SARS)暴发，全世界约8000人感染，死亡率高达10％。2014年，中东呼吸综合征(MERS)在全世界多个国家暴发，死亡率比SARS-CoV更高，约达40％。2019年末至今，新型冠状病毒(COVID-19)爆发，这种新毒株(SARS-CoV-2)有比2003年SARS-CoV-1致死率低，但是有更强的感染能力。目前为止，全世界范围内感染人数已近1000万，死亡近100万，并且疫情还在继续发酵。这些疾病的感染严重影响了人们的健康以及经济的发展。冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚少，开发治疗新冠病毒的药物迫在眉睫。

3C-like protease(3CLpro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp5上的水解酶，主要功能为切割多聚蛋白pp1a和pp1ab上至少11个位点，该多聚蛋白被水解后需要被加工成成熟的功能蛋白；3C样蛋白酶(3CLpro)是一种半胱氨酸蛋白酶，在P2位和P1位分别识别带Leu和Glin的序列。另外，3C样蛋白酶(3CLpro)底物结合位点高度保守，在介导病毒复制和转录方面起着关键作用，因此，3CL蛋白酶可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。

Trazodone，中文名曲唑酮，是一种属于竞争性的，5-羟色胺受体拮抗剂和再摄取抑制剂。经查阅相关资料，未见Trazodone(hydrochloride)作为新型冠状病毒3CLpro抑制剂的相关报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用，以达到可有效抑制冠状病毒3C样蛋白酶的活性的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用。

上述方案中，所述Trazodone具有式(I)所示结构，

上述方案中，所述Trazodone包括其旋光异构体、其水合物，以及其药学上可接受的盐。

上述方案中，所述水合物的结晶水数目为1-16中的任意实数。

上述方案中，所述冠状病毒为HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2。

一种冠状病毒3C样蛋白酶的抑制剂药物，所述抑制剂药物包含Trazodone或其药学上可接受的盐。

Trazodone在制备抗冠状病毒感染的药物中的应用。

一种抗冠状病毒感染的药物，所述抗感染药物包含Trazodone或其药学上可接受的盐。

上述方案中，所述抗感染药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。

上述方案中，所述抗感染药物的给药途径为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

通过上述技术方案，本发明提供的Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用，以及在制备抗冠状病毒感染药物中的应用，Trazodone对冠状病毒的靶点3C样蛋白酶的酶活性有较强抑制作用，具有发展为治疗和预防冠状病毒尤其是抗新冠病毒的药物的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为抑制剂Trazodone(hydrochloride)不同浓度下底物肽在3C样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化曲线图；

图2为抑制剂Trazodone(hydrochloride)对新型冠状病毒3C样蛋白酶的抑制曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明是以新型冠状病毒(SARS-COV-2)为模型，基于新型冠状病毒3CLpro的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库、临床化合物库、抗病毒药物库在内的数千个化合物进行理论筛选，得到对新型冠状病毒3CLpro有抑制作用的化合物。然后，用市售3CLpro荧光探针构建方法来进行酶活性测试，实验筛选出了Trazodone及其药学上可接受的盐对SARS-COV-2 3C样蛋白酶的抑制作用。

经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示化合物Trazodone及其药学上可接受的盐式(I)对SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的抑制作用：

将式(I)化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备冠状病毒3C样蛋白酶的抑制剂药物，以及治疗和预防冠状病毒感染的药物。辅剂(药学上可接受的载体或辅料)包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

进行实验时，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。

在以下实施例中，所用的抑制剂分子，购自MCE(MedChemExpress)或其他普通商业途径。

本发明所用的SARS-Cov-2 3C样蛋白酶购自CrystalO Biopharma，底物Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2购自GL biochem，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。SARS-Cov-2 3C样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)、底物肽Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2(浓度为0.1mM-5mM)、硼酸硼砂缓冲液(PH＝5-8)。本发明需要用荧光酶标仪进行荧光检测。

实施例1

不同抑制剂浓度下底物肽在3C样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化

具体实施过程为：

1)SARS-Cov-2 3C样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

2)将SARS-Cov-2 3C样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1uL稀释于98uL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；

3)将不同浓度的抑制剂(Trazodone，浓度为0，0.025mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM)分别取1uL加入上述步骤(2)获得的溶液中；

4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；

5)抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如图1，结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被抑制剂Trazodone(hydrochloride)抑制，并且这种抑制现象是浓度相关的。

实施例2

化合物Trazodone(hydrochloride)对SARS-Cov-2 3C样蛋白酶抑制能力的测定

具体实施过程如下：

1)SARS-Cov-2 3C样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

2)将SARS-Cov-2 3C样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1uL稀释于98uL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；

3)将不同浓度的抑制剂(Trazodone，浓度为0，0.025mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM)分别取1uL加入上述步骤(2)获得的溶液中；

4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；

5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(抑制剂浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的孵育前后荧光变化值与之相比得到剩余活性值(Residual Activity)。使用GraphPad Prism6软件，以抑制剂浓度的对数值(logC(Inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(Residual Activity)为纵坐标作图，结果如图2所示，图2所示为不同抑制剂浓度对抑制酶活性比例作图，可以得到该化合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。

可以看出，上述化合物对新型冠状病毒3C样蛋白酶的抑制效果十分明显，IC₅₀值为2.286μM，表明Trazodone能够有效的抑制新型冠状病毒3C样蛋白酶的活性。并且，基于序列分析表明冠状病毒3C样蛋白酶具有高度相似性，因此，该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒3C样蛋白酶的活性，尤其是对于SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63和HCoV-HKU1。

IC₅₀计算的公式为Y＝100/(1+10^((X-LogIC50)))，其中Y代表剩余活性分数，X代表抑制剂化合物浓度的常用对数，∧指的是幂算法。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.Trazodone在制备冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Trazodone具有式(I)所示结构，

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Trazodone包括其旋光异构体、其水合物，以及其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1所述的一种冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述水合物的结晶水数目为1-16中的任意实数。

5.根据权利要求1所述的一种冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述冠状病毒为HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2。

6.一种冠状病毒3C样蛋白酶的抑制剂药物，其特征在于，所述抑制剂药物包含Trazodone或其药学上可接受的盐。

7.Trazodone在制备抗冠状病毒感染的药物中的应用。

8.一种抗冠状病毒感染的药物，其特征在于，所述抗感染药物包含Trazodone或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求8所述的一种抗冠状病毒感染的药物，其特征在于，所述抗感染药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。

10.根据权利要求8所述的一种抗冠状病毒感染的药物，其特征在于，所述抗感染药物的给药途径为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

Images