CN112094817B - 分泌丙硫氧嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 - Google Patents

分泌丙硫氧嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌丙硫氧嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020177。该杂交瘤细胞株能够产生丙硫氧嘧啶单克隆抗体，该抗体具有特异性识别并高亲和力结合丙硫氧嘧啶抗原的能力，可用于丙硫氧嘧啶的检测。

Description

分泌丙硫氧嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及 应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种分泌丙硫氧嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。
背景技术
丙硫氧嘧啶(Propylthiouracil)又称丙基硫氧嘧啶，通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统，阻止甲状腺内酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺激素的合成。大剂量(每日剂量>700mg)能使周围组织中 T4向T3的转化减少。本品还有免疫抑制作用。由于本品只抑制甲状腺激素的合成，对已合成的甲状腺激素无作用，所以治疗甲状腺功能亢进时需要3～4周后才发挥疗效。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，丙硫氧嘧啶在2B类致癌物清单中。
丙硫氧嘧啶曾作为饲料添加剂被广泛使用，其主要作用是通过抑制甲状腺激素分泌，增大动物的皮下组织、肌肉和肠胃对水分的吸收，达到增重的目的。但甲状腺拮抗剂具有致畸和致癌作用，食用残留此类药物的食品存在巨大的安全风险。因此，欧盟早在1981年即禁止此类药物用于动物产品。
近年来，我国发现或查处的丙硫氧嘧啶违法添加案件仍时有发生，严重影响了我国畜牧业发展，破坏了行业信誉，并对人民群众身体健康造成了潜在危害。随着国家对食品安全日益重视，不断加大违法违规行为打击力度，丙硫氧嘧啶违法添加行为已大有收敛，整治效果显著。
目前，国家及行业标准规定的丙硫氧嘧啶权威检测方法为液相色谱- 质谱技术。此方法灵敏度高、特异性强，可靠性好；但是依赖大型仪器，对操作人员的专业知识储备要求高，操作繁琐费时，成本较高，不能广泛推广使用。基于抗原-抗体特异性结合的免疫学分析技术例如基于抗原-抗体特异性结合的胶体金免疫层析、荧光免疫层析等检测方法，具有灵敏度、特异性较好，不依赖于大型仪器，操作方便、时间短、成本低的特点，是一种易于现场即时使用的检测技术。如能开发用于检测丙硫氧嘧啶的基于免疫层析反应的检测方法及产品将利于丙硫氧嘧啶检测的广泛推广及使用。
发明内容
基于免疫反应的检测方法核心是特异性识别丙硫氧嘧啶的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测方法的准确性，因此好的抗丙硫氧嘧啶单克隆抗体的研制是该类检测方法开发的关键前提。
本发明提供了一株可以分泌特异性识别丙硫氧嘧啶并高亲和力结合丙硫氧嘧啶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌产生的丙硫氧嘧啶单克隆抗体。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株所分泌的抗体的应用，可用于检测丙硫氧嘧啶。
本发明提供了以下具体技术方案：
一种杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO：C2020177。该细胞株命名为杂交瘤细胞株9F2，于2020年09月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址湖北武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2020177。
一种丙硫氧嘧啶单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述的丙硫氧嘧啶单克隆抗体能够特异性识别丙硫氧嘧啶并高亲和力结合丙硫氧嘧啶，可用于检测丙硫氧嘧啶。
所述的丙硫氧嘧啶单克隆抗体可用于制备丙硫氧嘧啶检测试剂盒，进行丙硫氧嘧啶定性和/或定量测定。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
首次获得高效结合丙硫氧嘧啶抗原的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株，为后续抗体试剂应用于丙硫氧嘧啶的检测提供了基础。
本发明丙硫氧嘧啶单克隆抗体，能够特异性识别丙硫氧嘧啶并高亲和力结合丙硫氧嘧啶，可用于检测丙硫氧嘧啶。
附图说明
图1为抗丙硫氧嘧啶单克隆抗体ELISA效价检测结果曲线图；其中，横坐标conc.表示浓度，纵坐标表示450nm OD值，BSA代表空白对照组， Prop-BSA代表丙硫氧嘧啶单克隆抗体组。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
以下为本发明杂交瘤细胞株9F2、丙硫氧嘧啶单克隆抗体具体制备过程。如无特殊说明，本发明所述实验过程所用试剂、材料均为常规商品化试剂和材料，所用方法为标准实验方法(具体细节参照《抗体技术实验指南》(E.哈洛著，科学出版社，2005)和《抗体制备与使用实验指南》(G.C. 霍华德著，科学出版社，2010)，所提及学术专用名词及其英文缩写如无特殊说明均按照全国科学技术名词审定委员会编《免疫学名词》(科学出版社，2008)的规定使用。
丙硫氧嘧啶购自北京索莱宝。小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，购自中科院细胞库。
实施例1半抗原偶联
丙硫氧嘧啶蛋白偶联物即丙硫氧嘧啶和牛血清白蛋白(BSA)通过化学方法偶联在一起的抗原(简称Prop-BSA)。
偶联采用琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1-羟酸酯(SMCC)作为交联剂偶联半抗原(丙硫氧嘧啶)和BSA蛋白。SMCC是一类含N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的 SMCC，然后，再与含有巯基的蛋白质反应。
(1)将10mg SMCC溶于2ml二甲基甲酰胺(DMF)，得到SMCC 溶液。
(2)将0.4ml BSA加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)缓冲液使蛋白终浓度为15mg/ml，得到BSA蛋白体系。
(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到60mg BSA蛋白体系中，室温搅拌反应1h。
(4)步骤(3)中的反应物用1L 1×PBS(PH 7.4)缓冲液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC，得到透析后的BSA-SMCC溶液。
(5)将透析后的BSA-SMCC溶液倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的BSA蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将1.5mgBSA-SMCC溶液转移到5ml离心管中。
(6)将1.0mg丙硫氧嘧啶用0.5ml 1×PBS(pH 7.2)缓冲液溶解，得到丙硫氧嘧啶溶液。
(7)将丙硫氧嘧啶溶液滴加到1.5mg BSA-SMCC溶液中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时，得到Prop-BSA。
实施例2动物免疫
实验动物采用Balb/c品系雌性6周龄小鼠。免疫流程：用Prop-BSA 与Freund’s完全佐剂或Freund’s不完全佐剂混合，乳化后，皮下多点注射进行免疫。Prop-BSA的剂量为0.1mg/次/只。首次免疫用Freund’s完全佐剂，再次免疫用Freund’s不完全佐剂。每次免疫的间隔时间为3周，共3 次免疫。第三次免疫后，进行细胞融合前对小鼠进行回忆刺激，0.1mg Prop-BSA溶解于0.5ml PBS缓冲液中，腹腔注射。回忆刺激后3天，进行细胞融合和杂交瘤构建。
实施例3杂交瘤细胞株构建
细胞融合前一天制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5×106个～8×106个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106个/ml，小鼠脾细胞为1×106个/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105个/ml，均为100μl/孔。
(1)取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液(RPMI1640)混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液(RPMI1640)洗涤2次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按细胞数之比1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。
(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响后续聚乙二醇(PEG)的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6)在室温下融合：30秒内向装有细胞的离心管加入预热的1ml 45％(质量百分比)PEG(Merck，分子量4000)水溶液，PEG水溶液中含5％(质量百分比)二甲基亚砜(DMSO)，边加边搅拌。作用90秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml， 4ml，5ml和10ml RPMI1640。
(7)离心，800rpm，6分钟。
(8)弃上清，先用6ml 20％(质量百分比)小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96 孔板，得到融合后细胞悬液。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞悬液(饲养细胞选用腹腔巨噬细胞)的96孔板，100μl/孔，37℃、5％(体积百分比)CO2孵箱培养。
(11)在融合24小时后，加HAT选择培养液。用时1ml加入50ml 20％小牛血清完全培养液中。37℃、5％(体积百分比)CO2培养3-7天。
实施例4杂交瘤细胞株的单克隆化(有限稀释法)
(1)制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5×106个～8×106个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106个/ml，小鼠脾细胞为1×106个/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105个/ml，均为100μl/ 孔。
(2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1×103个/ml～5×103个/ml。
(3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml 含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
(4)培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
(5)第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT培养液。
(6)采用有限稀释法连续克隆阳性杂交瘤细胞3次。构建稳定细胞株，并扩大培养、冻存。
获得的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株9F2，属于小鼠杂交瘤细胞株(Musmusculus)，于2020年09月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：C2020177。
实施例5抗体生产
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植杂交瘤细胞。
(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次， 1000r/min离心10min。
(3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用不完全培养液配成 1.0×107个细胞/ml的悬液。
(4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含 1.0×107个细胞/ml)。
(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1～3天取1次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
实施例6抗体纯化
(1)小鼠腹水用冷PBS缓冲液稀释4倍后，于1×105转离心30min，去沉淀。
(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％(体积百分比)硫酸铵浓度。
(3)50％硫酸铵浓度溶液置冰中30min～60min，然后5000r/min离心 10min，去上清。
(4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。
(5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20mMol/L NaCl)中透析除盐。
(6)离心去沉淀。
(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量：1A280unit＝0.8mg蛋白质。
一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg～36mg。
(8)过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris-HCl缓冲液平衡。透析样品以Tris-HCl缓冲液(20mMol/L NaCl)等量稀释。样品进入柱床速度为1ml～2ml/min，以NaCl水溶液线形梯度洗脱。大部分单克隆抗体IgG于40mMol/L和80mMol/L NaCl水溶液洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L～150mMol/L NaCl水溶液洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆抗体IgG保存备用。获得纯化后的丙硫氧嘧啶单克隆抗体。
实施例7检测丙硫氧嘧啶抗原识别(ELISA)
(1)抗原包被：取抗原Prop-BSA和BSA对照分别用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度的包被液，混匀。加入96孔ELISA检测板，100ul/ 孔。置于4℃冰箱内过夜。
(2)封闭、洗板：加封闭液(BSA溶于PBS缓冲液，BSA质量百分浓度0.5％)，200μl/孔。37℃温箱温育2小时。
(3)加一抗(待测样品)、洗板：将处理好的一抗溶液加到孔内，100μl/ 孔，一抗溶液选用细胞融合后杂交瘤细胞培养上清液(即实施例3中第(11)步中培养物离心后的上清液)或免疫抗原的小鼠血清(完成实施例2免疫程序7天后采用尾静脉采血分离制备的小鼠血清)稀释液或者实施6纯化后的丙硫氧嘧啶单克隆抗体。37℃温箱温育2小时。
(4)加二抗、洗板：稀释好的二抗(商品化羊抗鼠Ig-HRP，如：ab6789， abcam，1:2000稀释使用)加入孔内。100μl/孔。37℃温育1小时。
(5)显色、洗板：配好TMB底物(即TMB显色液)，加入孔中，100μl/ 孔。显色5-10min。加2M(mol/L)硫酸100μl/孔终止反应。
(6)检测。用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度OD值。得到数据。检测结果见图1。
ELISA检测结果表明，本发明丙硫氧嘧啶单克隆抗体对丙硫氧嘧啶抗原具有特异性识别活性，能够高亲和力结合丙硫氧嘧啶抗原，抗体浓度 15ng/mL时仍对Prop-BSA有明显识别性反应，而对BSA无识别性。本发明丙硫氧嘧啶单克隆抗体可用于检测丙硫氧嘧啶。

Claims (4)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020177。
2.一种丙硫氧嘧啶单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.根据权利要求2所述的丙硫氧嘧啶单克隆抗体在检测丙硫氧嘧啶中的应用。
4.根据权利要求2所述的丙硫氧嘧啶单克隆抗体在制备丙硫氧嘧啶检测试剂盒中的应用。
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Denomination of invention: Hybridoma cell lines, monoclonal antibodies secreting monoclonal antibodies against propylthiouracil and their applications

Effective date of registration: 20220617

Granted publication date: 20210604

Pledgee: Guangfa Bank Co.,Ltd. Hangzhou Baoshan sub branch

Pledgor: GREENTOWN NONGKE DETECTION TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2022330001013

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