CN114249733B - 一种Isaindigotone衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种Isaindigotone衍生物及其制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首先提供了一类Isaindigotone衍生物；其次，本发明通过体外MTT抗肿瘤活性研究发现，所述Isaindigotone衍生物对胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌等多种癌症细胞均具有良好的抑制作用；尤其是所述Isaindigotone衍生物能够显著抑制胃癌细胞的增值，抑制胃癌细胞的活性，具有显著的治疗胃癌的效果，且其药效显著高于现有一线抗癌药物Pt，在制备抗癌药物中具有广泛的应用前景。

Description

一种Isaindigotone衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种Isaindigotone衍生物及其制备方法和在制备抗 癌药物中的应用。
背景技术
胃癌治疗方案的选择主要是基于病程，出现的生物标志物，以及临床病征。胃癌早期患 者通常通过切除手术以治疗恶性肿瘤。手术类型取决于肿瘤浸润的位置和深度，包括内镜粘 膜切除术，食管远端切除术，胃次全切除术或全胃切除术。研究显示，相比于单纯手术切除， 二期和三期的胃癌患者接受辅助治疗后的生存率更高。目前，晚期胃癌的治疗主要是通过姑 息化疗改善症状。晚期胃癌化疗药物主要有紫杉醇类(紫杉醇和多西他赛)、氟尿嘧啶类(5 -氟尿嘧啶、替吉奥、卡培他滨)、铂类(顺铂和奥沙利铂)、伊立替康、表柔沙星等，且多以 氟尿嘧啶联合铂类为一线化疗方案。
在过去的十多年中，伴随着诸如高通量筛选和组合化学这样的新型技术的出现，在新药 的探索的过程中，天然产物受到越来越广泛的关注。统计显示，从1940年到2002年间获批 的抗肿瘤药物，大约54％都是来自于天然产物或者受到相关化合物得到启示研究开发所得。 因此基于天然产物的药物开发具有广阔前景。
PI3K/AKT/mTOR作为一条经典的抗凋亡信号转导通路，与细胞内诸如细胞增殖，迁移等多 种正常的生理活动密切相关。与其它肿瘤类似，胃癌中也存在着PI3K/AKT/mTOR通路异常。 综上所述，PI3K/AKT/mTOR通路在胃癌组织中的过度激活提示我们这条通路中的相关蛋白 可以作为抗肿瘤治疗的靶点。
Isaindigotone是从中药板蓝根中提取得到的一种喹唑啉酮衍生物，是由喹唑啉酮与苯亚 甲基连接而成。本发明合成了一类新的Isaindigotone衍生物，所述Isaindigotone衍生物具有 抗癌活性，能够靶向AKT蛋白，对胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌等具有良好的抑制作用， 显著高于现有一线抗癌药物Pt，在制备抗癌药物中具有广泛的应用空间。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种新的Isaindigotone衍生物，及其在制备抗癌 药物中的应用，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种Isaindigotone衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于， 所述Isaindigotone衍生物结构式如下式(I)所示：
Figure BDA0003167334210000021
其中，
当所述n为1，所述R1和R2为氢时，所述R3和R4为氟、R5为氢，或所述R3和R5为氢、 R4为三氟甲氧基，或所述R3和R5为三氟甲基、R4为氢；
当所述n为1，所述R1为氢，R2为氟时，所述R3、R4和R5为甲氧基，或所述R3和R4为氟、R5为氢，或R3和R5为三氟甲基、R4为氢；
当所述n为1，所述R1和R2为氟时，所述R3和R5为氢、R4为三氟甲氧基，或所述R3和R5为三氟甲基、R4为氢；
当所述n为1，所述R1为氟，R2为氢时，所述R3和R4为氟、R5为氢，或所述R3和R5为甲氧基、R4为羟基，或所述R5为氢、R3和R4形成1,3-二氧五环；
当所述n为1，所述R1和R2为甲氧基时，所述R3和R4为氟、R5为氢，或所述R3和R5为氢、R4为氟，或所述R3和R5为氢、R4为三氟甲基，或所述R3为氢，R4和R5形成1,3-二 氧五环；
当所述n为1，所述R1为甲氧基，R2为4-甲基哌嗪基时，所述R3和R5为氢、R4为三氟 甲基，或所述R3为氢、R4和R5为氟；
当所述n为2，所述R1和R2为氢时，所述R3和R5为氢、R4为氟，或所述R3和R5为甲 氧基、R4为羟基；
当所述n为2，所述R1为氟，R2为氢时，所述R3、R4和R5为甲氧基，或所述R3和R5为氢、R4为氟，或所述R5为氢、R3和R5形成1,3-二氧五环。
第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的Isaindigotone衍生物或其药学上可接 受的盐在制备治疗癌症药物中的应用。
优选地，所述癌症包括胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌。
优选地，所述癌症为胃癌，所述Isaindigotone衍生物包括以下所示化合物：
Figure BDA0003167334210000031
Figure BDA0003167334210000041
优选地，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure BDA0003167334210000042
优选地，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure BDA0003167334210000043
优选地，所述癌症为胰腺癌，所述Isaindigotone衍生物包括以下所示化合物：
Figure BDA0003167334210000044
Figure BDA0003167334210000051
优选地，所述癌症为胰腺癌，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure BDA0003167334210000052
优选地，所述癌症为结肠癌，所述Isaindigotone衍生物包括以下所示化合物：
Figure BDA0003167334210000053
优选地，所述Isaindigotone衍生物的结构式为：
Figure BDA0003167334210000054
优选地，所述癌症为肝癌，所述Isaindigotone衍生物的结构式如下所示：
Figure BDA0003167334210000055
优选地，所述的Isaindigotone衍生物或其药学上可接受的盐，加入药学上可接受的辅料 制成药学上可接受的任一剂型。
本发明的有益效果是：本发明首先提供了一类Isaindigotone衍生物；其次，本发明通过 体外MTT抗肿瘤活性研究发现，所述Isaindigotone衍生物对胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌 等多种癌症细胞均具有良好的抑制作用；尤其是所述Isaindigotone衍生物能够显著抑制胃癌 细胞的增值，抑制胃癌细胞的活性，具有显著的治疗胃癌的效果，且其药效显著高于现有一 线抗癌药物Pt，在制备抗癌药物中具有广泛的应用空间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简 单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的 限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。
图1 Isaindigotone衍生物的合成路线图；
图2 Isaindigotone衍生物BLG06对胃癌细胞体外抗增殖活性的影响结果；
图3 Isaindigotone衍生物BLG06对胃癌AGS细胞形态的影响结果；
图4 Isaindigotone衍生物BLG06对胃癌AGS细胞周期及凋亡的影响结果；
图5 Isaindigotone衍生物BLG06对线粒体(MMP)膜电位变化的影响结果；
图6分子对接及蛋白质印迹实验结果；
图7 Isaindigotone衍生物BLG06抑制AGS细胞迁移的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术 方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例所用的人癌细胞系包括结直肠癌细胞系HCT116、胃癌细胞系AGS、胰腺癌 细胞系PANC-1、肝癌SMMZ-7721以及正常胃细胞系GES-1；所述HCT116、AGS、PANC- 1购自ATCC(美国)；所述SMMZ-7721和GES-1购自兰州大学药学院。除HCT116、AGS、 SMMZ-7721细胞系在1640培养基(1640，Solarbio Invitrogen Corp.，Beijing，China)中培 养；PANC-1和GES-1细胞系在高糖培养基(DMEM，Solarbio Invitrogen Corp.，Beijing，C hina)中培养；培养条件为：37℃、5％CO2条件，所有细胞都补充有10％胎牛血清(FBS)、 100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。
实施例1 Isaindigotone衍生物的制备
Isaindigotone衍生物的合成路线如图1所示，合成的Isaindigotone衍生物分别用BLG01- 22表示，合成的Isaindigotone衍生物的结构式如下表1所示：
(1)b1-b7的合成：在室温下，将45mL POCl3小心地添加到各种2-氨基苯甲酸(a1-5，19.30mmoL，1eq)和吡咯烷-2酮或2-哌啶酮(38.60mmoL，2eq)的混合溶液中；然后 将混合物在110℃搅拌7h；减压除去POCl3后，将残余物倒入冰水中，然后加入NaOH溶液 使溶液呈碱性；混合物用3×50mL的CH2Cl2萃取；合并的有机相用MgSO4干燥，真空浓缩， 然后通过快速柱纯化，用石油醚/EtOAc(4:1)洗脱，得到白色固体。
(2)b8的合成：将催化量的Na2CO3加入到中间体b4(15.00mmoL)和N-甲基哌嗪(4.00mL)的DMF(36.00mL)溶液中；然后将混合物在140℃搅拌2h；减压除去部分DMF 后，将残渣倒入30.00mL水中，过滤，水洗，得到白色固体。
(3)BLG01-BLG22的合成：将催化量的NaOAc加入到中间体b1-b8(10.00mmoL)和 不同取代的苯甲醛(c1-7，20.00mmoL)，AcOH(70.00mL)溶液中；然后将混合物在115℃ 下搅拌6h；减压除去部分AcOH后，将残余物倒入15.00mL冰冷的丙酮中，然后过滤并用 丙酮洗涤，得到白色或黄色固体。
得到的化合物分别用BLG01-BLG22表示，其中BLG01-BLG22的谱图数据如下所示：
BLG01：(E)-3-(3,4-difluorobenzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1H)-one；Yi eld:69％；yellow solid,m.p.218-220℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.29(d,J＝7.9 Hz,1H),7.87–7.63(m,3H),7.45(m,1H),7.37(m,1H),7.27(m,2H),4.31(t,J＝7. 2Hz,2H),3.26(t,J＝7.4Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.11,155.03,15 1.66(d,J＝13.0Hz),149.54,149.19(d,J＝12.8Hz),134.32,132.56(d,J＝2.8Hz),1 28.37(d,J＝2.3Hz),127.34,126.44,126.41,120.95,118.12,117.94,117.92,117.74,44.0 0,25.34.MS-ESI m/z:calcd for C18H12F2N2O[M+H]+:311.0918；found:311.0985.
BLG02：(E)-3-(4-(trifluoromethoxy)benzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1H)- one；Yield:73％；yellow solid,m.p.174-175℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.29(d, J＝8.0Hz,1H),7.82(d,J＝3.0Hz,1H),7.75(d,J＝4.1Hz,2H),7.58(d,J＝8.4Hz, 2H),7.44(m,1H),7.36–7.12(m,2H),4.30(t,J＝7.2Hz,2H),3.27(t,J＝7.4,2H). 13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.15,155.19,149.59,149.26,134.29,134.10,132.48,131.10,128.97,127.33,126.43,126.34,121.12,120.95,44.00,25.44.MS-ESI m/z:calcdfo r C19H13F3N2O2[M+H]+:359.0929；found:359.0986.
BLG03：(E)-3-(3,5-bis(trifluoromethyl)benzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1 H)-one；Yield:76％；yellow solid,m.p.318-320℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.33 (d,J＝8.0Hz,1H),7.98(s,2H),7.93(s,1H),7.87(s,1H),7.78(d,J＝2.1Hz,2H),7. 50(m,1H),4.36(t,J＝7.1Hz,2H),3.35(t,J＝7.5Hz,2H).13C NMR(100MHz,C DCl3)δ:161.05,137.46,135.82,134.46,132.58,132.24,129.03,129.01,127.57,127.18,1 26.81,126.51,122.06,121.73,121.11,44.01,25.46.MS-ESI m/z:calcd for C20H12F6N2O [M+H]+:411.0854；found:411.0877.
BLG04：(E)-6-fluoro-3-(3,4,5-trimethoxybenzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9 (1H)-one；Yield:85％；yellow solid,m.p.212-214℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.28 (dd,J＝8.8,6.2Hz,1H),7.77(d,J＝2.9Hz,1H),7.36(dd,J＝9.9,2.5Hz,1H),7.1 4(m,1H),6.80(s,2H),4.30(t,J＝7.3Hz,2H),3.92(d,J＝2.4Hz,9H),3.38(t,J＝ 7.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160.54,156.77,153.38,139.40,131.54,130. 85,130.14,128.96(d,J＝10.7Hz),117.58,114.87(d,J＝8.4Hz),114.68,112.36(d,J ＝21.7Hz),112.07,107.41,61.01,56.30,44.07,25.42.MS-ESI m/z:calcd forC21H19FN2 O4[M+H]+:383.1329；found:383.1378.
BLG05：(E)-3-(3,5-bis(trifluoromethyl)benzylidene)-6-fluoro-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quina zolin-9(1H)-one；Yield:80％；yellow solid,m.p.208-209℃；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ:8.31(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.98(s,2H),7.92(t,J＝3.0Hz,1H),7.88(s,1H),7. 39(dd,J＝9.7,2.5Hz,1H),7.19(t,J＝8.5Hz,1H),4.35(t,J＝7.1Hz,2H),3.35(t, J＝7.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:167.85,165.32,160.33,155.61,151.6 6(d,J＝13.1Hz),137.27,135.48,132.45(d,J＝33.6Hz),129.57-128.55(m),127.86, 124.41,122.23(d,J＝4.3Hz),121.70,117.82,115.51(d,J＝23.7Hz),112.75(d,J＝ 22.0Hz),44.06,25.43.MS-ESI m/z:calcd for C20H11F7N2O[M+H]+:429.0760；found:4 29.0565.
BLG06：(E)-3-(3,4-difluorobenzylidene)-6-fluoro-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1H) -one；Yield:83％；yellow solid,m.p.243-245℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.31(dd, J＝8.8,6.2Hz,1H),7.77(d,J＝2.6Hz,1H),7.38(dd,J＝9.7,2.5Hz,1H),7.31(m, 1H),7.26(m,1H),7.17(m,1H),4.31(t,J＝7.3Hz,2H),3.29(t,J＝7.3Hz,2H).13 C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160.45,158.60,156.27,151.84(d,J＝13.6Hz),151.65,1 29.09(d,J＝4.5Hz),128.96,126.53,126.47,118.12(d,J＝18.8Hz),117.98,117.75(d, J＝9.9Hz),115.24,115.01,112.66,112.44,44.04,25.34.MS-ESI m/z:calcdfor C18H11 F3N2O[M+H]+:329.0823；found:329.0700.
BLG07：(E)-6,7-difluoro-3-(4-(trifluoromethoxy)benzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quina zolin-9(1H)-one；Yield:72％；yellow solid,m.p.167-169℃；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ:8.04(dd,J＝10.0,8.5Hz,1H),7.81(t,J＝2.9Hz,1H),7.68-7.55(m,2H),7.51(d d,J＝10.9,7.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.3Hz,2H),4.63-4.07(m,2H),3.30(t,J＝7.3 Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:159.78,156.27,155.98,149.44,133.84,131.92, 131.19,129.72,121.69,121.17,117.81,115.01,114.84,113.86,113.68,44.17,25.39.MS- ESI m/z:calcd for C19H11F5N2O2[M+H]+:395.0741；found:395.0612.
BLG08：(E)-3-(3,5-bis(trifluoromethyl)benzylidene)-6,7-difluoro-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]qu inazolin-9(1H)-one；Yield:79％；yellow solid,m.p.216-218℃；1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.06(dd,J＝10.0,8.5Hz,1H),7.98(s,2H), 7.89(s,1H),7.52(dd,J＝10.8,7.0Hz,1H),4.35(t,J＝7.1Hz,2H),3.36(t,J＝7.3 Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:159.66,156.26(d,J＝14.8Hz),155.15(d,J ＝2.5Hz),153.70(d,J＝14.6Hz),150.92(d,J＝14.4Hz),148.41(d,J＝14.4Hz),14 7.23(d,J＝9.7Hz),137.20,135.25,132.48(d,J＝33.6Hz),129.06,127.86,124.40,122. 57-121.98(m),121.69,118.01(d,J＝6.4Hz),115.17(d,J＝17.9Hz),113.87(dd,J＝ 19.3,2.5Hz),44.17,25.39.MS-ESI m/z:calcd for C20H10F8N2O[M+H]+:447.0665；fo und:447.0503.
BLG09：(E)-7-fluoro-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]qui nazolin-9(1H)-one；Yield:85％；yellow solid,m.p.243-245℃；1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.91(dd,J＝8.5,3.0Hz,1H),7.82-7.61(m,2H),7.45(m,1H),6.82(s,2H),4.3 0(t,J＝7.4Hz,2H),3.95(s,6H),3.47-3.21(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ: 161.69,160.56,159.23,155.27,147.20,146.46,136.29,131.11,129.29,128.64,127.03,12 2.79(d,J＝24.2Hz),121.90(d,J＝8.6Hz),111.29(d,J＝23.7Hz),107.10,56.39,44. 08,25.43.MS-ESI m/z:calcd for C20H17FN2O4[M+H]+:369.1172；found:369.1040.
BLG10：(E)-3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethylene)-7-fluoro-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinaz olin-9(1H)-one；Yield:78％；yellow solid,m.p.288-290℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ: 7.92(dd,J＝8.5,3.0Hz,1H),7.78-7.65(m,2H),7.59-7.39(m,2H),7.09(d,J＝8. 5Hz,1H),6.89(d,J＝7.5Hz,1H),6.04(s,2H),4.29(t,J＝7.4Hz,2H),3.34-3.20 (m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160.53,148.32(d,J＝20.7Hz),130.57,129.4 0(d,J＝8.2Hz),129.01(d,J＝7.3Hz),125.40,123.67,122.90,111.29(d,J＝23.6H z),110.05,109.01,108.80,108.04,107.73,101.57,101.01,56.05,44.08,25.51.MS-ESI m/ z:calcd for C19H13FN2O3[M+H]+:337.0910；found:337.0950.
BLG11：(E)-3-(3,4-difluorobenzylidene)-7-fluoro-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1H)- one；Yield:84％；yellow solid,m.p.228-230℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.91(dd, J＝8.5,3.0Hz,1H),7.81-7.66(m,2H),7.47(m,1H),7.37(dd,J＝10.9,7.6Hz,1 H),7.27(dd,J＝13.4,10.0Hz,2H),4.31(t,J＝7.2Hz,2H),3.27(t,J＝7.4Hz,2H). 13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.93,160.37(d,J＝3.5Hz),159.46,154.53,146.21, 132.52(d,J＝5.6Hz),132.25,129.59(d,J＝8.1Hz),128.39,126.36(dd,J＝6.4,3.5 Hz),122.90(d,J＝24.3Hz),122.13(d,J＝8.6Hz),118.13,117.95,117.78,111.37(d,J ＝23.6Hz),44.04,25.35.MS-ESI m/z:calcd for C18H11F3N2O[M+H]+:329.0823；found:329.0889.
BLG12：(E)-3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethylene)-6,7-dimethoxy-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b] quinazolin-9(1H)-one；Yield:72％；yellow solid,m.p.289-291℃；1H NMR(400MHz,CD Cl3)δ:7.60(d,J＝2.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.06(s,1H),7.03-6.93(m,2H),6.81(d, J＝8.1Hz,1H),5.95(s,2H),4.20(t,J＝7.2Hz,2H),3.94(s,3H),3.93(s,3H),3.25 -3.13(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160.56,154.87,148.65,148.19,145.99, 134.04,129.99,129.68,129.36,126.63,125.13,114.13,111.31,108.93,108.75,107.58,10 5.43,101.52,56.29,44.09,25.61.MS-ESI m/z:calcd forC21H18N2O5[M+H]+:379.1216； found:319.1246.
BLG13：(E)-3-(4-fluorobenzylidene)-6,7-dimethoxy-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1 H)-one；Yield:73％；yellow solid,m.p.271-273℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.73 (d,J＝3.0Hz,1H),7.60(s,1H),7.53(dd,J＝8.7,5.5Hz,2H),7.20-7.07(m,3H),4. 30(t,J＝7.2Hz,2H),4.02(s,3H),4.00(s,3H),3.36-3.16(m,2H).13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:163.95,160.49,154.91,154.33,148.80,145.87,131.87(d,J＝3.4Hz),1 31.4,131.38,128.33,115.99(d,J＝21.7Hz),114.25,107.64,105.43,56.31,56.29,44.06, 25.53.MS-ESI m/z:calcd for C20H17FN2O3[M+H]+:353.1223；found:353.1262.
BLG14：(E)-3-(3,4-difluorobenzylidene)-6,7-dimethoxy-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quinazolin- 9(1H)-one；Yield:76％；yellow solid,m.p.262-264℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7. 67(d,J＝2.8Hz,1H),7.61(s,1H),7.35(m,1H),7.32-7.18(m,2H),7.14(s,1H),4. 31(t,J＝7.1Hz,2H),4.02(s,3H),4.01(s,3H),3.26(t,J＝7.3Hz,2H).13C NMR(1 00MHz,CDCl3)δ:160.41,154.96,153.92,152.24-151.25(m),149.19(d,J＝12.2Hz), 148.96,145.78,132.86(d,J＝2.6Hz),132.73(d,J＝5.4Hz),127.23,126.18(dd,J＝ 6.3,3.3Hz),117.94(d,J＝9.2Hz),117.76(d,J＝8.9Hz),114.34,107.68,105.43,56.3 2,56.30,44.05,25.47.MS-ESI m/z:calcd for C20H16F2N2O3[M+H]+:371.1129；found: 371.1169.
BLG15：(E)-6,7-dimethoxy-3-(4-(trifluoromethyl)benzylidene)-2,3-dihydropyrrolo[2,1-b]quin azolin-9(1H)-one；Yield:81％；yellow solid,m.p.256-257℃；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ:7.80(t,J＝2.8Hz,1H),7.74-7.60(m,5H),7.17(s,1H),4.33(t,J＝7.2Hz,2H), 4.03(s,3H),4.02(s,3H),3.32(t,J＝7.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160. 44,155.01,153.86,149.09,145.78,138.97,134.56,129.61,127.84,125.79,125.75,114.45, 107.77,105.47,56.35,56.32,53.40,44.07,25.72.MS-ESI m/z:calcd for C21H17F3N2O3 [M+H]+:403.1191；found:403.1145.
BLG16：(E)-3-(3,4-difluorobenzylidene)-7-fluoro-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,3-dihydropyrr olo[2,1-b]quinazolin-9(1H)-one；Yield:69％；yellow solid,m.p.231-233℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.76(d,J＝12.9Hz,1H),7.61(d,J＝3.1Hz,1H),7.32-7.24(m,1 H),7.23-7.12(m,2H),7.08(d,J＝7.8Hz,1H),4.20(t,J＝7.1Hz,2H),3.24(t,J＝ 4.8Hz,4H),3.17(d,J＝9.8Hz,2H),2.56(t,J＝4.9Hz,4H),2.31(s,3H).13CNM R(100MHz,CDCl3)δ:159.11,154.14(d,J＝44.5Hz),151.88,150.65(d,J＝12.7Hz),148.16(d,J＝16.1Hz),146.51,145.35(d,J＝10.0Hz),131.67,126.89,125.27,117.06,116.89,116.73,114.17(d,J＝3.6Hz),113.51(d,J＝8.4Hz),111.04(d,J＝23.7Hz),53.89,48.91(d,J＝4.7Hz),45.09,42.93,24.38.MS-ESI m/z:calcd for C23H21F3N4O [M+H]+:427.1667；found:427.1769.
BLG17：(E)-7-fluoro-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-3-(4-(trifluoromethyl)benzylidene)-2,3-dihy dropyrrolo[2,1-b]quinazolin-9(1H)-one；Yield:78％；whitesolid,m.p.228-230℃；1H NMR (400MHz,CDCl3)δ:7.83–7.69(m,2H),7.65–7.49(m,4H),7.09(d,J＝7.8Hz,1 H),4.21(t,J＝7.1Hz,2H),3.23(m,6H),2.56(t,J＝4.8Hz,4H),2.31(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:159.07(d,J＝3.2Hz),154.42,153.82(d,J＝2.2Hz),151.9 4,146.49,145.37(d,J＝10.1Hz),137.82,133.38,129.40(d,J＝32.8Hz),128.66,127.4 3,124.76(q,J＝3.8Hz),114.24(d,J＝3.6Hz),113.57(d,J＝8.5Hz),111.06(d,J＝23.8Hz),53.89,48.91(d,J＝4.7Hz),45.08,42.94,24.61.MS-ESI m/z:calcd for C24H22F4N4O[M+H]+:459.1730；found:459.1257.
BLG18：(E)-6-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]q uinazolin-11-one；Yield:79％；yellow solid,m.p.226-227℃；1HNMR(400MHz,CDCl3) δ:8.36-8.14(m,1H),8.08(d,J＝2.1Hz,1H),7.71-7.52(m,2H),7.35(m,1H),6.6 8(s,2H),5.70(s,1H),4.25-4.03(m,2H),3.86(s,6H),2.91(t,J＝6.6Hz,2H),1.98 (t,J＝10.5Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.14,150.95,146.60,145.86,134.80,134.46,133.11,127.16,126.64,126.19,125.66,125.03,119.03,106.39,55.40,41.06, 24.99,21.12.MS-ESI m/z:calcd for C21H20N2O4[M+H]+:365.1423；found:365.1433.
BLG19：(E)-6-(4-fluorobenzylidene)-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]quinazolin-11-one； Yield:85％；yellow solid,m.p.165-166℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40 8.23(m, 1H),8.18(d,J＝2.2Hz,1H),7.73(dd,J＝7.0,1.7Hz,2H),7.45(td,J＝8.5,5.7Hz, 3H),7.12(t,J＝8.7Hz,2H),4.32-3.93(m,2H),3.03-2.71(m,2H),2.12-1.90(m, 2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:163.65,162.12,151.63,147.51,134.19(d,J＝4.6 Hz),132.37(d,J＝3.4Hz),131.80(d,J＝8.1Hz),129.84(d,J＝1.7Hz),127.30,126. 68,126.24,120.17,115.61,115.40,42.19,25.71,22.06.MS-ESI m/z:calcd forC19H15FN 2O[M+H]+:307.1168；found:307.1299.
BLG20：(E)-2-fluoro-6-(3,4,5-trimethoxybenzylidene)-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]q uinazolin-11-one；Yield:82％；yellow solid,m.p.164-166℃；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ:8.14(d,J＝2.2Hz,1H),7.90(dd,J＝8.5,3.0Hz,1H),7.72(dd,J＝9.0,4.9Hz, 1H),7.46(d,J＝3.0Hz,1H),6.71(s,2H),4.29-4.07(m,2H),3.91(s,3H),3.90(s,6 H),2.98(td,J＝6.6,2.1Hz,2H),2.05(t,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl 3)δ:161.76,161.49,159.29,153.06,151.05(d,J＝2.3Hz),144.28,138.52,135.48,131.6 7,129.67(d,J＝8.0Hz),129.17,122.93(d,J＝24.3Hz),121.15(d,J＝8.6Hz),111.3 6(d,J＝23.5Hz),107.51,60.98,56.26,42.38,25.85,22.04.MS-ESI m/z:calcd for C22 H21FN2O4[M+H]+:397.1485；found:397.1504.
BLG21：(E)-6-(benzo[d][1,3]dioxol-5-methylene)-2-fluoro-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1 -b]quinazolin-11-one；Yield:84％；yellow solid,m.p.232-234℃；1H NMR(400MHz,CD Cl3)δ:8.11(s,1H),7.89(dd,J＝8.6,3.1Hz,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.54-7. 42(m,1H),7.01(d,J＝8.9Hz,2H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.02(s,2H),4.16(t,J ＝5.9Hz,2H),3.07-2.84(m,2H),2.11-1.91(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3) δ:161.73,161.43,159.26,151.45,147.82,147.78,135.54,130.27,129.57,129.47,125.20, 122.96(d,J＝24.3Hz),121.04(d,J＝8.7Hz),111.38(d,J＝23.5Hz),109.81,108.45, 101.39,42.24,25.88,22.02.MS-ESI m/z:calcd for C20H15FN2O3[M+H]+:351.1067；fo und:351.1123.
BLG22：(E)-2-fluoro-6-(4-fluorobenzylidene)-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]quinazolin -11-one；Yield:75％；yellow solid,m.p.183-185℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.16 (s,1H),7.90(dd,J＝8.5,3.0Hz,1H),7.72(dd,J＝9.0,4.9Hz,1H),7.51-7.41(m,3 H),7.12(t,J＝8.6Hz,2H),4.20-4.12(m,2H),2.97-2.88(m,2H),2.11-1.91(m,2 H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:163.70,161.80,161.43(d,J＝3.6Hz),161.22,159. 34,151.01(d,J＝2.4Hz),144.15,134.30,132.26(d,J＝3.5Hz),131.80(d,J＝8.2H z),129.66(d,J＝8.1Hz),129.49,122.96(d,J＝24.4Hz),121.19(d,J＝8.7Hz),115.5 4(d,J＝21.5Hz),111.38(d,J＝23.5Hz),42.37,25.65,21.98.MS-ESI m/z:calcdfor C19H14F2N2O[M+H]+:325.1074；found:325.1153.
上述得到的Isaindigotone衍生物BLG01-22的结构式如下表1所示。
表1 Isaindigotone衍生物的结构式
Figure BDA0003167334210000131
Figure BDA0003167334210000141
实施例2 Isaindigotone衍生物对不同人类癌细胞系的体外抗癌活性
通过MTT法研究了22种Isaindigotone衍生物对不同人类癌细胞系(包括AGS、HCT116、SMMZ-7721和PANC-1)的体外抗癌活性，顺铂用作阳性对照。具体方法为：
取不同癌细胞于96孔板(1×104个细胞/100μL)中培养，37℃预孵育12h，使其贴壁。 细胞与不同剂量的化合物孵育48h；处理后，每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)， 37℃继续孵育4h；弃去培养基，每孔加入100μL的DMSO，然后通过酶标仪(Spectra Max190，美国)通过在波长490nm处读取每个孔的OD值来确定衍生物的IC50值。
Isaindigotone衍生物和顺铂阳性对照对四种不同癌细胞48小时的IC50值见表2。结果表 明：①与其他癌细胞相比，胃癌细胞AGS对大多数Isaindigotone衍生物表现出更高的敏感性， IC50为1.96-44.50μM；尤其是化合物BLG04、BLG06显示出比Isaindigotone本身更高的抑 制活性，其IC50分别为1.96μM、2.23μM、2.09μM；化合物BLG18显示出与Isaindigoton e相似的活性，IC50为6.79μM；②与Isaindigotone相比，BLG06在AGS细胞中的抗癌活性 提高了近4倍，与顺铂相比，BLG06对AGS细胞的抗癌活性是顺铂的10倍；③与Isaindigo tone相比，BLG03、BLG06、BLG11、BLG13、BLG15、BLG18、BLG21对于胰腺癌细胞PANC-1也表现出显着的细胞毒性，其中BLG06对胰腺癌细胞PANC-1的IC50为9.94μM，活 性是Isaindigotone的5倍；④与Isaindigotone相比，BLG06、BLG06、BLG18对于结直肠癌 细胞HCT116也具有显著的抑制活性，其中BLG18对结直肠癌细胞HCT116的IC50为2.80 μM，其抑制活性为Isaindigotone的20倍以上；对于肝癌细胞SMMZ-7721，大多数Isaindigo tone衍生物显示出中等的细胞毒活性。
综上所述，本发明所述Isaindigotone衍生物对AGS、HCT116、SMMZ-7721和PANC-1癌细胞均具有一定的抑制活性。
表2 Isaindigotone衍生物BLG01-22对各种肿瘤细胞的IC50(μM)
Figure BDA0003167334210000151
Figure BDA0003167334210000161
实施例3 Isaindigotone衍生物BLG06对胃癌的抑制活性
1.BLG06的体外抗增殖活性
使用MTT法(同实施例1)测定在24h、48h和72h时，BLG06对胃癌AGS细胞系 和胃表皮细胞GES细胞系的抑制活性。
结果如图2所示，与对照组相比，BLG06对胃癌AGS细胞具有显著的抑制作用，且胃癌AGS细胞活力以剂量和时间依赖性方式受到显着抑制；同时BLG06对正常胃表皮细胞GES-1表现出良好的安全性。
2.BLG06对胃癌AGS细胞形态的影响
为了进一步确定生长抑制是否由细胞凋亡引起，使用Hoechst 33258染色来可视化核形 态。具体方法为：
将AGS细胞接种在24孔板的腔室载玻片上，并用不同浓度的化合物BLG06处理48h。根据制造商的说明(Solarbio life sciences，China)，在室温下用4％多聚甲醛固定30min， 然后用PBS洗涤细胞3次，并与100:1稀释的Hoechst 33258(10μg/mL)一起孵育在室温 下10min。再次洗涤载玻片并在荧光显微镜(Zeiss，德国)下检查。
结果如图3所示，荧光显微镜检查显示处理后的AGS细胞表现出典型的形态变化，如染 色质凝聚和细胞收缩；该结果表明BLG06能够诱导AGS细胞凋亡。
3.BLG06对AGS细胞周期的影响
为了进一步确定BLG06诱导细胞增殖抑制的潜在机制，将AGS细胞用不同浓度的BLG 06处理24h并用PI染色。用流式细胞术分析细胞周期分布。具体方法为：
将AGS细胞(7×105/孔)接种在6孔板中并用DMSO或不同浓度的BLG06处理。然后收获细胞，用冷PBS洗涤，在4℃用70％乙醇固定并再次用PBS洗涤3次。之后，将细胞重 新悬浮在100RNase A中，并在37℃下孵育30min，以用400μL碘化丙啶染色。最后通 过流式细胞仪(BD LSRFortessa，America)分析DNA含量。
结果如图4中A和B所示，各期AGS细胞比例与对照组相比差异不大。说明，BLG06 不能阻滞AGS细胞周期。
4.BLG06对AGS细胞凋亡的影响
由于BLG06引起AGS的显着形态变化和高死亡率，进行Annexin-V/PI染色以进一步确 定BLG06是否可以诱导细胞凋亡。凋亡细胞中磷脂酰丝氨酸的易位使膜联蛋白V-FITC(一 种荧光素活性染料)能够与之结合。PI可以穿透破损的膜并与DNA结合。因此，Annexin-V /PI染色可以将活细胞与凋亡细胞和坏死细胞区分开来。具体方法为：
AGS细胞接种在六孔板上，并与化合物BLG06(2.0μM、3.0μM、4.0μM和5.0μM) 一起孵育48h；然后将细胞悬浮在100μL稀释的结合缓冲液中，将细胞浓度调整为1×106细胞/mL，并加入5μL Annexin-V-荧光素；在25℃下将混合物在黑暗中孵育5min后，加 入10μL碘化丙啶和400μL PBS；使用流式细胞仪(BD LSRFortessa，美国)进行测量。
结果如图4中C和D所示，经BLG06处理后，AGS细胞早期凋亡的百分比从0.91％增加到6.24％，晚期凋亡率从3.24％增加到30.40％，且早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的变异均 呈剂量依赖性。表明BLG06能够诱导AGS细胞凋亡。
5.BLG06对线粒体(MMP)膜电位变化的影响
进一步研究了BLG06对AGS细胞中MMP的影响。具体方法为：线粒体膜电位的检测是使用JC-10试剂盒(Solarbio Invitrogen Corp.，北京，中国)测定。将AGS细胞接种在2 4孔板的盖玻片上并孵育24h；将细胞用不同浓度的BLG06(2.0μM、3.0μM、4.0μM和 5.0μM)再处理24h，然后用4％多聚甲醛固定；PBS洗涤3次后，JC-10 37℃染色20mi n；用羰基氰化物-3-氯苯腙(CCCP，10.0μM)处理的细胞用作阳性对照；结果是通过激光 共聚焦荧光显微镜(Zeiss，德国)获得的。
结果如图5所示，CCCP作为阳性对照，当AGS细胞用不同浓度的BLG06(2.0μM、3. 0μM、4.0μM和5.0μM)处理时，观察到MMP以剂量依赖性方式明显减少。实验结果表 明BLG06诱导的AGS细胞凋亡与线粒体介导的通路有关。
6.分子对接
为了进一步探索分子靶点，进行了分子对接以评估BLG06是否是一种有效的PI3K/AK T/mTOR抑制剂。对于AKT蛋白，天冬氨酸292上的羧基阴离子与配体形成负相互作用。 由于其氨基阳离子，赖氨酸268与配体形成正相互作用。苏氨酸211和苏氨酸291、天冬酰 胺53和天冬酰胺54以及谷氨酰胺79作为极性氨基酸与配体形成强极性相互作用。这些对 接结果提供了对蛋白质-配体相互作用和进一步结构修饰以提高活性的重要依据。为了进一步研究分子机制，我们通过蛋白质印迹分析检测了BLG06对线粒体依赖性通路相关因子Bax和Bcl-2以及凋亡效因子caspase-3激活的影响。具体方法为：
细胞培养：细胞记数，接种，培养在六孔板中，长至100万个细胞后，取出，裂解，细胞被收集后，加入8μL细胞裂解液，提取上清总蛋白液。使用BCA法检测总蛋白浓度，后 变性蛋白样品，取相同质量的蛋白上样，SDS-PAGE胶电泳分离蛋白条带。根据目标蛋白计 算分子量，将相应位置的电泳胶条带切下，湿转法将蛋白条带转到PVDF膜上。
配置TBST缓冲液：25mM NaCl，100mM Tris，0.2％Tween-20，pH 7.4，用TBST 缓冲液溶解的5％脱脂奶粉溶液(w/v)封闭PVDF膜。分别相应用一抗和二抗孵育PVDF膜， TBST缓冲液漂洗适当次数后，使用SuperECL Plus超敏发光试剂盒显色成像。
结果如图6所示，BLG06处理48h后，Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显着升高， Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低。表明BLG06通过线粒体相关途径影响AGS细胞的凋亡。
7.BLG06对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响
为了进一步评估BLG06是否影响PI3K/AKT/mTOR信号通路，据报道与细胞凋亡有关， 进行了蛋白质印迹分析以检查相关蛋白质的变化。Akt的磷酸化水平是PI3K/Akt/mTOR信号 通路的重要标志之一，因此选择AGS的BLG06来测试其在2.00μM浓度下对Akt磷酸化(Ser 473)的抑制作用，持续48h。具体方法为：为了获得含有总蛋白的细胞裂解物，用RIP A裂解液裂解AGS细胞；使用Bradford测定法定量蛋白质的浓度；将样品施加到10％SDS- PAFE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上，转移到PVDE(聚偏二氟乙烯)膜上； 然后将膜浸入含有5％脱脂牛奶的TBST(Tris缓冲盐水和吐温)中，轻轻搅拌1h，并在4℃ 下与一抗(GAPDH#60004-Ig，购自Proteintech；AKT#YT0185；p-AKT#YP0006；mTO R#YT2913，购自ImmunoWay；PI3K#YP0176，购自Affinity；Bcl-2#bs-0032R、Bax#bs- 0127R、Caspase-3#bs-0081R，购自Bioss)；之后，将膜与HRP标记的(辣根过氧化物酶) 二抗在室温下孵育2h，并在照相胶片上检测；最后，用ImageJ软件分析蛋白质的条带。
结果如图6所示，BLG06可以显着降低Akt的磷酸化。此外，BLG06下调AGS细胞系 中PI3KCmTOR蛋白的表达，这表明BLG06能够影响PI3K/Akt/mTOR信号通路的功能，是 一种潜在的AKT蛋白抑制剂。
8.BLG06抑制AGS细胞迁移
通过Transwell迁移试验评估了BLG06抑制AGS细胞迁移的能力。具体方法为：为了分 析迁移活性，应用了具有8μm孔膜的transwell装置；将细胞以3×104个细胞/100μL的密度培养并悬浮在无血清RPMI-1640培养基中；将细胞悬浮液接种到含有Solarbio Matrigel(8 μm孔径；Corning)的装置的上室，然后接种600.0μL的20％FBS培养基；培养48h后， 分别用4％多聚甲醛固定细胞，并用0.1％结晶紫染色10min；使用光学显微镜对膜进行拍照。 结果如图7所示，与对照组相比，BLG06能够显着减少迁移到腔室底层的细胞数量。表明B LG06可以阻止AGS细胞的迁移。

Claims (8)

1.一种Isaindigotone衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述Isaindigotone衍生物结构式如下式(I)所示：
Figure FDA0004123921470000011
其中，所述n为1，R1、R2和R4为氢，R3和R5为三氟甲基；
或，所述n为1，R1为氢，R2为氟，R3、R4和R5为甲氧基；
或，所述n为1，R1和R4为氢，R2为氟，R3和R5为三氟甲基；
或，所述n为1，R1和R5为氢，R2、R3和R4为氟；
或，所述n为1，R1、R3和R4为氟，R2和R5为氢；
或，所述n为1，R1和R2为甲氧基，R3和R5为氢，R4为氟或三氟甲基；
或，所述n为2，R1和R2为氢，R3和R5为甲氧基，R4为羟基；
或，所述n为2，R1为氟，R2和R5为氢，R3和R4形成1,3-二氧五环。
2.如权利要求1所述的Isaindigotone衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为胃癌，所述Isaindigotone衍生物为以下所示化合物：
Figure FDA0004123921470000012
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为胰腺癌，所述Isaindigotone衍生物为以下所示化合物：
Figure FDA0004123921470000013
Figure FDA0004123921470000021
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure FDA0004123921470000022
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为结肠癌，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure FDA0004123921470000023
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌，所述Isaindigotone衍生物为：
Figure FDA0004123921470000024
8.如权利要求1所述的Isaindigotone衍生物或其药学上可接受的盐，加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的任一剂型。
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