CN112126673A - 一种凝血激活检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及凝血检测技术领域,尤其涉及一种凝血激活检测试剂盒,解决了现有技术中存在的由于试剂盒的存储条件较高,其检测时试剂容易受运输存储影响导致自身的血凝活性较差,且检测试剂盒在检测时的速率较低,效率低下的缺点,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;试剂一包括凝血酶、肝素、阿司帕坦及缓冲液;试剂二包括凝血酶的发色底物及缓冲液;稀释液为生理盐水;功能剂为甘草酸苷粉末。本发明通过加入的阿司帕坦来与原本的凝血酶及肝素进行协同作用保证试剂的稳定性,在各类存储条件下均可保证血凝活性,方便该试剂盒的使用运输存储,且设置有功能剂,利用稀释配比后的功能剂可有效提升检测速率,提高检测盒的使用效率。
Description
技术领域
本发明涉及凝血检测技术领域,尤其涉及一种凝血激活检测试剂盒。
背景技术
抗凝血酶国际标准物质由英国国家生物制品检定所(NIBSC)制备和赋值。根据该机构提供的信息,国际卫生组织(WHO)于1978年确立的第一代国际参考品(72/1),使用的名称为抗凝血酶Ⅲ。命名遵循了SeegersWH,JohnsonJF,FellC(1954)的出版物《凝血酶原激活的抗凝血酶反应》Am.J.Physiol.176(1):97-103。在这篇文章中有四种抗凝血酶的说法,抗凝血酶Ⅲ这一叫法我们现在称之为抗凝血酶。国际血栓与止血学会(ISTH)现在已将术语命名为抗凝血酶,不再使用抗凝血酶Ⅲ。因此NIBSC制备并由WHO于1994年确立的第二代国际参考品(93/578)、2010年确立的第三代(08/258)国际参考品已经不再使用“抗凝血酶Ⅲ”这一名称,而使用了“抗凝血酶”的名称。
尽管国际上已经将术语、国际参考品进行了名称统一,但根据国内的注册情况,本申请仍采用了抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒(发色底物法)进行命名。人体内与凝血系统功能相拮抗的是抗凝血系统,在正常情况下,两者保持动态平衡,从而维持血液在血管内的正常流动。抗凝血酶Ⅲ是抗凝系统中最重要的成分,它由肝脏合成,为一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制物,可抑制凝血酶生成,具有强大的抗凝活性,占血浆抗凝酶活性的70%,在运用凝血激活检测试剂盒的过程中,由于试剂盒的存储条件较高,其检测时试剂容易受运输存储影响导致自身的血凝活性较差,且检测试剂盒在检测时的速率较低,效率低下。
因此,我们提出了一种凝血激活检测试剂盒用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种凝血激活检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提出的一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;所述试剂一包括浓度为9~18IU/ml凝血酶、含量为0.5~1.5wt%的肝素、含量为0.8~1.2wt%的阿司帕坦及缓冲液;所述试剂二包括含量为0.8~1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;所述稀释液为质量分数为0.9%~1.5%的生理盐水;所述功能剂为甘草酸苷粉末;所述终止液为50wt%的醋酸。
优选的,所述试剂一中,凝血酶的浓度为13IU/ml、肝素的含量为0.9wt%、阿司帕坦的含量为1.1wt%。
优选的,所述试剂二中,凝血酶的发色底物的含量为1.2wt%。
优选的,所述生理盐水的质量分数为1.4%。
优选的,所述发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,所述缓冲液为Tris缓冲液。
优选的,一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温放置2~4小时或于1000xg离心20~40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件,将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育5~10min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:(3~7)的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
优选的,所述室温为18~25℃。
优选的,所述S1中,全血样品于室温放置3小时或于1000xg离心30分钟。
优选的,所述稀释液稀释的范围为50%~75%。
优选的,所述试剂一的加入量为上清液的6.7~8.4%,所述试剂二的加入量为上清液的4.6~6.5%,所述配溶液的加入量为上清液的3.7~5.4%,所述终止液的加入量为上清液的1.5~2.7%。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明在试剂一中设置了阿司帕坦,通过加入的阿司帕坦来与原本的凝血酶及肝素进行协同作用,保证试剂的稳定性,在各类存储条件下均可保证血凝活性,降低试剂盒的存储难度,方便该试剂盒的使用运输存储。
2、本发明在试剂盒中设置有功能剂,该功能剂与稀释液配比之后制得的溶液可在检测过程中保证试剂一、试剂二的反应环境,进而保证凝血检测工作始终以较快速率进行,缩短最终检测反应所需的总时长,提高检测盒的使用效率。
具体实施方式
除非另有限定,本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时,以本说明书中的定义为准。“质量、浓度、温度、时间、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,1-50的范围应理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50的任何数字、数字的组合、或子范围、以及所有介于上述整数之间的小数值,例如,1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。关于子范围,具体考虑从范围内的任意端点开始延伸的“嵌套的子范围”。例如,示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括一个方向上的1-10、1-20、1-30和1-40,或在另一方向上的50-40、50-30、50-20和50-10。”
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说,在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例一
本发明提出的一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为9IU/ml凝血酶、含量为0.5wt%的肝素、含量为0.8wt%的阿司帕坦及缓冲液;
试剂二包括含量为0.8wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为0.9%的生理盐水;
功能剂为甘草酸苷粉末;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
实施例中,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(18℃)放置2小时或于1000xg离心20分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至50%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(18℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育5min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:3的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的6.7%,试剂二的加入量为上清液的4.6%,配溶液的加入量为上清液的3.7%,终止液的加入量为上清液的1.5%。
实施例二
本发明提出的一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为12IU/ml凝血酶、含量为0.8wt%的肝素、含量为1.0wt%的阿司帕坦及缓冲液;
试剂二包括含量为1.1wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.2%的生理盐水;
功能剂为甘草酸苷粉末;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
实施例中,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(20℃)放置3小时或于1000xg离心25分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至60%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(20℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育7min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:5的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的7.2%,试剂二的加入量为上清液的5.2%,配溶液的加入量为上清液的4.3%,终止液的加入量为上清液的1.8%。
实施例三
本发明提出的一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为15IU/ml凝血酶、含量为1.4wt%的肝素、含量为1.1wt%的阿司帕坦及缓冲液;
试剂二包括含量为1.4wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.3%的生理盐水;
功能剂为甘草酸苷粉末;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
实施例中,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(23℃)放置3小时或于1000xg离心35分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至70%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(23℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育9min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:6的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的7.9%,试剂二的加入量为上清液的5.8%,配溶液的加入量为上清液的5.2%,终止液的加入量为上清液的2.4%。
实施例四
本发明提出的一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为18IU/ml凝血酶、含量为1.5wt%的肝素、含量为1.2wt%的阿司帕坦及缓冲液;
试剂二包括含量为1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.5%的生理盐水;
功能剂为甘草酸苷粉末;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
实施例中,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(25℃)放置4小时或于1000xg离心40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至75%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(25℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育10min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:7的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的8.4%,试剂二的加入量为上清液的6.5%,配溶液的加入量为上清液的5.4%,终止液的加入量为上清液的2.7%。
对比例一
一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为18IU/ml凝血酶、含量为1.5wt%的肝素及缓冲液;
试剂二包括含量为1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.5%的生理盐水;
功能剂为甘草酸苷粉末;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
具体地,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(25℃)放置4小时或于1000xg离心40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至75%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(25℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育10min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:7的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的8.4%,试剂二的加入量为上清液的6.5%,配溶液的加入量为上清液的5.4%,终止液的加入量为上清液的2.7%。
对比例二
一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为18IU/ml凝血酶、含量为1.5wt%的肝素、含量为1.2wt%的阿司帕坦及缓冲液;
试剂二包括含量为1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.5%的生理盐水;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
具体地,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(25℃)放置4小时或于1000xg离心40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至75%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(25℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育10min;
S4:将试剂二加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的8.4%,试剂二的加入量为上清液的6.5%,终止液的加入量为上清液的2.7%。
对比例三
一种凝血激活检测试剂盒,包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
试剂一包括浓度为18IU/ml凝血酶、含量为1.5wt%的肝素及缓冲液;
试剂二包括含量为1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
稀释液为质量分数为1.5%的生理盐水;
终止液为50wt%的醋酸。
其中,发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,缓冲液为Tris缓冲液。
具体地,还涉及一种应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温(25℃)放置4小时或于1000xg离心40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释至75%;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件(25℃),将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育10min;
S4:将试剂二加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
其中,试剂一的加入量为上清液的8.4%,试剂二的加入量为上清液的6.5%,终止液的加入量为上清液的2.7%。
实施例五
使用实施例四中的测定试剂盒重复测试3次,按公式(1)计算相对偏差,结果如表1所示:
式中:
B――相对偏差;
xi――第i次的测定值;
T――参考物质标示值或各浓度样本定值。
表1
实施例六
用实施例四中的AT III试剂盒分别对高(>50%)、中(30%-50%)、低(<30%)3个浓度水平样本进行测定,各测试10次,计算测量值的平均值和标准差(s),按公式(2)计算变异系数(CV%),结果如表2所示:
表2
根据表1及表2,所得数据符合:相对偏差在±15.0%范围内;重复性试验使用高、中、低三个浓度水平的样本,高浓度样本变异系数(CV)应≤10%,中浓度样本变异系数(CV)应≤10%,低浓度样本变异系数(CV)应≤15%,故测定试剂盒本身合格。
对实施例一到实施例四、对比例一到对比例三的试剂盒检测抗凝血酶III活性,对比检测结果如表3所示:
表3
参照表3,在实施例一至四中,检测试剂盒的AT-III活性均较高,且在检测时所需的累计反应时间均较少,且在冻融6次的条件下其凝血速率较快,所耗时均较少。
在其他条件均相同的情况下,实施例四与对比例一相比,对比例一未在试剂中添加阿司帕坦,使得在冻融6次的条件下其凝血速率较慢,所耗时均较多,同时检测试剂盒的AT-III活性偏低,但累计反应时间仍较少,故可明显得到该阿司帕坦可有效影响凝血时间,提高检测试剂盒的稳定性,保证检测的精准。
在实施例四与对比例二中,对比例二未设置甘草酸苷粉末的功能剂,故安装正常流程进行检测所需累计反应时间较长,而检测试剂盒的AT-III活性正常,且在冻融6次的条件下其凝血速率仍较快,所耗时均较少,故甘草酸苷粉末的功能剂在稀释后可有效保证检测环境,提高检测速率。
在对比例三中,未在试剂中添加阿司帕坦,同时未设置甘草酸苷粉末的功能剂,在冻融6次的条件下其凝血速率较慢,所耗时均较多,同时检测试剂盒的AT-III活性偏低,且检测所需累计反应时间较长。
综上,通过在试剂一中设置了阿司帕坦可与原本的凝血酶及肝素进行协同作用,保证试剂的稳定性,在各类存储条件下均可保证血凝活性,降低试剂盒的存储难度,方便该试剂盒的使用运输存储,且甘草酸苷粉末的功能剂与稀释液配比之后制得的溶液可在检测过程中保证试剂一、试剂二的反应环境,进而保证凝血检测工作始终以较快速率进行,缩短最终检测反应所需的总时长,提高检测盒的使用效率。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种凝血激活检测试剂盒,其特征在于包括试剂一、试剂二、稀释液、功能剂及终止液;
所述试剂一包括浓度为9~18IU/ml凝血酶、含量为0.5~1.5wt%的肝素、含量为0.8~1.2wt%的阿司帕坦及缓冲液;
所述试剂二包括含量为0.8~1.5wt%的凝血酶的发色底物及缓冲液;
所述稀释液为质量分数为0.9%~1.5%的生理盐水;
所述功能剂为甘草酸苷粉末;
所述终止液为50wt%的醋酸。
2.根据权利要求1所述的一种凝血激活检测试剂盒,其特征在于,所述试剂一中,凝血酶的浓度为13IU/ml、肝素的含量为0.9wt%、阿司帕坦的含量为1.1wt%。
3.根据权利要求1所述的一种凝血激活检测试剂盒,其特征在于,所述试剂二中,凝血酶的发色底物的含量为1.2wt%。
4.根据权利要求1所述的一种凝血激活检测试剂盒,其特征在于,所述生理盐水的质量分数为1.4%。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种凝血激活检测试剂盒,其特征在于,所述发色底物为S2238、S-2160和Chromozym TH中的一种,所述缓冲液为Tris缓冲液。
6.一种应用权利要求1~5任一项所述的凝血激活检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将全血样品于室温放置2~4小时或于1000xg离心20~40分钟,取上清液,并利用稀释液进行稀释;
S2:取出试剂盒,将其平衡至室温条件,将所有试剂及S1中的上清液缓慢均衡至室温;
S3:取稀释后的需检测上清液加入到反应池中,而后在反应池中加入试剂一,混匀,孵育5~10min;
S4:将稀释液与功能剂按照100:(3~7)的质量比进行配溶,并将所得配溶液与试剂二同时加入到反应池中充分反应;
S5:加入终止液后将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比从而得出检测液中抗凝血酶III浓度。
7.根据权利要求6所述的应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述室温为18~25℃。
8.根据权利要求6所述的应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述S1中,全血样品于室温放置3小时或于1000xg离心30分钟。
9.根据权利要求6所述的应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述稀释液稀释的范围为50%~75%。
10.根据权利要求6所述的应用凝血激活检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述试剂一的加入量为上清液的6.7~8.4%,所述试剂二的加入量为上清液的4.6~6.5%,所述配溶液的加入量为上清液的3.7~5.4%,所述终止液的加入量为上清液的1.5~2.7%。
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CN202011012050.3A CN112126673A (zh) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | 一种凝血激活检测试剂盒 |
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CN202011012050.3A CN112126673A (zh) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | 一种凝血激活检测试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN (1) | CN112126673A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111826418A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-27 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种抗凝血酶iii测定试剂盒 |
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2020
- 2020-09-23 CN CN202011012050.3A patent/CN112126673A/zh not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111826418A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-27 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种抗凝血酶iii测定试剂盒 |
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