CN112111457A - 一种封闭ptpn2的免疫细胞及其应用与制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物细胞领域，特别涉及封闭PTPN2的免疫细胞及其应用与制剂，该封闭PTPN2的免疫细胞表达嵌合抗原受体，并且所述免疫细胞内的PTPN2功能被封闭，并且其可以分泌anti‑PD‑1抗体。杀瘤能力并且逆转耗竭的方法。本发明将封闭PTPN2功能创新性的与CAR以及anti‑PD‑1免疫调节相结合，以提高免疫细胞的杀瘤活性，以期达到治愈肿瘤的效果。

Description

一种封闭PTPN2的免疫细胞及其应用与制剂
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，特别是涉及一种封闭PTPN2的免疫细胞及其应用与制剂，表达CAR的免疫细胞，封闭胞内PTPN2蛋白功能，优化CD8+T 细胞的扩增能力和杀伤功能，并且与PD-1抑制途径相结合，免疫治疗应答更加明显。
背景技术
近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法(ACT)，即指从病人体内分离出T细胞、NK细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为“十大突破”之首。
CAR-T和TCR-T是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其CAR-T疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的CAR结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scFv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的CAR并不包含胞内共刺激信号，CAR-T细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代CAR开始加入共刺激信号如CD28 和4-1BB，采用不同的共刺激信号的CAR-T细胞的特性也不尽相同，CD28增强了CAR-T细胞的杀伤活性而4-1BB则增强CAR-T细胞杀伤活性的同时延长了CAR-T细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代 CAR，然而其抗肿瘤效果并不如二代CAR-T。因此，现在临床应的主要为二代 CAR-T细胞。
CAR-T疗法不仅在血液肿瘤的治疗上成果显著，而且商业化进展顺利，美国FDA于2017年正式批准了两种CAR-T药品上市。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗上大放异彩，而对于实体瘤却并没有较好的治疗效果，T细胞不易进入肿瘤，无法在肿瘤中大量扩增及容易发生脱靶等毒副作用，是其临床应答率低的主要作用。
研究发现，T细胞的PTPN2基因敲除后，促进了CD8+TIM-3+T细胞的大量分化和扩增。并且在小鼠肿瘤模型中，发现敲除了PTPN2后，肿瘤组织中 CD8+TIM-3+T大量浸润，较PTPN2未敲除的小鼠，肿瘤清除更彻底，有效延长小鼠生存期。可见，PTPN2基因敲除，利于T细胞向CD8+TIM-3+表型分化，且后者更容易在肿瘤细胞中富集，发挥靶向杀瘤作用。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种封闭PTPN2的免疫细胞，杀瘤能力并且逆转耗竭的方法。本发明将封闭PTPN2功能创新性的与CAR以及 anti-PD-1免疫调节相结合，以提高免疫细胞的杀瘤活性，以期达到治愈肿瘤的效果。
一种封闭PTPN2的免疫细胞，包括免疫细胞表达嵌合抗原受体，并且所述免疫细胞内的PTPN2功能被封闭，并且其可以分泌anti-PD-1抗体。
在其中一个实施例中，免疫细胞为T细胞、NKT细胞、gamma-delta T细胞、 TIL细胞或TCR-T细胞。
在其中一个实施例中，将表达嵌合抗原受体的基因转入到所述免疫细胞进行表达嵌合抗原受体。
在其中一个实施例中，封闭PTPN2功能的方式为采用靶向PTPN2的抗体或抑制剂封闭阻断PTPN2下游信号，或者采用crispr-cas9基因或talen基因编辑技术将PTPN2基因敲除。
在其中一个实施例中，将表达靶向PTPN2的抗体或抑制剂的基因转入所述免疫细胞发挥作用。
在其中一个实施例中，靶向PTPN2的抗体和/或抑制剂的基因转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子或其它递送系统。
在其中一个实施例中，anti-PD-1抗体选自单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人抗体、纳米抗体以及合成抗体中的一种或多种。
在其中一个实施例中，anti-PD-1抗体为抗体全长序列、scFv、Fab或(Fab) 2，或者任意可以行使抗体功能、包括抗体可变区的序列结构。
在其中一个实施例中，嵌合抗原受体包含前导序列，识别肿瘤相关抗原的 scFv、铰链区和跨膜结构域，以及胞内共刺激信号和胞内激活信号CD3ζ。
在其中一个实施例中，嵌合抗原受体包含前导序列，识别实体瘤靶点的 scFv，CD28或CD8铰链区和跨膜结构域，CD28或CD137(4-1BB)或者ICOS 共刺激结构域，以及胞内激活信号CD3ζ。
在其中一个实施例中，识别实体瘤靶点的scFv为EGFR、GPC3或 Claundin18.2的scFv。
在其中一个实施例中，嵌合抗原受体的表达可以是靶向一个靶点的CAR，也可以是靶向两个靶点或者多个靶点的CAR。
上述任一项所述的封闭PTPN2的免疫细胞可应用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物。
本发明还提供了一种制剂，含有上述任一项所述的封闭PTPN2的免疫细胞。
本发明封闭PTPN2的免疫细胞的主要优点包括：
1、免疫细胞表达CAR，特异性识别肿瘤细胞；
2、免疫细胞表达靶向PTPN2的抗体，封闭PTPN2功能，促进TIM-3+CD8+T 细胞的增值和分化，有研究表明TIM-3+CD8+T细胞在肿瘤组织中的扩增明显增高，可以增强其在体内的存活时间和杀瘤能力；
3、本发明的免疫细胞封闭PTPN2功能，是通过表达胞内的anti-PTPN2的封闭抗体，在胞内起作用，不分泌到胞外，避免对机体的毒性，安全性更高；
4、本发明的免疫细胞在封闭PTPN2功能的同时，还分泌anti-PD-1抗体，有效减少T细胞的耗竭，增强其杀伤功能。
附图说明
图1为实施例1中GPC3 CAR、PGPC3 CAR及PPGPC3 CAR的结构；
图2为实施例1的细胞扩增曲线；
图3为实施例1中培养第6天的4种T细胞CAR的表达情况；
图4为实施例1中4种T细胞的体外杀伤实验；
图5为实施例1中的封闭PTPN2的免疫细胞与GPC3+靶细胞共培养后，细胞因子的分泌情况；
图6为实施例1将CAR-T细胞培养至21天后，4种T细胞的TIM-3表达情况；
图7为将不同的CAR-T细胞与Huh7肿瘤细胞以1：1培养17天后，CAR-T 细胞的扩增曲线；
图8为实施例1的CAR-T细胞被靶抗原刺激28天后的体外杀伤实验；
图9为实施例1的PPGPC3 CAR-T清除NSG小鼠模型中的肿瘤细胞的实验；
图10为实施例1的PPGPC3 CAR-T在肿瘤组织中的扩增情况；
图11为实施例1中CD8+TIM-3+细胞在CD3+CAR+T中的占比情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明提供了一种封闭PTPN2的免疫细胞，包括免疫细胞表达嵌合抗原受体，并且所述免疫细胞内的PTPN2功能被封闭，并且其可以分泌anti-PD-1抗体。
免疫细胞可以为T细胞、NKT细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞或TCR-T 细胞。
将表达嵌合抗原受体的基因转入到所述免疫细胞进行表达嵌合抗原受体。
封闭PTPN2功能的方式为采用靶向PTPN2的抗体或抑制剂封闭阻断 PTPN2下游信号，或者采用crispr-cas9基因或talen基因编辑技术将PTPN2基因敲除。
将表达靶向PTPN2的抗体或抑制剂的基因转入免疫细胞发挥作用。
靶向PTPN2的抗体和/或抑制剂的基因转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子或其它递送系统。
anti-PD-1抗体选自单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人抗体、纳米抗体以及合成抗体中的一种或多种。
anti-PD-1抗体为抗体全长序列、scFv、Fab或(Fab)2，或者任意可以行使抗体功能、包括抗体可变区的序列结构。
嵌合抗原受体包含前导序列，识别肿瘤相关抗原的scFv、铰链区和跨膜结构域，以及胞内共刺激信号和胞内激活信号CD3ζ。
嵌合抗原受体包含前导序列，识别实体瘤靶点的scFv，CD28或CD8铰链区和跨膜结构域，CD28或CD137(4-1BB)或者ICOS共刺激结构域，以及胞内激活信号CD3ζ。
识别实体瘤靶点的scFv为EGFR、GPC3或Claundin18.2的scFv。
嵌合抗原受体的表达可以是靶向一个靶点的CAR，也可以是靶向两个靶点或者多个靶点的CAR。
本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的免疫细胞进行详细说明。本发明的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NKT细胞、TIL、gamma-delta T细胞等同于 T细胞。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语CAR：嵌合抗原受体CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、 ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs，并且还有在同一个细胞上表达靶向2个靶点或者多个靶点的的双CAR或者多CAR等
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括抗原结合结构域。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和CD3ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在本发明的一个较佳的实施方案中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向GPC3的抗原结合结构域。本发明的CAR在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，CAR-T 细胞会靶向性裂解肿瘤细胞，导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28/4-1BB/ICOS信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，在其跨膜结构域前或者后加入起调控作用的氨基酸序列，使CAR的表达随靶抗原的浓度而变化。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰。
本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28/4-1BB/ICOS的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。
术语“表达框”：在其中一个实施方案中，表达框包括第一表达框、第二表达框和第三表达框。第一表达框包含编码所述CAR的核酸序列。第二表达框表达靶向PTPN2的抗体。第三表达框编码靶向PD-1的分泌型抗体。在其中一个实施方案中，有第四表达框，表达另一个CAR，即为有两个跨膜区的双CAR，或者多CAR。在一个实施方案中，所述第一表达框、第二表达框和第三表达框分别还包括启动子，所述的第一表达框、第二表达框、第三表达框位于相同或不同的载体上。优选地，所述的第一表达框、第二表达框和第三表达框位于同一载体。
术语“载体”，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述的载体为病毒载体。
载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达框的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体，其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中；可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞；低免疫原性；安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列，另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1 α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40) 早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR) 启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体转染法。核酸可与脂质相关联，与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
本发明提供了含有如上所述的免疫细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104～1×107个细胞/ml。在一个实施方案中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞，且CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。且本发明的CAR-T可以分泌anti-PD-1抗体，封闭 PTPN2的功能，促进CAR-T细胞的扩增，提高CAR-T细胞的活力持久性，不易耗竭，长时间维持抗肿瘤活性
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，GPC3 CAR-T细胞引起抗表达GPC3的细胞的特异性免疫应答。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明免疫细胞，修饰T细胞的离体程序，以下中的至少一项在将细胞施用进入人体前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸和编码双特异性抗体的核算引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，人外周血中分离的细胞用于表达本文公开的CAR和双特异性抗体。修饰的细胞可被施用给接受者，以提供治疗益处。免疫细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
本发明免疫细胞的修饰的T细胞可被单独施用或与其他药物、药物组合物、稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
采用本发明免疫细胞制成的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，并由临床方案确定。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以1×104～1×109个细胞/kg体重的剂量，优选1×105～1×106个细胞/kg 体重的剂量施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员确定。
本发明的制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方案中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T 细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷 (也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方案中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方案中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方案中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明免疫细胞的主要优点包括1、免疫细胞表达CAR，特异性识别肿瘤细胞。2、免疫细胞表达靶向PTPN2的抗体，封闭PTPN2功能，促进TIM-3+CD8+T 细胞的增值和分化，有研究表明TIM-3+CD8+T细胞在肿瘤组织中的扩增明显增高，可以增强其在体内的存活时间和杀瘤能力。3、本发明的免疫细胞封闭PTPN2 功能，是通过表达胞内的anti-PTPN2的封闭抗体，在胞内起作用，不分泌到胞外，避免对机体的毒性，安全性更高。4、本发明的免疫细胞在封闭PTPN2功能的同时，还分泌anti-PD-1抗体，有效减少T细胞的耗竭，增强其杀伤功能。
实施例1
本实施例免疫细胞的制备方法及功能验证包括以下步骤：
步骤一：外周血PBMC的分离和T细胞的扩增
从供体外周血中分离单个核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads,human-lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用 TexMACS GMP Medium(MiltenyiBiotec，170-076-309)，含10％FBS，2mM L-glutamine，100IU/ml rhIL2，所有细胞均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
步骤二：细胞系培养
表达GPC3的细胞系：Huh-7(人肝癌细胞)，购自ATCC。
不表达GPC3的细胞系：A549(人非小细胞肺癌细胞)，购自ATCC。
包装用细胞：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。
培养基培养：Huh-7、A549、293T使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。
步骤三：CAR结构设计与慢病毒包装
GPC3-CAR结构，即靶向GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)的CAR结构：
本发明方法一个实施例中将靶向PTPN2的抗体、第二代CAR及分泌型的 PD-1抗体构建在一个表达框上，用P2A连接，命名为PPGPC3 CAR。CAR的核心结构包括分泌信号肽序列；来自anti-GPC3的抗体的scFv(专利号：US 2007/0190599A1)；CD8跨膜区；胞内段刺激信号4-1BB-CD3ζ。
本发明构建的第二个CAR，即将第二代CAR和分泌型的PD-1抗体放在一个表达框上，以P2A连接，命名为PGPC3 CAR。
本发明以只有CAR的表达框作为对照，命名为GPC3 CAR，如图1为3种 CAR的结构图。
将表达框克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-GPC3-CAR、PHBLV-EF1α-PGPC3-CAR和PHBLV-EF1 α-PPGPC3-CAR，将PHBLV-EF1α-GPC3-CAR或者PHBLV-EF1α-PGPC3-CAR 或者PHBLV-EF1α-PPGPC3-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene， Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。
步骤四：CAR-T细胞制备
4.1慢病毒感染
分离纯化的原代T细胞在激活1天后，利用步骤三包装的3种慢病毒，按 MOI(1-10)进行慢病毒载体感染，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
4.2细胞增殖及CAR阳性率检测
利用3种慢病毒载体，成功构建了3种CAR-T细胞，分别命名为PPGPC3 CAR T、PGPC3CAR T、GPC3 CAR T，以不感染慢病毒的T细胞为对照(NT)
第6、9、11、13天每天取样检测细胞数量，第6天检测T细胞的CAR阳性率，并于第13天分别检测PTPN2的表达。每隔1-2天传代补加培养基。
如图2所示：3种CAR-T细胞及NT的增殖速率，插入抗体的序列对于细胞的增值速率无显著影响。
如图3所示：是第6天4种T细胞CAR的表达情况，可见抗体对CAR阳性率无显著影响。
步骤5：细胞体外杀伤实验
对步骤4获得的4种-T细胞进行体外杀伤实验。LDH法(promega：G1780) 检测CAR-T细胞的杀伤效应，靶细胞与效应细胞共孵育6h，杀伤效率明显，且分泌PD-1抗体和封闭PTPN2对CAR-T的体外短暂杀伤活性无显著性影响。如图4。
步骤6：细胞因子释放检测
将CAR-T细胞(步骤4获得)与靶细胞(A549、Huh-7)分别以1：1效靶比混合，置于RPMI培养基中，共培养24h，收集上清，离心后取上清检测细胞因子 IFN-γ与IL2的释放水平，采用Elisa试剂盒(abbkine，KET6011、KET6014)进行检测。
结果如图5所示，与GPC3+靶细胞共培养后，CAR-T细胞会释放大量IFN- γ与IL-2，与GPC3-靶细胞共培养后，CAR-T细胞只少量分泌IFN-γ与IL-2。表明CAR-T能被肿瘤表面GPC3抗原有效且特异性的激活。
步骤7：模拟CAR-T细胞耗竭后的体外杀伤实验。
将CAR-T细胞培养至21天，检测4种T细胞的TIM-3表达情况，如图6，可知，封闭PTPN2会促进TIM-3+T细胞的表达。
将不同的CAR-T细胞与Huh7肿瘤细胞以1：1培养，每隔2天计数，补加 Huh7肿瘤细胞，使CAR-T细胞与Huh7肿瘤细胞的比例为1：1。共培养17天，收集细胞进行检测，CAR-T细胞增值曲线如图7。如图可知，T细胞与肿瘤细胞共培养17天后，GPC3 CAR-T由于特异性抗原的持续刺激，其生长曲线前期升高，在第9天，开始下降；PGPC3 CAR-T由于PD-1负反馈信号的封闭，其在一定程度上延迟了CAR-T细胞的耗竭，前期细胞增殖更多，前期处于上升阶段，第13天开始下降；PPGPC3 CAR-T由于其对PTPN2的封闭，促进TIM-3+T细胞的大量扩增和分化，及PD-1负反馈信号的封闭，其扩增曲线在17天内一直处于上升阶段。
将不同的CAR-T细胞加入GPC3蛋白，培养28天，模拟抗原刺激T细胞的体外耗竭，收集经过刺激的T细胞进行杀伤实验，结果如图8。由此可知，封闭PTPN2不会影响T细胞的杀伤活性，有和PGPC3 CAR-T一样的逆转耗竭的能力。
步骤8：PPGPC3 CAR-T的体内药效验证
取6-8周龄的NSG小鼠，皮下移植Huh7(GPC3+)肿瘤细胞，构建小鼠肿瘤模型。当其肿瘤体积约为10mm3时，随机分为5组，每组15只，静脉注射 PPGPC3 CAR-T、PGPC3 CAR-T、GPC3 CAR-T、NT、PBS。以注射当天为第0 天，观察小鼠生存情况，肿瘤负荷。并于第9天，随机每组取3只小鼠的肿瘤，检测肿瘤浸润的CAR-T细胞。于第5、10、15、20、25、30随机每组取2只小鼠，取肿瘤组织，量取体积。
由图9可知，PPGPC3 CAR-T可以有效清除NSG小鼠模型中的肿瘤细胞
由图10、11可知，是肿瘤组织中CAR-T细胞的浸润，PPGPC CAR-T在肿瘤组织中的浸润数量最大，且其中约80％为TIM-3+CD8+CAR-T细胞。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体，并且所述免疫细胞内的PTPN2功能被封闭，并且其可以分泌anti-PD-1抗体。
2.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NKT细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞或TCR-T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，将表达所述嵌合抗原受体的基因转入到所述免疫细胞进行表达嵌合抗原受体。
4.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述封闭PTPN2功能的方式为采用靶向PTPN2的抗体或抑制剂封闭阻断PTPN2下游信号，或者采用crispr-cas9基因或talen基因编辑技术将PTPN2基因敲除。
5.根据权利要求4的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，将表达靶向PTPN2的抗体或抑制剂的基因转入所述免疫细胞发挥作用。
6.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述靶向PTPN2的抗体和/或抑制剂的基因转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子或其它递送系统。
7.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述anti-PD-1抗体选自单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人抗体、纳米抗体以及合成抗体中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述anti-PD-1抗体为抗体全长序列、scFv、Fab或(Fab)2，或者任意可以行使抗体功能、包括抗体可变区的序列结构。
9.根据权利要求1或2所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含前导序列，识别肿瘤相关抗原的scFv、铰链区和跨膜结构域，以及胞内共刺激信号和胞内激活信号CD3ζ。
10.根据权利要求9所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含前导序列，识别实体瘤靶点的scFv，CD28或CD8铰链区和跨膜结构域，CD28或CD137(4-1BB)或者ICOS共刺激结构域，以及胞内激活信号CD3ζ。
11.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，所述识别实体瘤靶点的scFv为EGFR、GPC3或Claundin18.2的scFv。
12.根据权利要求1所述的封闭PTPN2的免疫细胞，其特征在于，嵌合抗原受体的表达可以是靶向一个靶点的CAR，也可以是靶向两个靶点或者多个靶点的CAR。
13.权利要求1至12任其一项所述封闭PTPN2的免疫细胞在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中应用。
14.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1至12任一项所述的封闭PTPN2的免疫细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DOK HYUN YOON ET AL.: "Incorporation of Immune Checkpoint Blockade into Chimeric Antigen Receptor T Cells (CAR-Ts): Combination or Built-In CAR-T", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 *
FLORIAN WIEDE ET AL.: "PTPN2 phosphatase deletion in T cells promotes anti-tumour immunity and CAR T-cell efficacy in solid tumours", 《THE EMBO JOURNAL》 *

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