CN112110941A

CN112110941A - 一种作为Hippo信号通路抑制剂的化合物

Info

Publication number: CN112110941A
Application number: CN201910543995.9A
Authority: CN
Inventors: 杨胜勇; 李琳丽
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: CN112110941B

Abstract

本发明提供了一种式Ⅰ所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体。本发明化合物对Hippo信号通路具有抑制作用，可用于制备Hippo信号通路抑制剂。同时，抑制Hippo信号通路可以促进细胞增殖，利于损伤器官再生，特别是可促进受损肝组织再生，可以有效修复急性肝损伤。因此，本发明化合物也可以用于制备治疗与Hippo信号通路相关的各种疾病的药物，如利于损伤器官再生的药物，特别是利于受损肝组织再生的药物，还可以用于制备修复急性肝损伤的药物。本发明化合物可用于器官再生领域用药研究。

Description

一种作为Hippo信号通路抑制剂的化合物

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及一种作为Hippo信号通路抑制剂的化合物。

背景技术

创伤、疾病或衰老会导致器官组织损伤，这就需要激活再生来恢复器官的功能。然而，成人的大多数器官几乎没有再生的潜力，器官的受损和纤维化，最终将导致器官功能的失调。

Hippo信号通路是一条进化上高度保守的信号通路，该通路在调控器官大小、组织稳态以及肿瘤发生发展中起着至关重要的作用。Hippo信号通路的核心主要由激酶MST1/2和LATS1/2、衔接蛋白Sav1和MOB1、转录共激活因子YAP/TAZ以及转录因子TEAD等所构成，其中，YAP/TAZ的细胞核内水平直接反映Hippo信号通路的活性。当Hippo信号通路被抑制时，YAP/TAZ进入细胞核中并结合TEAD，刺激下游靶基因的转录，促进细胞增殖或诱导干细胞相关基因的表达。

研究表明：使用Hippo信号通路小分子抑制剂可实现药理性短暂抑制Hippo信号通路，刺激小鼠受损器官(包括几乎不具备再生能力的心脏)的再生。目前所报道的Hippo信号通路小分子抑制剂非常少，并且，明确报道可在一定程度上刺激再生的Hippo信号通路小分子抑制剂仅有XMU-MP-1一例。因此，开发新型Hippo信号通路抑制剂具有重要意义，可为再生医学相关研究提供帮助。

发明内容

本发明的目的是提供一种作为Hippo信号通路抑制剂的化合物，具体提供一种作为Hippo信号通路抑制剂的1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉衍生物。

本发明提供了一种式Ⅰ所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体：

其中，

R¹选自氢、取代或未取代的C₁～C₈烷基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、酯基、取代或未取代的3～8元芳基；

R²选自氢、取代或未取代的C₁～C₈烷基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基；

R³选自-NR⁴R⁵、取代或未取代的3～8元芳基、取代或未取代3～8元杂芳基、取代或未取代的5～15元稠环基；

R⁴、R⁵分别独立的选自氢、C₁～C₈烷基、取代或未取代的3～8元芳基、取代或未取代的3～8元杂芳基、取代或未取代的5～10元稠环基、吡啶酮基；

所述烷基的取代基为卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、取代或未取代的3～8元芳基；

所述烷氧基的取代基为卤素、3～8元芳基；

所述芳基的取代基为卤素、羟基、氨基、酯基、酰胺基、取代或未取代的C₁～C₈烷基、取代或未取代的C₁～C₈烷氧基、-NR⁴R⁵；

所述杂芳基的取代基为卤素、氰基、氨基、羧基、硝基、C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基、-NR⁴R⁵、3～8元杂环基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基。

进一步地，

R¹选自取代或未取代的C₁～C₆烷基、取代或未取代的3～6元芳基；

R²选自氢、卤素；

R³选自-NR⁴R⁵、取代或未取代的3～6元芳基、取代或未取代3～6元杂芳基、取代或未取代的9～13元稠环基；

R⁴、R⁵分别独立的选自氢、C₁～C₆烷基、取代或未取代的3～6元芳基、取代或未取代的3～6元杂芳基、取代或未取代的6～10元稠环基、吡啶酮基；

所述烷基的取代基为卤素、羟基、取代或未取代的3～6元芳基；

所述烷氧基的取代基为3～6元芳基；

所述芳基的取代基为卤素、羟基、氨基、酯基、酰胺基、取代或未取代的C₁～C₆烷基、取代或未取代的C₁～C₆烷氧基、-NR⁴R⁵；

所述杂芳基的取代基为卤素、氰基、氨基、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、-NR⁴R⁵、3～6元杂环基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基。

进一步地，

R¹选自取代或未取代的C₁～C₃烷基、取代的苯基；

R²选自氢、卤素；

R³选自-NR⁴R⁵、取代或未取代的苯基、取代或未取代5～6元杂芳基、取代或未取代的9～13元稠环基；

R⁴、R⁵分别独立的选自氢、C₁～C₃烷基、取代或未取代的苯基、6元杂芳基、9元稠环基、吡啶酮基；

所述烷基的取代基为卤素、羟基、取代或未取代的苯基；

所述烷氧基的取代基为苯基；

所述苯基的取代基为卤素、羟基、氨基、酯基、酰胺基、取代或未取代的C₁～C₃烷基、取代或未取代的C₁～C₃烷氧基、-NR⁴R⁵；

所述杂芳基的取代基为卤素、氰基、氨基、C₁～C₃烷基、C₁～C₃烷氧基、-NR⁴R⁵、5～6元杂环基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₃烷基、C₁～C₃烷氧基；

所述杂芳基中杂原子选自N、S、O，所述杂芳基的杂原子个数为1或2；

所述杂环基中杂原子选自N、O，所述杂环基的杂原子个数为1或2。

进一步地，

R⁴、R⁵分别独立的选自氢、甲基、取代或未取代的苯基、6元杂芳基、9元稠环基、吡啶酮基；

所述苯基的取代基为卤素、羟基、氨基、酯基、酰胺基、取代或未取代的甲基、取代或未取代的C₁～C₂烷氧基、-NR⁴R⁵；

所述杂芳基的取代基为卤素、氰基、氨基、甲基、甲氧基、-NR⁴R⁵、5～6元杂环基；

所述稠环基的取代基为甲基、C₂烷氧基。

进一步地，所述式Ⅰ所示化合物为式Ⅱ所示：

其中，A环选自未取代的9元稠环基。

进一步地，所述式Ⅱ所示化合物的结构如下：

进一步地，所述式Ⅰ所示化合物为式Ⅲ所示：

进一步地，所述式Ⅲ所示化合物的结构如下：

本发明还提供了前述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体在制备Hippo信号通路抑制剂中的用途。

本发明还提供了前述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体在制备治疗与Hippo信号通路相关疾病的药物中的用途。

进一步地，所述药物可以促进受损器官再生。

进一步地，所述药物可以促进受损肝组织再生。

进一步地，所述药物可以修复肝损伤。

进一步地，所述肝损伤为急性肝损伤。

本发明还提供了一种药物，它是由前述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。

本发明中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

本发明中，“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

本发明中，碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀C_a～C_b烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C₁～C₄烷基是指包含1～4个碳原子的烷基。

本发明中，“卤素”为氟、氯、溴或碘。

本发明中，“3～8元芳基”为含有至少一个碳碳双键的含3～8个碳原子的不饱和碳环。

本发明中，“3～8元杂芳基”为芳基的碳环上至少一个碳原子被杂原子取代；其中杂原子指氮原子、氧原子、硫原子；

本发明中，“5～15元稠环基”至少含有一个稠环。

本发明中过夜时间为12±2h。

本发明中室温为25±5℃。

本发明化合物对Hippo信号通路具有抑制作用，可用于制备Hippo信号通路抑制剂。同时，抑制Hippo信号通路可以促进细胞增殖，利于损伤器官再生，特别是可促进受损肝组织再生，可以有效修复急性肝损伤。因此，本发明化合物也可以用于制备治疗与Hippo信号通路相关的各种疾病的药物，如利于损伤器官再生的药物，特别是利于受损肝组织再生的药物，还可以用于制备修复急性肝损伤的药物。本发明化合物可用于器官再生领域用药研究。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为化合物对A549-CTGF细胞中内源性基因CTGF和Cyr61的影响。

图2为免疫荧光检测A549-CTGF细胞和HepG2细胞中的YAP核定位的结果图。

图3为化合物对Hippo信号通路中YAP和TAZ蛋白以及YAP和TAZ基因表达的影响。

图4为化合物对体内受损肝组织的促再生能力的组织切片图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明1H-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物的主要合成路线如下：

实施例1、6-溴-3-硝基喹啉-4-羟基的制备(中间体2a)

向浓盐酸(37％)与水的混合液(10：1)中加入2-氨基-5溴苯甲酸(原料1a，50g，230mmol)，常温下搅拌8小时后过滤，得滤液A。在另一个反应瓶中将碎冰(70g)与氢氧化钠(30g,750mmol)于冰浴下搅拌混合，向其中缓慢加入硝基甲烷(16.4g,268mmol)，加毕后于冰浴下反应1小时，再移至室温继续搅拌1小时后将该混合液倾入冰浴下的酸性水溶液(56g冰与84mL浓盐酸的混合液)中，得含硝基乙醛肟的溶液B。将所得的A、B溶液混合，于室温下搅拌18小时。反应液中析出大量黄色沉淀，过滤，滤饼用水洗涤，经真空干燥即得粗品中间体1a，无需进一步纯化，直接用于下一步反应。

在圆底烧瓶中加入5-溴-2-((2-硝基乙烯基)氨基)苯甲酸(中间体1a，10g，34mmol)，醋酸钾(4g,42mmol)，用醋酸酐80mL作反应溶剂，于120℃反应2小时。将反应液进行过滤，滤饼用乙酸洗涤，再用水洗，滤饼进一步真空干燥即可得中间体2a(4.78g，两步总收率为29％)。灰色固体，¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.28(s,1H),8.61(d,1H,J＝2Hz),8.11(d,1H,J＝9Hz),8.04(dd,1H,J＝8.5Hz,2Hz).ESI-MSm/z:268.9[M+H]⁺.

实施例2、6-溴-4-氯-3-硝基喹啉的制备(中间体3a)

将6-溴-3-硝基喹啉-4-酚(15g,56mmol)加入圆底烧瓶中，直接以三氯氧磷(80mL)做溶剂，于100℃下回流反应3小时。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分三氯氧磷，将剩下的混合液缓慢倒入碎冰中淬灭，用饱和碳酸氢钠中和后再用乙酸乙酯萃取，反萃2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后旋干得粗品中间体3a(15.2g,收率为95％)，棕色固体。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.20(s,1H),8.52(d,1H),8.02(d,1H),7.94(m,1H).

实施例3、(S)-6-溴-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-3-硝基喹啉-4-胺的制备(中间体4a)

于圆底烧瓶中加入6-溴-4-氯-3-硝基喹啉(1.42g,5mmol)，三乙胺(1.01g,10mmol)，用乙醇(20mL)溶解，常温搅拌下缓慢加入(S)-1-(3-氟苯基)乙胺(695mg,5mmol)，加毕后将混合液移至60℃下反应过夜。反应完毕后，减压蒸去溶剂，向残渣中加入大量水，析出黄色固体，过滤，用水洗涤，滤饼经真空干燥后即得中间体4a(1.58g,收率为80％)黄色固体，¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.84(d,J＝7.2Hz,1H),9.38(s,1H),8.22(d,J＝2.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.9Hz,1H),7.76(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H),7.51–7.38(m,1H),7.23(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(dt,J＝9.5,2.0Hz,1H),7.04(td,J＝8.3,2.3Hz,1H),5.31(p,J＝6.7Hz,1H),1.76(d,J＝6.6Hz,3H).ESI-MS m/z:390.1[M+H]⁺.

实施例4、(S)-8-溴-1-(1-(3-氟苯基)乙基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉的制备(中间体6a)

于圆底烧瓶中加入(S)-6-溴-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-3-硝基喹啉-4-胺(1.17g,3mmol),用醋酸(30mL)溶解,该混合物于60℃搅拌下分批加入还原铁粉(850mg,15mmol)，加毕后继续于60℃下搅拌约4小时。反应完毕后，移至室温，得到溶于醋酸中的还原后中间体5a，无需进一步提纯，直接投下一步。

将所得到的中间体5a的醋酸溶液置于冰浴中搅拌，加入60mL水,加毕后使用浓盐酸将溶液调至酸性(pH＝2-3)。向该混合液中缓慢加入亚硝酸钠(230mg,3.3mmol)，加毕后撤去冰浴，于室温下搅拌30分钟。TLC监测反应完毕后，将反应液倾入大量水中，用碳酸钠中和醋酸，再用乙酸乙酯萃取，反萃2次，合并有机相，干燥过滤，减压蒸干后经柱层析分离提纯，得中间体6a(980mg,两步总收率79％)白色固体，¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.58(s,1H),8.21(d,J＝2.1Hz,1H),8.15(d,J＝8.9Hz,1H),7.83(dd,J＝8.9,2.1Hz,1H),7.36(td,J＝8.0,5.8Hz,1H),7.08–6.96(m,2H),6.89(dt,J＝9.4,2.0Hz,1H),6.38(q,J＝7.0Hz,1H),2.34(d,J＝7.0Hz,3H).ESI-MS m/z 370.0[M+H]⁺.

实施例5、5-溴-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备(中间体7a)

将5-溴-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(5g,25mmol)加入烧瓶中，用100mL无水四氢呋喃溶解，冰浴下分批加入氢化钠(3.1g,76mmol)，加毕后继续搅拌10分钟。然后缓慢加入苯磺酰氯(5g,28mmol)，加毕后再搅拌20分钟。反应完成后，减压蒸去四氢呋喃，残渣用水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥过滤，减压蒸干即得中间体7a(8.5g,收率为99％)。白色固体，¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.44(s,1H),8.17(d,J＝7.8Hz,2H),7.96(s,1H),7.74–7.73(m,1H),7.55(t,J＝7.4Hz,1H),7.47–7.38(m,2H),6.55(d,J＝4.0Hz,1H).ESI-MS m/z336.9[M+H]⁺.

实施例6、1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-硼酸频哪醇酯的制备(中间体8a)

于烧瓶中加入5-溴-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(2g,5.9mmol)、联硼酸频哪醇酯(2.3g,8.9mmol)、醋酸钾(1.75g,18mmol)以及催化剂PdCl₂(dppf)(220mg,0.3mmol)，加入100mL二氧六环作溶剂，在氩气保护下于100℃搅拌过夜。反应完毕后，冷却至室温，减压蒸去溶剂，经柱层析分离提纯得硼酸酯中间体8a(1.6g，70％)黄色固体，¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(d,J＝1.5Hz,1H),8.29(d,J＝1.5Hz,1H),8.11(d,J＝7.5Hz,2H),7.92(d,J＝4.0Hz,1H),7.75–7.69(m,1H),7.63–7.58(m,2H),6.85(d,J＝4.0Hz,1H),1.30(s,12H).ESI-MS m/z 385.1[M+H]⁺.

实施例7、(S)-1-(1-(3-氟苯基)乙基)-8-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉的制备(化合物1)

向反应瓶中加入中间体6a(82mg,0.2mmol)、中间体8a(85mg,0.22mmol)、催化剂PdCl₂(dppf)(8mg,0.011mmol)、碳酸钾(56mg,0.4mmol)，加入二氧六环与水的4：1混合溶液(2mL)作溶剂，氩气保护下与100℃下反应过夜。反应完毕后，冷却至室温，减压蒸去溶剂，经柱层析分离得到带苯磺酰基保护的中间体，将其用2mL乙醇溶解后加入1mL浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，升温至回流反应8小时。反应完毕后，减压蒸去乙醇，用乙酸乙酯进行萃取，反萃2次，合并有机相，干燥过滤，减压蒸去溶剂后经柱层析分离提纯，得到化合物1(48mg，两步收率58％)黄色固体，¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.83(s,1H),9.61(s,1H),8.58(d,J＝2.2Hz,1H),8.46(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(d,J＝8.6Hz,1H),8.24–8.16(m,2H),7.59(t,J＝2.9Hz,1H),7.43–7.35(m,1H),7.32–7.25(m,1H),7.19–7.11(m,1H),7.05(q,J＝6.7Hz,1H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),6.60–6.55(m,1H),2.23(d,J＝6.7Hz,3H).MS(ESI)m/z:409.1[M+H]⁺.

采用与化合物1相似的合成步骤，可得化合物2-18，两步收率35％-77％。具体表征数据如下：

实施例8、(S)-1-(1-苯基乙基)-8-(喹啉-4-基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉的制备(化合物19)

向反应瓶中加入中间体6k(71mg,0.2mmol)、喹啉-4-硼酸(38mg,0.22mmol)、催化剂PdCl₂(dppf)(8mg,0.011mmol)、碳酸钾(56mg,0.4mmol)，加入二氧六环与水的4：1混合溶液(2mL)作溶剂，氩气保护下与100℃下反应过夜。反应完毕后，冷却至室温，减压蒸去溶剂，经柱层析分离提纯得到化合物19(49mg,收率为62％)黄色固体，¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.67(s,1H),8.99(d,J＝4.3Hz,1H),8.43(d,J＝8.5Hz,1H),8.30–8.10(m,2H),7.94–7.83(m,1H),7.83–7.74(m,1H),7.70(d,J＝8.3Hz,1H),7.52–7.41(m,1H),7.34–7.27(m,1H),7.25(d,J＝7.1Hz,1H),7.10(d,J＝4.1Hz,1H),7.05(d,J＝7.8Hz,2H),6.36(q,J＝6.9Hz,1H),2.29(d,J＝6.9Hz,3H).ESI-MS m/z:402.2[M+H]⁺.

采用与化合物19相似的合成步骤，可得化合物20-73，收率30％-93％。具体表征数据如下：

实施例9、(S)-1-(1-苯基乙基)-N-(吡啶-4-基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉-8-胺的制备(化合物74)

将中间体6k(71mg,0.2mmol)，4-氨基吡啶(28mg,0.3mmol)，催化剂Pd₂(dba)₃(10mg,0.01mmol)，碳酸钾(56mg,0.4mmol)加入反应瓶中，用叔丁醇(1mL)作溶剂，于100℃下反应过夜。反应完毕后，冷却至室温，减压蒸去溶剂，柱层析分离提纯即得化合物74(38mg,收率为51％)黄色固体，¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.44(s,1H),9.24(s,1H),8.33(d,J＝6.2Hz,2H),8.17(d,J＝8.9Hz,1H),8.00(d,J＝2.3Hz,1H),7.65–7.55(m,1H),7.34–7.22(m,3H),7.10–7.02(m,2H),7.01–6.92(m,2H),6.72(q,J＝6.7Hz,1H),2.20(d,J＝6.8Hz,3H).ESI-MS m/z:367.1[M+H]⁺.

采用与终产品74相似的合成步骤，可得终产品75-78，收率21％-60％。具体表征数据如下：

以下通过具体的试验例证明本发明化合物的作用效果。

试验例1、利用双荧光素酶报告系统检测筛选本发明Hippo信号通路抑制剂

将处于对数生长期的A549-CTGF以15000个细胞每100μl每孔的浓度，将细胞接种于96孔板，于37℃、5％CO₂培养条件下培养过夜。第二日，每孔加入100μL含不同浓度化合物的完全培养基，使化合物终浓度分别为10μM、3.3μM、1.1μM等梯度浓度，继续培养24h。于显微镜下观察细胞，确保各孔数量基本一致。弃去细胞上清，加入20μL 1×细胞裂解液(passive lysis buffer)，于摇床上室温裂解20min。混匀裂解液后，每孔吸取5μL加入白色不透明96孔板中，于Glo-Max96微孔板检测仪中进行荧光素酶检测。

A549-CTGF细胞双荧光素酶报告检测，按照promega双荧光素酶报告系统检测试剂盒说明进行操作。大致操作如下：按试剂盒说明书配置好荧光虫底物反应液和海肾荧光素酶底物反应液。将白色不透明96孔板置于Glo-Max96微孔板检测仪中，通过自动进样装置依次向各样品孔中加入30μL萤火虫萤光素酶底物，同时测定荧光值A1。测定完成间隔0.4s后再加入30μL海肾萤光素酶底物，测定荧光值A2，并将个荧光值的比值作为最终的荧光强度值，计算CTGF基因表达量：R＝A1/A2。每组样品3-6个复孔。本发明化合物的CTGF相对荧光比值如表一所示，以Hippo信号通路抑制剂XMU-MP-1作为阳性对照组。所得相对荧光比值越高，证明该化合物刺激下游靶基因CTGF表达的作用越强，即对Hippo信号通路的抑制效果越强，所制备的化合物荧光比值数据如表一所示。

表一：10μM浓度下化合物在A549-CTGF细胞上的的CTGF相对荧光比值

由表一可知：本发明化合物均具有CTGF相对荧光比值，说明本发明化合物均能刺激下游靶基因CTGF的表达，即均对Hippo信号通路具有抑制作用，可用于制备Hippo信号通路抑制剂。同时，抑制Hippo信号通路可以促进细胞增殖、利于损伤器官再生，因此，本发明化合物也可以用于制备治疗与Hippo信号通路相关的各种疾病的药物，如利于损伤器官再生的药物。其中，化合物5、11、12、13和36CTGF相对荧光比值均显著高于阳性对照XMU-MP-1，特别是化合物11和36相对荧光比值最高，说明这些化合物对Hippo信号通路的抑制效果更好，用于制备Hippo信号通路抑制剂和制备治疗与Hippo信号通路相关的各种疾病的药物效果更优。

试验例2、检测化合物11和化合物36对A549-CTGF细胞内源性Hippo信号通路靶基因的调控作用

取处于对数生长期的A549-CTGF细胞接种于6孔板，于37℃、5％CO₂的条件下培养过夜。加入2μL XMU-MP-1(10mM)、化合物11(10mM、3.3mM和1.1mM)、化合物36(10mM、3.3mM和1.1mM)或DMSO处理24h后，用福际细胞总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。其中，利用DMSO配制化合物。提取RNA需在无RNA酶的条件下进行，并保证使用试剂耗材无RNA污染。具体操作过程如下：吸去细胞上清，立即加入250μl buffer CRL1，反复吹打细胞使细胞充分裂解。将细胞连同buffer CRL1转移至DNA cleaning column，于离心机中12000rpm离心2min。往收集管中加入400μl的buffer CRL2，混匀后转移至RNA binding column，12000rpm离心1min。弃去收集管中的液体，往吸附柱中加入500μl washing buffer 1，12000rpm离心1min。弃去收集管中的液体，往吸附柱中加入700μl washing buffer 2。弃去收集管中的液体，用700μL washing buffer 2重新清洗一次。弃去收集管中的液体。12000rpm空管离心2min，去除吸附柱中的多余液体。将吸附柱转移至干净无RNA酶的1.5mL离心管中，在吸附柱胶圈中心的吸附膜上加入65℃的无RNA酶的ddH₂O，室温静置2min后，于12000rpm离心2min。将离心管中的洗脱液重新加回吸附膜中，室温静置2min后，于12000rpm离心2min，洗脱液即为RNA溶液。取少量RNA样品分别进行浓度测定和琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。将RNA样品立即使用或分装后保存于-80℃备用。

提取完成后需尽快将其反转录成cDNA，-80℃保存的RNA使用前需重新用琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。操作过程需在无RNA酶的环境下进行，使用试剂耗材保证无RNA酶污染。cDNA合成采用百乐cDNA反转录试剂盒进行，反应体系及反应条件如表2所示，RNA模板的加入量需根据RNA溶液的浓度进行计算，无RNA酶ddH₂O根据RNA模板体积确定。

表2 cDNA合成反应体系与反应条件

cDNA溶液短期保存于4℃或置于-20℃长期保存备用。实验采用Bio-RadSsoAdvanced^TM

Green supermix试剂盒进行，每组设置3-4个复孔。反应体系及反应条件如表3所示。

表3.Real-time qPCR反应体系与反应条件

本实验中所用引物的序列如表4所示。

表4.Real-time PCR实验所用引物序列

其中，引物序列编号如下：

SEQ ID NO.1：ACCGCTCTGAAGGGGATCT；

SEQ ID NO.2：ACTGATGTTTACAGTTGGGCTG；

SEQ ID NO.3：GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA；

SEQ ID NO.4：CGGCACAGGTCTTGATGA；

SEQ ID NO.5：CTCGAACCCCAGATGACTTC；

SEQ ID NO.6：CCAGGAATGGCTTCAAGGTA；

SEQ ID NO.7：CCATCACTAATAATAGCTCAGATC；

SEQ ID NO.8：GTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG；

SEQ ID NO.9：TGGAAGGACTCATGACCACA；

SEQ ID NO.10：TTCAGCTCAGGGATGACCTT。

化合物11、化合物36、DMSO和XMU-MP-1(10μM)对A549-CTGF细胞中内源性基因CTGF和Cyr61的影响如图1所示。

由图1可知：化合物11和化合物36均能浓度依赖性显著上调A549-CTGF细胞中内源性CTGF和Cyr61的mRNA水平，且相同浓度下，化合物11对内源性CTGF和Cyr61mRNA水平上调效果显著优于阳性对照组。说明本发明化合物，特别是化合物11对Hippo信号通路有显著的抑制作用，可用于制备Hippo信号通路抑制剂。

试验例3、免疫荧光检测A549-CTGF细胞和HepG2细胞中的YAP核定位

将处于对数生长期的细胞接种于24孔爬片中培养过夜，加入0.5μL浓度为10μM化合物11、化合物36和XMU-MP-1处理24h。弃去细胞上清，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗3次。用4％多聚甲醇室温固定30min，PBS清洗3次。0.5％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)室温打孔20min，用PBS清洗3次。10％标准牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲溶液(BCA/PBS)室温封闭30min，加入用10％BCA/PBS溶液稀释后的anti-YAP抗体，4℃孵育过夜。除去抗体溶液，用PBS清洗3次，加入AlexaFluo488连接的荧光二抗，避光37℃孵育30min。随后所有操作均需避光。用PBS清洗3次，加入0.5μg/mL DAPI溶液染色液染色5min。用PBS清洗4次洗去多余DAPI染色液。取出爬片，用抗荧光淬灭剂封片后于正置荧光显微镜于40×物镜下观察拍照，结果如图2所示。

由图2可知：10μM化合物11、化合物36和XMU-MP-1均能有效促进A549-CTGF和HepG2细胞YAP蛋白的核移位。结果说明，在A549-CTGF和HepG2细胞中，化合物11和化合物36均能有效抑制Hippo信号通路。

试验例4、化合物11和化合物36调控Hippo信号通路的分子机制研究

1.蛋白免疫印迹

将对数生长期的细胞接种于6孔板培养过夜。加入2μL XMU-MP-1(10mM)、化合物11(10mM和3.3mM)和化合物36(10mM和3.3mM)处理细胞4h后，吸去贴壁细胞的上清，用预冷PBS清洗一次。加入100μL的RIPA裂解液(加1mM苯甲基磺酰氟和1×蛋白酶抑制剂混合物)冰上裂解10-15min,用细胞刮板将细胞裂解液收集至预冷1.5mL离心管。超声裂解至澄清(每次5s，间隔6s,3-5次)。4℃，13000rpm，15min离心收集上清。吸取少量上清进行BCA定量，依照说明书同行制作标准曲线。依照样品浓度，将样品浓度调平。在样品中加入5×蛋白上样缓冲液至1×，混匀，于100℃金属浴加热10min。样品直接上样电泳或将样品分装后保存于-20℃备用。

蛋白样品使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白。将20-50μg样品用10％SDS-PAGE分离蛋白样品后，将凝胶中的蛋白用槽式湿法转移至0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用抗体说明书标明的封闭液室温封闭1-2h后，使用稀释后的抗体4℃孵育过夜。取出PVDF膜，TBS/T清洗3次，每次5min。用稀释后的辣根过氧化物酶(HRP)连接的二抗于37℃孵育1h。取出PVDF膜，三乙醇胺缓冲盐水溶液/吐温-20(TBS/T)清洗3次，每次10min，再用TBS清洗5min后，将PVDF膜转移至TBS溶液中。在PVDF膜上均匀滴加HRP底物后，置于化学发光成像系统显影并保存图片。

2.实时荧光定量PCR：

方法详见“试验例2”中的方法。

蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR结果如图3所示。由图3可知：化合物11和化合物36能有效提高YAP的蛋白水平，但不能上调YAP的表达水平。说明了化合物11和化合物36不是通过上调YAP的表达从而抑制Hippo信号通路。

试验例5、化合物11和化合物36对体内受损肝组织的促再生能力评价

4周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性养殖1周。实验前1天，对小鼠进行禁食12h。对小鼠进行腹腔注射APAP溶液(500mg/kg)或生理盐水，立即对实验小鼠注射乙醇蓖麻油溶液(10L/kg)或化合物溶液(30mg/kg)。6h后，处死小鼠后解剖，取出肝组织，用生理盐水清洗后，立即将肝组织用中性福尔马林固定液固定24h以上，进行HE染色。

固定好的组织转移至包埋盒中，置于流动自来水中冲洗2-3h后，将组织块浸泡于75％的酒精中过夜。次日，将包埋盒放入下列溶液中进行固定脱水：85％乙醇，1h/次，2次；95％乙醇，1h/次，2次；100％乙醇，1h/次，3次；二甲苯，1h/次，2次。随后，将脱水后的组织依次置于65℃的旧蜡、二蜡和新蜡中处理，每次0.5h。将组织进行石蜡包埋，保存备用。将蜡块以5μm的厚度连续切片，并将切片置于65-70℃烤箱中烘烤1-2h，然后将其依次放入下列溶液中进行梯度酒精水化以脱蜡：二甲苯，10min/次，2次；100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇，2min/次，各1次；蒸馏水，5min/次，2次。然后滴加苏木精和伊红染色，染色一定时间后用水冲洗掉多余的染料，自然风干后加中性树胶封片。将切片置于正置显微镜下进行观察拍照。组织学切片结果如图4所示。

由图4所示：化合物36能有效修复APAP诱导的急性肝损伤，促进受损肝组织的再生。

综上，本发明化合物对Hippo信号通路具有抑制作用，可用于制备Hippo信号通路抑制剂。同时，抑制Hippo信号通路可以促进细胞增殖，利于损伤器官再生，特别是可促进受损肝组织再生，可以有效修复急性肝损伤。因此，本发明化合物也可以用于制备治疗与Hippo信号通路相关的各种疾病的药物，如利于损伤器官再生的药物，特别是利于受损肝组织再生的药物，还可以用于制备修复急性肝损伤的药物。本发明化合物可用于器官再生领域用药研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种作为Hippo信号通路抑制剂的1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]喹啉衍生物

<130> GYKH1218-2019P016774CC

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

accgctctga aggggatct 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

actgatgttt acagttgggc tg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gaggaaaaca ttaagaaggg caaa 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

cggcacaggt cttgatga 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ctcgaacccc agatgacttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ccaggaatgg cttcaaggta 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ccatcactaa taatagctca gatc 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gtgattacag ccaggttaga aag 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

tggaaggact catgaccaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ttcagctcag ggatgacctt 20

Claims

1.一种式Ⅰ所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体：

其中，

所述烷氧基的取代基为卤素、3～8元芳基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基。

2.根据权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：

R²选自氢、卤素；

所述烷氧基的取代基为3～6元芳基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基。

3.根据权利要求2所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：

R¹选自取代或未取代的C₁～C₃烷基、取代的苯基；

R²选自氢、卤素；

所述烷基的取代基为卤素、羟基、取代或未取代的苯基；

所述烷氧基的取代基为苯基；

所述稠环基的取代基为C₁～C₃烷基、C₁～C₃烷氧基；

4.根据权利要求3所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：

所述稠环基的取代基为甲基、C₂烷氧基。

5.根据权利要求1～4任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：所述式Ⅰ所示化合物为式Ⅱ所示：

其中，A环选自未取代的9元稠环基。

6.根据权利要求5所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：所述式Ⅱ所示化合物的结构如下：

7.根据权利要求1～4任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：所述式Ⅰ所示化合物为式Ⅲ所示：

8.根据权利要求7所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体，其特征在于：所述式Ⅲ所示化合物的结构如下：

9.权利要求1～8任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体在制备Hippo信号通路抑制剂中的用途。

10.权利要求1～8任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体在制备治疗与Hippo信号通路相关疾病的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述药物可以促进受损器官再生。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述药物可以促进受损肝组织再生。

13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述药物可以修复肝损伤。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述肝损伤为急性肝损伤。

15.一种药物，其特征在于：它是由权利要求1～8任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。