CN112111588A - 一种定量16s宏基因组测序方法 - Google Patents

一种定量16s宏基因组测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量16S宏基因组测序方法，采用随机标签和内参法相结合的方法，有效的提高了菌群结构检测的精准性，降低了实验操作对结果的影响，也提高了测序与其他分子生物学方法间的可比性，对于菌群多样性研究和未知病原检测具有重要的研究价值。

Description

一种定量16S宏基因组测序方法
技术领域
本发明涉及测序领域，具体涉及到一种定量16S宏基因组测序方法。
背景技术
16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大，存在于所有的生物中。16S rDNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。通过在16S rDNA的两个保守区域设计引物，可对样本中所有细菌的相应区域进行扩增，且由于扩增片段大小适中利用测序技术能相对容易地得到其序列，测序结果能体现不同菌属之间的差异，通过与16S数据库(如RDP,SILVA,GreenGene等)比对可获得序列变异和丰度，获得样本物种分类，物种丰度，种群结构，系统进化，群落比较等诸多信息。该技术被称为16S宏基因组测序技术，近年来被广泛用于肠道微生物菌群检测，同时也可用于临床样本的未知病原菌检测。
目前16S宏基因组测序技术主要是基于二代测序技术，受限于二代测序的读长(50～300bp)，目前最多只能测16S九个可变区中的2个，较常采用的为V3-V4区，对菌群的分辨率只能到属水平的百分比。且实验过程中不同因素对结果皆具有一定影响，如样本浓度、PCR循环数、扩增引物等。由于不同研究课题采用的方法不完全一致，由实验因素引入的与实际情况的偏差也各不相同，因此不同项目间的16S宏基因组测序结果间的可比性较差，已有的多个国际、国内公开的16S宏基因组测序项目的数据也不能直接应用到自己的研究课题和检测项目中。同时由于16S宏基因组测序数据目前反应的只是相对含量(即百分比)，其结果也不能与传统的培养法、定量PCR法和数字PCR法等方法的结果直接比对。
由于以上问题，开发一个受实验因素影响较低的，能直接反映菌群中不同菌种实际含量的16S测序方法对于菌群多样性研究和未知病原检测都非常的重要。
发明内容
本发明的第一方面，提供了测序内参在定量16S宏基因组测序中的应用，所述的内参包括模拟16S rDNA保守区或真菌ITS扩增区的内参序列，优选的，所述的16S rDNA保守区包括16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区。
优选的，所述的内参包括模拟16S V3-V4区的内参序列，进一步优选的，所述的测序内参包括341F的扩增引物，随机序列和805R引物，更优选的，所述的随机序列为300bp。
本发明的第二方面，提供了测序数据的自我校正的方法在定量16S宏基因组测序中的应用，所述的自我校正的步骤包括：
1)将具有相同标签的读序归到一组；
2)同组数据比对，找出不一致的位点；
3)基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；
4)生成纠错后的序列。
本发明的第三方面，提供了一种定量16S宏基因组测序数据的分析方法(Q16Spipeline分析方法)，所述的分析方法的步骤包括：首先对具有相同标签的16S序列聚类，基于聚类结果进行测序数据的自我校正，并进行计数和内参统计功能，基于实验中实际添加的内参数，换算出样本中检测出的微生物种属的实际含量(copy数)。
优选的，所述的分析方法加入定量的内参，进一步优选的，所述的内参包括模拟16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区或真菌ITS扩增区的内参序列，进一步优选的，所述的内参包括模拟16S V3-V4区的内参序列，更优选的，所述的测序内参包括341F的扩增引物，随机序列和805R引物，更进一步优选的，所述的随机序列为300bp。
优选的，所述的测序数据的自我校正的步骤包括：
1)将具有相同标签的读序归到一组；
2)同组数据比对，找出不一致的位点；
3)基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；
4)生成纠错后的序列。
本发明的第四方面，提供了一种定量16S宏基因组测序方法，所述的定量16S宏基因组测序方法的具体步骤包括：
(1)采集样本DNA；
(2)加入内参5min；
(3)对含随机序列的引物进行扩增45min；
(4)磁珠清洗，去除引物及二聚体30min；
(5)至少一轮PCR扩增和去除引物及二聚体的磁珠清洗；
(6)文库定量及均一化；
(7)数据分析。
优选的，所述步骤(1)中，所采集的样本数不少于15份，进一步优选的，所采集的样本不少于16份，更优选的，所采集的样本不少于40份；更进一步优选的，所采集的样本为粪便，更进一步优选的，通过问卷调查方式选择的提供样本的志愿者人数不少于7人。
优选的，所述步骤(2)中，加入定量的内参，进一步优选的，所述的内参包括模拟16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区或真菌ITS扩增区的内参序列，进一步优选的，所述的内参包括模拟16S V3-V4区的内参序列，更优选的，所述的测序内参包括341F的扩增引物，随机序列和805R引物，更进一步优选的，所述的随机序列为300bp。
优选的，所述步骤(3)中，所述的扩增引物含有18bp随机序列。
优选的，所述步骤(5)中，所述的PCR扩增和去除引物及二聚体的磁珠清洗的步骤为两轮；进一步优选的，第一轮PCR扩增1h,磁珠清洗，去除引物及二聚体30min；第二轮PCR扩增30min，磁珠清洗，去除引物及二聚体30min。
优选的，所述步骤(7)中，进行分析的样本高质量序列数目不低于3万条reads，碱基数据质量值Q30不低于80％。
优选的，所述步骤(7)中，应用定量16S宏基因组测序数据的分析方法(Q16Spipeline分析方法)进行分析，进一步优选的，所述的定量16S宏基因组测序数据的分析方法的步骤包括：首先对具有相同标签的16S序列聚类，基于聚类结果进行测序数据的自我校正，并进行计数和内参统计功能，基于实验中实际添加的内参数，换算出样本中检测出的微生物种属的实际含量(copy数)。
优选的，所述的测序数据的自我校正的步骤包括：
1)将具有相同标签的读序归到一组；
2)同组数据比对，找出不一致的位点；
3)基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；
4)生成纠错后的序列。
本发明的第五方面，提供了一种微生物检测的方法，使用上述的测序内参、使用上述的定量16S宏基因组测序数据的分析方法或上述的定量16S宏基因组测序方法或根据上述的测序数据的自我校正方法，对微生物进行检测。
本发明的第六方面，提供了一种未知病原菌检测的方法，使用上述的测序内参、使用上述的16S宏基因组测序数据的分析方法或上述的定量16S宏基因组测序方法或根据上述的测序数据的自我校正方法，获得病原菌copy数。
本发明的第七方面，提供了一种肠道菌群结构检测的方法，使用上述的测序内参、使用上述的16S宏基因组测序数据的分析方法或上述的定量16S宏基因组测序方法或根据上述的测序数据的自我校正方法，获得肠道各微生物copy数，得到肠道菌群结构。
本研究建立了一种新的16S宏基因组文库构建方法(Q方法)，该方法相较于常规的16S文库构建方法，具有可定量的优点。采用Q方法建库，我们可以基于读序上的随机标签剔除建库过程中对不同序列的扩增偏好性，同时实验中设计了两种内参，可用于将测序结果中OTU数换算成实际加入的Copy数。该方法有效的提高了肠道菌群结构检测的精准性，降低了实验操作对结果的影响。同时由于将常规的16S测序结果中的百分比结果转化成了copy数结果，基于Q方法建库的16S宏基因组测序结果与数字PCR、定量PCR等分子生物学方法结果更具有横向可比性。
本研究可基于16S V3-V4区进行，该区域是16S宏基因组测序最常采用的扩增区域之一。除此之外，还有16S V1-V3区、V4-V5区等不同扩增区域用于16S宏基因组研究。原则上，只需在本研究基础上替换引物中扩增序列区域即可实现在以上区域中的应用。同时，该建库方法理论上也可应用于真菌ITS扩增。
相较于常规16S建库方法，Q方法拥有可定量且准确度较高的优点。
将本发明的技术效果及优点总结如下：
(1)基于随机标签，剔除建库过程中对不同序列的扩增偏好性；
(2)设计了内参，可用于将测序结果中OTU数换算成实际加入的Copy数；
(3)提高了菌群结构检测的精准性；
(4)降低了实验操作对结果的影响；
(5)与数字PCR、定量PCR等分子生物学方法结果更具有横向可比性；
(6)扩增区域包括16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区，也可应用于真菌ITS扩增。
附图说明
图1实验流程图(A)和文库结构图(B)；
图2数据分析流程图；
图3Alpha指数和PCoA分析；
图4(A)Q方法和N方法样本中内参1/内参2的比值；(B)不同样本间的UnweightedDistance箱式图，从左至右分别为采用N方法的不同样本间距离、采用Q方法的不同样本间距离，相同样本采用相同方法(Q方法)的距离，相同样本采用不同方法间的距离。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的公司获得：
DNA Stool Mini Kit购自QIAamp；
Bioanalyzer购自Angilent，型号2100；
高通量测序平台购自Illumina，型号Miseq；
荧光计购自Invitrogen，型号Qubit2.0。
实施例1定量16S宏基因组测序方法(Q方法)与常规的16S测序方法(N方法)的比较
一、内参设计
人工设计两种含有插入序列的质粒作为测序内参(内参)。内参序列模拟16S V3/V4区，其结构为341F扩增引物+随机序列(300bp)+805R引物。所插入的随机序列已通过Blast方法验证，与已知自然物种序列无匹配。根据合成的质粒浓度和分子量可换算出质粒copy数。每样本建库时添加50000 Copy的内参1和10000 Copy的内参2作为内参。
二、采样及测序实验
采用问卷调查的方式对志愿者人员进行个人情况调查，包含血压、血糖、既往用药或治疗史、饮食习惯及生活习惯、既往病史和家庭病史等，并现场测量身高、体重、血压、血糖。符合高血压、高血糖或近一个月内服用抗生素、便血、便秘或水样便之一情况的人群排除，最终纳入7名符合标准的志愿者,以一个月为间隔采集粪便样本，共收集40份粪便样本。为防止粪便被马桶水污染，采取发放一次性便盆的方式收集样本。收集的粪便样本，按DNAStool Mini Kit试剂盒说明操作。核酸提取后采用Qubit2.0荧光计定量。
以提取的粪便样本核酸为模板，分别按照常规的16S两步建库法(16S V3/V4，N法)和定量16S(Q法)进行文库构建。采用设计含有18bp随机序列的扩增引物，对16S V3-V4区进行序列片段的扩增，实验流程如图1A所示，扩增后的产物结构如图1B所示。然后使用核酸定量试剂盒测定文库浓度，并采用Bioanalyzer2100或1％琼脂糖凝胶电泳检测文库片段大小。对于含有小片段多的文库，采用割胶纯化方法处理或重新建库。合格的文库采用Miseq高通量测序平台完成样本的16S rDNA测序，测序模式为300PE。每个样本的高质量序列数目不低于3万条reads，碱基数据质量值Q30不低于80％。未符合要求的样本不纳入后续分析。
三、数据分析
1多样性比较
取15份粪便样本，分为2份后，分别按照定量16S(简称Q方法)和普通16S方法(简称N方法)建库，并利用Miseq测序平台PE300模式测序。测序数据采用PEAR程序拼接后，对于定量16S方法，基于开发Q16S分析流程开展自矫正和计数计算，并基于Parallel-meta计算各样本的OTU数和多样性指数。普通16S建库方法所得测序数据，同样利用PEAR程序拼接和Parallel-meta3程序计算。
利用Alpha diversity wilcoxon test方法比较不同方法处理的两组样本，Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数无显著差异，如图3所示。
计算样本间Unweighted Distance也显示，相同样本不同方法检测的距离小于不同样本间，如图4所示。
以上结果皆显示Q方法和N方法在多样性检测方面具有较高的一致性，未发现具有显著差异。
2基于Q方法的序列纠错
基于标签法，可对扩增和测序阶段引入的测序错误进行纠错，提高测序数据的准确度。纠错策略如下：第一步，将具有相同标签的读序归到一组；第二步，同组数据比对，找出不一致的位点；第三步，基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；第四步，生成纠错后的序列。
采用Q方法中的随机标签对40份粪便样本测序，并纠错，发现所得测序序列中有平均15.6％序列存在纠错位点。
3重复测序评估Q方法稳定性
对16份粪便样本，一分为二，都采用Q方法建库测序，分别上机。测序结果分析流程同采用Q16S分析流程开展自我校正和计数计算以及多样性指数计算。结果显示两次重复间各多样性指标具有较高的一致性。两次重复间的Distance低于样本间Distance(图4B)。
4内参计数
采用Q方法和N方法建库的样本中都人为添加了两种内参序列。内参序列为人工设计合成的序列，模拟16S V3+V4区结构，序列两端为16S扩展引物。每个样本中添加的内参浓度分别为内参1(50000copy)和内参2(10000copy)。对所有样本分别进行Q方法和P方法测序后，统计测序数据中内参1和内参2的数目，并计算内参1/内参2的比值，如图3B所示。相较于实际添加比率5，Q方法得到两种内参丰度比为2～9.67，略优于方法N的丰度比范围(1～14)(图4A)。
5基于Q16流程的定量分析
为配套Q方法产生的16S测序数据分析，本研究应用Q16Spipeline分析方法，实现对测序数据的自我校正、计数和内参统计等功能，并基于添加的内参实际含量，换算样本中各检测的微生物种属的实际含量。以样本17ZYH03为例，样本中检出高于50000copy的属有15个，其中Bacteroides含量最高，换算所得检测样本中含有275万copy。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。

Claims (11)

1.测序内参在定量16S宏基因组测序中的应用，其特征在于，所述的内参包括模拟16SrDNA保守区或真菌ITS扩增区的内参序列，优选的，所述的16S rDNA保守区包括16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区。
2.一种定量16S宏基因组测序数据的分析方法，其特征在于，所述的分析方法的步骤包括：首先对具有相同标签的16S序列聚类，基于聚类结果进行测序数据的自我校正，并进行计数和内参统计功能，基于实验中实际添加的内参数，换算出样本中检测出的微生物种属的实际含量。
3.根据权利要求2所述的定量16S宏基因组测序数据的分析方法，其特征在于，加入定量的内参，优选的，所述的内参包括模拟16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区或真菌ITS扩增区的内参序列。
4.根据权利要求2所述的定量16S宏基因组测序数据的分析方法，其特征在于，所述的测序数据的自我校正的步骤包括：
1)将具有相同标签的读序归到一组；
2)同组数据比对，找出不一致的位点；
3)基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；
4)生成纠错后的序列。
5.一种定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述的定量16S宏基因组测序方法的具体步骤包括：
(1)采集样本DNA；
(2)加入内参；
(3)对含随机序列的引物进行扩增；
(4)磁珠清洗，去除引物及二聚体；
(5)至少一轮PCR扩增和去除引物及二聚体的磁珠清洗；
(6)文库定量及均一化；
(7)数据分析。
6.根据权利要求5所述的定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入定量的内参，优选的，所述的内参包括模拟16S V1-V3区、V3-V4区、V4-V5区或真菌ITS扩增区的内参序列。
7.根据权利要求5所述的定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述的PCR扩增和去除引物及二聚体的磁珠清洗的步骤为两轮。
8.根据权利要求5所述的定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(7)中，进行分析的样本高质量序列数目不低于3万条reads，碱基数据质量值Q30不低于80％。
9.根据权利要求5所述的定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(7)中，应用定量16S宏基因组测序数据的分析方法进行分析，优选的，定量16S宏基因组测序数据的分析方法的步骤包括：首先对具有相同标签的16S序列聚类，基于聚类结果进行测序数据的自我校正，并进行计数和内参统计功能，基于实验中实际添加的内参数，换算出样本中检测出的微生物种属的实际含量。
10.根据权利要求10所述的定量16S宏基因组测序方法，其特征在于，所述的测序数据的自我校正的步骤包括：
1)将具有相同标签的读序归到一组；
2)同组数据比对，找出不一致的位点；
3)基于打分的方法判断不一致的位点的碱基情况；
4)生成纠错后的序列。
11.一种微生物检测的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的测序内参、权利要求2-4所述的定量16S宏基因组测序数据的分析方法或权利要求5-11所述的定量16S宏基因组测序方法对微生物进行检测。
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