CN112113941A - 消光型微弱荧光检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种消光型微弱荧光检测系统，包括：激发光光路、遮光壳体及设置在所述遮光壳体内的荧光收集透镜、主二向色镜、副二向色镜、带通滤光片、汇聚透镜、光电转换探测器、锥面消光器。本发明采用多重二向色镜串联来深度滤除进入到检测光路中的本底激发光，能大幅降低目标荧光中本底激发光的能量占比，能解决荧光信号微弱时易被本底激发光淹没的问题；通过设置锥面消光器可高效吸收漏滤的入射激发光，用斜坡的方式可增大检测光路内部吸收面，分散降低单位面积上的光能量，从而能减少内部激发出的干扰荧光，通过沟道增加漏吸光的折返次数使得消光吸收更为彻底，进而可消除检测光路内部表面激发出的荧光干扰信号，使得检测结果更为准确。

Description

消光型微弱荧光检测系统

技术领域

本发明涉及光学设备技术领域，特别涉及一种消光型微弱荧光检测系统。

背景技术

荧光共振能量转移是利用偶极子相互作用将供体激发态能量向邻近的受体分子转移的一种新兴分子荧光检测技术，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面应用前景广阔。由于待检测的目标荧光并非由激发光直接激励转化所得，而是由供体荧光和邻近受体发生能量共振转移所产生二次荧光，因此当激发光强度相同时荧光共振能量转移法所产生的有效荧光强度远低于传统的荧光法。

由于干涉型滤光片(含二向色镜)无法100％滤除阻带波段的光，有1％左右的阻带光仍会透过到滤光片(含二向色镜)的另一侧，因此采用传统的荧光检测光路时会有一部分本底激发光夹杂在有效荧光中照射到光电转换探测器上对荧光检测造成干扰，当有效荧光的强度微弱到小于本底激发光时便会被本底激发光所淹没导致无法检出；此外高强度的入射激发光首次照射到二向色镜上时，有1％左右的激发光未能被反射滤除而透过到二向色镜另一侧，相较于有效荧光这些漏掉的激发光能量仍然巨大，采用传统荧光检测光路时它们易在检测光路系统的内部吸光面和滤光片表面(取决于滤光膜层粘接材料)上激发出干扰荧光信号，当内部干扰荧光的波长与有效荧光的波长相重叠时会影响到后续检测的准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种消光型微弱荧光检测系统。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种消光型微弱荧光检测系统，包括：激发光光路、遮光壳体以及设置在所述遮光壳体内的荧光收集透镜、主二向色镜、副二向色镜、带通滤光片、汇聚透镜、光电转换探测器、锥面消光器；

所述激发光光路发出的激发光呈平行状态入射到所述主二向色镜上后一部分被反射至所述荧光收集透镜，再经所述荧光收集透镜汇聚后照射到样品中，入射到主二向色镜上的激发光中的另一部分透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

样品被激发产生的荧光经所述荧光收集透镜准直后依次透过所述主二向色镜、副二向色镜，再经所述带通滤光片滤光后由所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上；

部分被样品散射的激发光进入所述荧光收集透镜被准直后作为一次激发光照射到所述主二向色镜上，一次激发光中的一部分被所述主二向色镜反射而射出所述遮光壳体，另一部分透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上；二次激发光中的一部分被所述副二向色镜反射至所述锥面消光器上，被分散吸收，另一部分透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上；三次激发光中的一部分被所述带通滤光片反射、再经所述副二向色镜反射至遮光壳体的内壁上，被吸收，另一部分透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

优选的是，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99％±0.5％；

所述带通滤光片对激发光的透过率为1％±0.5％。

优选的是，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99％；

所述带通滤光片对激发光的透过率为1％。

优选的是，其中，入射到主二向色镜上的激发光中的1％±0.5％透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

一次激发光中的1％±0.5％透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1％±0.5％透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1％±0.5％透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

优选的是，其中，入射到主二向色镜上的激发光中的1％透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

一次激发光中的1％透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1％透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1％透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

优选的是，所述遮光壳体具有黑色的内外表面。

优选的是，所述锥面消光器包括底座及设置在所述底座上的消光锥阵列，所述消光锥阵列处于所述遮光壳体内壁的侧部。

优选的是，所述消光锥阵列中的消光锥的中线与所述激发光光路发出的激发光平行，且所述激发光光路发出的激发光中透过所述主二向色镜的部分可直接照射到所述消光锥阵列上。

优选的是，所述锥面消光器通过固定框安装在所述遮光壳体上，所述遮光壳体上开设有供所述消光锥阵列插入的安装孔，且所述底座的底部设置有与所述固定框配合的台阶。

优选的是，所述锥面消光器采用金属材料，所述消光锥阵列通过利用线切割工艺在金属体上切削加工而成，每个消光锥均有4个锥面，相邻的消光锥之间形成吸光沟道；整个所述锥面消光器的表面采用氧化发黑处理为黑色。

本发明的有益效果是：本发明的消光型微弱荧光检测系统，采用多重二向色镜串联来深度滤除进入到检测光路中的本底激发光，能大幅降低目标荧光中本底激发光的能量占比，能解决荧光信号微弱时易被本底激发光淹没的问题；本发明通过设置锥面消光器可高效吸收漏滤的入射激发光，用斜坡的方式可增大检测光路内部吸收面，分散降低单位面积上的光能量，从而能减少内部激发出的干扰荧光，通过沟道增加漏吸光的折返次数使得消光吸收更为彻底，进而可消除检测光路内部表面激发出的荧光干扰信号，使得检测结果更为准确。

附图说明

图1为本发明的实施例1中的消光型微弱荧光检测系统的结构示意图；

图2为本发明的实施例1中的锥面消光器的结构示意图；

图3为实施例2中采用常规荧光检测系统的检测结果；

图4为实施例2中采用实施例1的检测系统的检测结果。

附图标记说明：

100—激发光光路；101—遮光壳体；102—荧光收集透镜；103—主二向色镜；104—副二向色镜；105—带通滤光片；106—汇聚透镜；107—光电转换探测器；108—锥面消光器；109—固定框；201—底座；202—消光锥阵列。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

如图1所示，本实施例的一种消光型微弱荧光检测系统，包括：激发光光路100、遮光壳体101以及设置在遮光壳体101内的荧光收集透镜102、主二向色镜103、副二向色镜104、带通滤光片105、汇聚透镜106、光电转换探测器107、锥面消光器108；

激发光光路100发出的激发光呈平行状态入射到主二向色镜103上后一部分被反射至荧光收集透镜102，再经荧光收集透镜102汇聚后照射到样品中，入射到主二向色镜103上的激发光中的另一部分透过主二向色镜103后照射到锥面消光器108上，被分散吸收；

样品被激发产生的荧光经荧光收集透镜102准直后依次透过主二向色镜103、副二向色镜104，再经带通滤光片105滤光后由汇聚透镜106汇聚至光电转换探测器107上；

部分被样品散射的激发光进入荧光收集透镜102被准直后作为一次激发光照射到主二向色镜103上，一次激发光中的一部分被主二向色镜103反射而射出遮光壳体101，另一部分透过主二向色镜103作为二次激发光照射到副二向色镜104上；二次激发光中的一部分被副二向色镜104反射至锥面消光器108上，被分散吸收，另一部分透过副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片105上；三次激发光中的一部分被带通滤光片105反射、再经副二向色镜104反射至遮光壳体101的内壁上，被吸收，另一部分透过带通滤光片105作为四次激发光经汇聚透镜106汇聚至光电转换探测器107上。

遮光壳体101具有黑色的内外表面，用于固定各光学器件、阻挡外部环境光进入检测光路系统、以及吸收检测光路系统内部的无用光。

主二向色镜103和副二向色镜104均为低反高通的干涉型滤光片，

波长小于其截止波长的激发光照射到二向色镜上绝大部分被反射掉，波长大于其截止波长的荧光照射到二向色镜上绝大部分可以穿透二向色镜；高通型二向色镜的共性是无法对小于截止波长的短波光子做到100％的反射，对小于截止波长的短波光子的反射率一般在99％左右，故而仍会有1％左右的短波光子穿透二向色镜进入到另一侧。在一些实施例中，两者对激发光的反射率均为99％±0.5％；带通滤光片105也是基于干涉原理，其对通带波长内的光子的透过率亦为99％左右，通带波长之外的光子也会有1％左右会穿透滤光片进入到另一侧。在一些实施例中，带通滤光片105对激发光的透过率为1％±0.5％。其中，入射到主二向色镜103上的激发光中的1％±0.5％透过主二向色镜103后照射到锥面消光器108上，被分散吸收。一次激发光中的1％±0.5％透过主二向色镜103作为二次激发光照射到副二向色镜104上，二次激发光中的1％±0.5％透过副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片105上，三次激发光中的1％±0.5％透过带通滤光片105作为四次激发光经汇聚透镜106汇聚至光电转换探测器107上。

在一种实施例中，主二向色镜103和副二向色镜104均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99％；带通滤光片105对激发光的透过率为1％。本实施例中，系统的光路为：

激发光光路100发出的激发光呈平行状态入射到主二向色镜103上后，由于激发光的波长小于二向色镜的截止波长，其中99％被反射至荧光收集透镜102，再经荧光收集透镜102汇聚后照射到样品中，入射到主二向色镜103上的激发光中的1％(即漏滤入射光)透过主二向色镜103后照射到锥面消光器108上，最终被锥面消光器108分散吸收；

照射到102荧光收集透镜102上的激发光经102荧光收集透镜102汇聚后照射到样品中，经样品体系散射后，一部分入射激发光被目标分子团簇吸收发生荧光共振能量转移最终发射出待测目标荧光，这些荧光向四面八方出射；未被吸收的入射激发光有一部分被样品散射后亦射向四面八方；其中的部分荧光夹杂部分激发光会照射到荧光收集透镜102上，即为初始混合光；

其中，对于初始混合光中的荧光：样品被激发产生的荧光经荧光收集透镜102准直后变成近似平行光，再依次透过主二向色镜103、副二向色镜104，再经带通滤光片105滤光后由汇聚透镜106汇聚至光电转换探测器107上；

其中，对于初始混合光中的激发光：部分被样品散射的激发光进入荧光收集透镜102被准直后作为一次激发光照射到主二向色镜103上，一次激发光中的99％被主二向色镜103反射而射出遮光壳体101，1％透过主二向色镜103作为二次激发光照射到副二向色镜104上；二次激发光中的99％被副二向色镜104反射90°后投向锥面消光器108，最终被锥面消光器108分散吸收，1％透过副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片105上；三次激发光中的99％被带通滤光片105反射、再经副二向色镜104反射至遮光壳体101的内壁上，被吸收，1％透过带通滤光片105作为四次激发光经汇聚透镜106汇聚至光电转换探测器107上。

初始混合光中，由于荧光极其微弱，初始混合平行光中的本底激发光(即一次激发光)强度远远大于目标荧光；透过主二向色镜103后到达副二向色镜104上的二次激发光与荧光构成二次混合平行光，一次激发光中只有1％透过主二向色镜103形成二次激发光，即二次激发光衰减到了一次激发光的1％，所以此时二次混合平行光中的本底激发光强度(二次激发光)衰减了百分之一，但仍远大于目标荧光；

透过副二向色镜104后到达带通滤光片105上的三次激发光与荧光构成三次混合平行光，二次激发光中只有1％透过副二向色镜104形成三次激发光，即三次激发光衰减到了二次激发光的1％，所以三次混合平行光中的本底激发光强度(三次激发光)衰减了万分之一，但本底激发光强度仍然会对后续荧光检测构成干扰；

透过带通滤光片105后到达光电转换探测器107上的四次激发光与荧光构成四次混合平行光，三次激发光中只有1％透过带通滤光片105形成四次激发光，即四次激发光衰减到了三次激发光的1％，所以最终照射到光电转换探测器107上的四次混合平行光中的本底激发光强度(四次激发光)衰减了百万分之一，此时本底激发光的强度弱于目标荧光、对后续荧光检测构不成干扰。

呈平行状态的入射激发光(图1中带箭头的虚线所示)首先照射到103主二向色镜103上，有1％的激发光透过主二向色镜103进入到检测光路之中，即漏滤入射光。由于入射激发光非常强，这漏虑的1％的入射光的强度远大于初始混合平行光中的本底激发光，更是比透过主二向色镜103进入到检测光路中的二次混合平行光的强度高出几个数量级。在传统的荧光检测光路中这些漏滤入射光直接照射到检测光路的遮光壳体101内表面上，由于平面或弧面上的黑色吸光材料无法一次性完全吸收照射到其表面的光(例如强光照射时人们肉眼能看到黑色材料表面上的亮晕)，在传统的荧光检测光路中未被一次性吸收的漏滤入射光经吸光平面或弧面反射及散射后沿不同的方向(不平行)照射到带通滤光片105上，又因为入射光不满足平行光条件时干涉滤光片的滤光效果会大幅降低，故而采用传统的荧光检测光路时这些非平行激发光有一部分会透过带通滤光片105形成强度较大的内部散射本底激发光最终照射到光电检测传感器上。此外，有些黑色吸光材料遇到较强的短波光照时亦会发射出新的荧光，即为内部荧光，内部荧光为非平行光，故而滤光片对其滤除效果不佳。综上，采用传统的荧光检测光路时，当混合平行光中的有效目标荧光较为微弱时，这些漏滤的入射激发光在检测光路中产生的内部散射本底激发光以及新激发出的内部荧光会对检测结果造成较大的干扰。而本发明中通过多重过滤，能使进入光路中的本体激发光的能量最终衰减到初始的百万分之一，从而不会对荧光检测造成干扰。

其中，激发光光路100用于发出平行的激发光。在一种实施例中，激发光光路100包括激发光光源、准直器、带通滤光片，激发光光源发出的激光经过准直器准直、带通滤光片滤光后变为平行的激发光。

本发明还进一步对锥面消光器108进行了改进，参照图2，在一种优选的实施例中，锥面消光器108包括底座201及设置在底座201上的消光锥阵列202，消光锥阵列202处于遮光壳体101内壁的侧部。

其中，消光锥阵列202中的消光锥的中线与激发光光路100发出的激发光平行，且激发光光路100发出的激发光中透过主二向色镜103的部分可直接照射到消光锥阵列202上。

锥面消光器108通过固定框109安装在遮光壳体101上，遮光壳体101上开设有供消光锥阵列202插入的安装孔，且底座201的底部设置有与固定框109配合的台阶。

在优选的实施例中，整个锥面消光器108采用金属材料一体加工而成，消光锥阵列202通过利用线切割工艺在金属体上切削加工而成，每个消光锥均有4个锥面，即4个线切割切削面，相邻的消光锥之间形成吸光沟道；采用线切割工艺来加工消光锥的锥面看可以大幅增加切削面的粗糙度，有利于对光子的散射和吸收。加工完毕后，整个锥面消光器108的表面采用氧化发黑处理为黑色。

当光线照射到消光锥阵列202丛中之后，绝大部分光线初次接触锥面后就被黑色粗糙的锥面所吸收，少数未被一次性吸收的光在相邻锥体之间的沟道之中多次散射折返后被吸收消失殆尽。消光锥的锥面面积相对于底面面积大幅增加，可以有效分散照射到消光器中的入射光、大幅降低单位面积上的光强，使得在黑色吸光材料中激发出的新荧光大幅减少，即便激发出少量的荧光也会在锥体沟道之间的散射折返过程中被吸收消除，即最终消除内部干扰荧光。

由于扩大了吸收面，单位面积上光强的降低可以大幅减少吸光材料被激发产生的内部干扰荧光；由于增设了众多高深的吸光沟道，本消光锥阵列202有效地增加了光线的散射折返次数使得对光线的吸收更为充分、消光更为彻底，最终起到消除漏滤入射光本底干扰以及内部荧光干扰的作用。

实施例2

进行本发明的实施例1和常规荧光检测系统的效果对比，其中，与实施例1相比，常规荧光检测系统的区别在于其中没有副二向色镜104和锥面消光器108。

具体测量方法及过程如下：在检测之前定制两套中心波长分别为350nm、400nm、450nm、480nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、570nm、600nm、650nm的13种干涉型窄带带通滤光片，将不同中心波长的窄带滤光片安装在滤光片切换条板上组成两套方便快速切换的滤光片组，分别安装在常规荧光检测光路和本发明荧光检测光路的光电转换探测器正前方的透镜前面，即使得常规荧光检测光路和本发明荧光检测光路的荧光汇聚透镜前的窄带滤光片可快速调节；准备好测试样品，对样品进行前处理反应完毕后，先用常规检测光路切换滤光片的方式测量出各波长下的荧光强度得到如图3所示的荧光光强图，再用本发明光路系统切换滤光片的方式测量出各波长下的荧光强度得到如图4所示的荧光光强图。

参照图3，为常规光路检测微弱荧光强的结果图，从图3中可以看出，在不同滤光片波长下均检测到了较强的光，中间520nm附近突起的一个小峰为荧光峰，其余较为平直处的强光信号并非该波长下的真实光强，而是由于滤光片无法100％滤除激发光、部分激发光透过窄带滤光片后照射到光电转换探测器上所产生的本底激发光信号，本底激发光的强度比荧光强度大1个数量级以上，微弱的荧光基本上被较强的本底激发光所淹没。

参照图4，为本发明的实施例1中的检测系统检测微弱荧光强的结果图，从图4中可以看出，本发明光路系统所检测到的荧光峰位明显，荧光峰位前后本底激发光强度只有荧光峰值的约1/10，可以有效地检测出微弱的荧光信号，同时没有在光路系统中再次激发出干扰荧光。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，包括：激发光光路、遮光壳体以及设置在所述遮光壳体内的荧光收集透镜、主二向色镜、副二向色镜、带通滤光片、汇聚透镜、光电转换探测器、锥面消光器；

所述激发光光路发出的激发光呈平行状态入射到所述主二向色镜上后一部分被反射至所述荧光收集透镜，再经所述荧光收集透镜汇聚后照射到样品中，入射到主二向色镜上的激发光中的另一部分透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

样品被激发产生的荧光经所述荧光收集透镜准直后依次透过所述主二向色镜、副二向色镜，再经所述带通滤光片滤光后由所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上；

部分被样品散射的激发光进入所述荧光收集透镜被准直后作为一次激发光照射到所述主二向色镜上，一次激发光中的一部分被所述主二向色镜反射而射出所述遮光壳体，另一部分透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上；二次激发光中的一部分被所述副二向色镜反射至所述锥面消光器上，被分散吸收，另一部分透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上；三次激发光中的一部分被所述带通滤光片反射、再经所述副二向色镜反射至遮光壳体的内壁上，被吸收，另一部分透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

2.根据权利要求1所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99％±0.5％；

所述带通滤光片对激发光的透过率为1％±0.5％。

3.根据权利要求1所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99％；

所述带通滤光片对激发光的透过率为1％。

4.根据权利要求2所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，其中，入射到主二向色镜上的激发光中的1％±0.5％透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

一次激发光中的1％±0.5％透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1％±0.5％透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1％±0.5％透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

5.根据权利要求3所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，其中，入射到主二向色镜上的激发光中的1％透过所述主二向色镜后照射到所述锥面消光器上，被分散吸收；

一次激发光中的1％透过所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1％透过所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1％透过所述带通滤光片作为四次激发光经所述汇聚透镜汇聚至所述光电转换探测器上。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述遮光壳体具有黑色的内外表面。

7.根据权利要求6所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述锥面消光器包括底座及设置在所述底座上的消光锥阵列，所述消光锥阵列处于所述遮光壳体内壁的侧部。

8.根据权利要求7所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述消光锥阵列中的消光锥的中线与所述激发光光路发出的激发光平行，且所述激发光光路发出的激发光中透过所述主二向色镜的部分可直接照射到所述消光锥阵列上。

9.根据权利要求8所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述锥面消光器通过固定框安装在所述遮光壳体上，所述遮光壳体上开设有供所述消光锥阵列插入的安装孔，且所述底座的底部设置有与所述固定框配合的台阶。

10.根据权利要求9所述的消光型微弱荧光检测系统，其特征在于，所述锥面消光器采用金属材料，所述消光锥阵列通过利用线切割工艺在金属体上切削加工而成，每个消光锥均有4个锥面，相邻的消光锥之间形成吸光沟道；整个所述锥面消光器的表面采用氧化发黑处理为黑色。

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