CN112094803A - 一种肝细胞培养基、培养方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括以下成分：液体基础培养基、半乳糖、胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠、脯氨酸、烟酰胺、鸟氨酸、转化生长因子α、表皮生长因子、地塞米松、Y‑27632、A‑83‑01、CHIR99021。本发明建立了原代肝细胞的长期体外扩增体系；肝细胞传代扩增培养时完全分化而不发生细胞退分化或转分化，降低了致癌风险，而且诱导成熟的肝细胞与原代肝细胞的肝功能差异小。
Description
技术领域
本发明涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。
背景技术
肝细胞的体外培养对于推进肝脏细胞疗法、肝细胞死亡和肝脏再生机制以及肝脏疾病药物研究等都具有重要的意义。
目前已经报道了几种可以对肝细胞进行体外培养的方法，如Takeshi Katsuda课题组在2016年报道，可以通过在培养基中添加化学小分子Y-27632、A-83-01和CHIR99021实现大鼠和小鼠肝细胞的体外扩增，培养的细胞退分化为具有双潜能性的肝祖细胞，经过进一步诱导可以分化为肝细胞或胆管细胞。2018年，中国科学院上海生化细胞研究所惠利健课题组发现并报道，HM培养基可以诱导人肝细胞在体外以双潜能的形式传代扩增培养。2019年，北京大学邓宏魁教授实验室报道了一种通过添加5种小分子化合物使原代肝实质细胞在体外长期(大于4周)稳定培养的技术，然而该技术只能用于维持培养中的肝细胞的性能，而不能用于肝细胞的体外扩增。前期的这些报道揭示了肝细胞体外扩增培养的挑战性。目前已建立的肝细胞体外培养系统还不能实现真正的肝细胞体外扩增培养，而只能以先退分化传代再诱导其分化为目的细胞的形式进行。诱导成熟后的肝细胞虽然具有一定的肝功能，但是与原代肝细胞相比仍具有明显的差异。同时诱导的肝细胞存在分化不完全的可能性，因而具有潜在的致瘤风险。
基于这样的技术背景，建立功能性肝细胞长期体外传代培养的培养体系，实现肝细胞在长期传代的过程中仍保持其完全分化特征和功能是目前亟待解决的难题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肝细胞培养基、培养方法及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种肝细胞培养基，所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：
液体基础培养基
优选地，所述肝细胞培养基还包括成熟培养基，所述成熟培养基以成熟培养基的总量为基础计，包括以下成分：
液体基础培养基
优选地，所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林。
优选地，所述弗斯可林的浓度为0.1μM～100μM，优选为1～50μM
优选地，所述肝细胞培养基中胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠为胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠的混合制剂。
优选地，所述Y-27632为Rho相关蛋白激酶抑制剂。
优选地，所述A-83-01为转化生长因子-β通路抑制剂。
优选地，所述CHIR99021为Wnt通路活化剂。
优选地，所述半乳糖的浓度为1.0～2.0g/L，更优选为1.6～2g/L；
优选地，所述脯氨酸的浓度为：0.1～1.0g/L，更优选为0.1～0.5g/L；
优选地，所述鸟氨酸的浓度为：0.01～0.3g/L，更优选为0.05～0.15g/L；
优选地，所述烟酰胺的浓度为：0.4～0.8g/L，更优选为0.5～0.7g/L；
优选地，所述转化生长因子α的浓度为10～80ng/mL，更优选为20-40ng/mL。
本发明第二方面提供一种肝细胞培养基在培养肝细胞中的方法，包括以下步骤：
1)用含FBS的基础培养基培养原代肝细胞，使其贴壁；
2)去除未贴壁的细胞，更换为增殖培养基扩增培养；
3)细胞使用前更换为成熟培养基培养。
较佳的，细胞使用前5～7天更换成熟培养基。
本发明第三方面提供一种肝细胞，所述肝细胞为原代肝细胞经第二方面所述的肝细胞培养方法中，采用所述步骤1)和所述步骤2)长期扩增培养后获得的仍保持完全分化的肝细胞，或为原代肝细胞经第二方面所述的肝细胞培养方法培养获得的成熟的肝细胞。
本发明第四方面提供一种肝细胞的用途，所述肝细胞在体外研究肝细胞死亡、增殖机制、肝细胞疗法、肝细胞移植、制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价中的用途。
如上所述，本发明的一种肝细胞培养基、培养方法及其用途，具有以下有益效果：
1)建立了原代肝细胞的长期体外扩增体系；
2)原代肝细胞传代培养时完全分化而不发生细胞退分化或转分化，降低了致癌风险。
3)诱导成熟的肝细胞与原代肝细胞的肝功能差异小。
4)培养后的肝细胞具有较强的体内定植和增殖能力。
附图说明
图1-a显示为HMM培养基和本发明的YACD培养基培养的小鼠原代肝细胞增殖曲线。
图1-b显示为HMM培养基和YACD培养基培养的不同天数的小鼠原代肝细胞明场显微镜下观察的小鼠原代肝细胞，标尺为100μm。
图2显示为YACD培养基培养的不同代数的小鼠肝细胞明场显微镜下观察的不同代数的小鼠肝细胞，标尺为100μm。
图3-1显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养5代的肝细胞重要肝功能标志基因的表达水平比较。
图3-2显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养11代的肝细胞重要肝功能标志基因的表达水平比较。
图4显示为YACD培养基培养不同代数的小鼠肝细胞Albumin蛋白免疫荧光染色后荧光显微镜下拍摄的照片，标尺为50μm。
图5显示为YACD培养基培养5代的小鼠肝细胞PAS染色后，显微镜下观察染色结果，标尺为100μm。
图6显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养5代的肝细胞CK19的表达水平。
图7显示为YACD培养基和ODF培养基培养的小鼠肝细胞功能基因的表达水平。
图8显示为ODF培养基诱导7天后的肝细胞与原代肝细胞肝功能基因的表达水平比较。
图9显示为体外扩增第5代的肝细胞移植到Fah-/-小鼠肝脏后25天的克隆生长情况，标尺为50μm。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本发明第一方面提供一种肝细胞培养基，所述培养基包括增殖培养基和/或成熟培养基，所述增殖培养基包括以下成分：
液体基础培养基
所述成熟培养基包括以下成分：
液体基础培养基
其中，所述液体基础培养基可以为MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、F12中的一种或几种，在一较佳实施例中所述液体基础培养基为DMEM/F12。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中创新性加入的半乳糖其浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.2～0.5g/L、0.6～1.0g/L、1.1～1.5g/L、1.6～2g/L。
具体的，所述半乳糖的含量可以为0.3g/L、0.7g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.8g/L。
本发明初步发现不加半乳糖会上调传代培养的肝细胞的CK19表达。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1％～0.9％、1％～3％、4％～7％、8％～10％。
具体的，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度可以为0.5％、1.5％、4.5％、8.5％。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中创新性加入的脯氨酸其浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～0.5g/L、0.6～1.5g/L、1.6～3.5g/L、3.6～5.5g/L、5.6～7.5g/L、7.5～10g/L。
具体的，所述脯氨酸的浓度为0.2g/L、0.3g/L、1.0g/L、3g/L、5g/L、9g/L。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中烟酰胺的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～0.3g/L、0.4～0.8g/L、0.9～3.5g/L、3.6～5.5g/L、5.6～7.5g/L、7.5～10g/L。
具体的，所述烟酰胺的浓度可以为0.5g/L、0.7g/L、1g/L、3g/L、5g/L、9g/L。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中创新性加入的鸟氨酸其浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.01～0.04g/L、0.05～0.15g/L、0.16～1g/L。
具体的，所述鸟氨酸的浓度为0.02g/L、0.07g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.8g/L。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中转化生长因子α的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～1ng/mL、2～10ng/mL、11～40ng/mL、51～80ng/mL、81～100ng/mL。
具体的，所述增殖培养基或成熟培养基中转化生长因子α的浓度为0.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、70ng/mL。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中表皮生长因子的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～1ng/mL、2～10ng/mL、11～30ng/mL、31～70ng/mL、71～100ng/mL。
具体的，所述增殖培养基或成熟培养基中表皮生长因子的浓度为0.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL。
其中，所述增殖培养基或成熟培养基中地塞米松的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：10nM～50nM、51nM～100nM、101nM～500nM、501nM～1μM、1.1μM～5μM、5.1μM～10μM。
具体的，所述增殖培养基或成熟培养基中地塞米松的浓度为10nM、50nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM。
其中，所述增殖培养基中Y-27632的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～1μM、2～10μM、11～30μM、31～70μM、71～100μM。
具体的，所述增殖培养基中Y-27632的浓度为0.5μM、5μM、25μM、45μM、85μM。
其中，所述增殖培养基中A-83-01的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.01～0.1μM、0.2～0.9μM、1～3μM、4～7μM、8～10μM。
具体的，所述增殖培养基中A-83-01的浓度为0.05μM、0.3μM、1.5μM、5μM、9μM。
其中，所述增殖培养基中CHIR99021的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～1μM、2～10μM、11～30μM、31～70μM、71～100μM。
具体的，所述增殖培养基中CHIR99021的浓度为0.5μM、5μM、25μM、45μM、85μM。。
其中，所述成熟培养基中抑瘤素-M的浓度根据实际需要，可以选自以下任一范围：0.1～1ng/mL、2～10ng/mL、11～30ng/mL、31～70ng/mL、71～100ng/mL。
具体的，所述成熟培养基中抑瘤素-M的浓度为0.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL。
其中，所述成熟培养基中腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林，所述弗斯可林的浓度可以选自以下任一范围：0.1～1μM、2～10μM、11～30μM、31～50μM、51～100μM。
具体的，所述成熟培养基中弗斯可林的浓度为0.5μM、5μM、25μM、45μM、85μM。
本发明第二方面提供一种肝细胞培养基培养肝细胞的方法，包括以下步骤：
1)用含5％～15％(体积)FBS的基础培养基培养原代肝细胞，使其贴壁；
2)去除未贴壁的细胞，更换为增殖培养基扩增培养；
3)细胞使用前更换为成熟培养基培养。
较佳的，原代肝细胞贴壁4～8小时后再进行步骤2)，避免肝细胞贴壁不牢固而在更换增殖培养基时损失细胞。
较佳的，细胞使用前5～7天更换成熟培养基，以保证诱导成熟后的肝细胞具有更为成熟的肝功能。
较佳的，所述培养肝细胞的方法为在CO2培养箱中，培养条件为4％～6％的CO2、35～38℃。
本发明第三方面提供一种肝细胞，所述肝细胞为原代肝细胞经扩增培养基体外长期培养后仍保持完全分化的肝细胞，或经成熟培养基诱导成熟的肝细胞。
所述完全分化的肝细胞不进行退分化或转分化，且具有完全分化的肝细胞的所有特征和功能。即所述完全分化的肝细胞表达ALB基因、AAT基因、E-cadherin基因中的一种或几种，且不表达肝祖细胞标志因子细胞角蛋白19(CK19)。所述完全分化的肝细胞具有糖元贮存功能。
完全分化的肝细胞避免了分化不完全引起的细胞功能降低或功能不全以及向癌细胞转化的风险。
所述成熟的肝细胞，肝功能相关基因(ALB基因、AAT基因、E-cadherin基因、CYP3A11基因)表达上调。
本发明第四方面提供一种肝细胞的用途，所述肝细胞在阐明肝细胞体内外死亡、增殖机制、肝细胞疗法、肝细胞移植、制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价中的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1增殖培养基和成熟培养基的配制
增殖培养基(YACD培养基)：500ml DMEM/F12中含2g/L半乳糖、1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠[(ITS)-X]、0.3g/L脯氨酸、0.61g/L烟酰胺、0.1g/L鸟氨酸，40ng/mL转化生长因子α(TGFa)、40ng/mL表皮生长因子(EGF)、10μM地塞米松(Dex)、10μM Y-27632、0.5μM A-83-01、3μM CHIR99021和青链霉素混合液(Solarbio，P1400)。
成熟培养基(ODF培养基)：500ml DMEM/F12中含2g/L半乳糖(厂家BBI，货号GB0215)5ml胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠[(ITS)-X](厂家原培生物，货号S450)、0.3g/L脯氨酸(厂家Alfa Aesar，货号A10199.22)、0.61g/L烟酰胺(厂家Sigma，货号N7004)、0.1g/L鸟氨酸(厂家Sigma，货号O2375)，40ng/ml TGFα(厂家Peprotech，货号AF-100-16A)、40ng/mlEGF(厂家Peprotech，货号AF-100-15)、10μM Dex(厂家Sigma，货号D4902)、20ng/ml抑瘤素-M(Osm)(厂家Novoprotein，货号C099B)、20μM弗斯可林(forskohlii，FSK)(厂家selleck，货号S2449)和青链霉素混合液(Solarbio，P1400)。
实施例2小鼠肝细胞体外扩增培养
取50μg胶原(厂家Sigma，货号C7661)将其用水配制成浓度20μg/mL的包被液，用配置好的包被液包被6cm细胞培养板。肝脏灌流获取新鲜原代小鼠肝实质细胞，将其以2x104/cm2密度接种于胶原包被的细胞培养板上，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行培养，使其贴壁。
6小时后，去除未贴壁的细胞，在原培养基中加入实施例1中配置好的YACD培养基进行培养，每隔两天换液。每天观察，如细胞增殖较密，及时传代。同时设置对照组，对照组用传统的肝细胞HMM培养基培养已贴壁的细胞。
如图1-a、图1-b所示，相较于传统的肝细胞HMM培养基，YACD培养基可以诱导小鼠原代肝细胞在体外增殖。如图2所示，YACD培养基可以使小鼠原代肝细胞在体外长期传代扩增。
为了更好的将培养的细胞用于肝细胞体内外的相关研究中，需要进一步对培养的细胞进行肝功能成熟诱导。实验组细胞传代扩增到需要的细胞数目时，换用ODF培养基继续培养6天后，即完成诱导可用于相关实验。
实施例3Real-time PCR验证YACD培养基扩增培养的小鼠原代肝细胞的肝功能基因表达
将培养至第5代和第11代的细胞分别经PBS洗涤，用适量的Trizol充分裂解。加入20％的氯仿，4度离心20分钟，取上层水相，加入等体积异丙醇混匀，室温静置15分钟，4度离心15分钟，用75％乙醇洗涤沉淀，室温晾干，加水溶解提取的RNA。
使用反转录试剂盒(厂家Takara，货号RR047B)，首先取500ng RNA加入5x gDNAEraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，加RNase Free dH2O将体系配制到10μl,混匀后42℃孵育2min，去除基因组DNA污染。然后在反应液(10.0μl)内加入PrimeScript RTEnzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，5x PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μl,RNase Free dH2O 4.0μl,轻柔混匀后按以下条件反转录为cDNA：37℃ 15min，85℃5sec。并通过Real-time PCR检测相应基因的表达水平，Real-time PCR反应体系如表1所示，反应条件如表2所示，引物序列如表3所示。
表1 Real-time PCR反应体系：
| 试剂 | 体积(μl) |
| TB Green Premix Ex Taq II(2x) | 10.0 |
| PCR Forward Primer(10uM) | 0.8 |
| PCR Reverse Primer(10uM) | 0.8 |
| ROX Reference Dye II(50x) | 0.4 |
| cDNA | 2 |
| ddH2O | 6 |
表2 Real-time PCR反应条件
表3引物序列表
结果如图3-1所示，经YACD培养基扩增5代培养的肝细胞可以表达重要的肝功能基因ALB、AAT、E-cadherin。
如图3-2所示，经YACD培养基扩增11代培养的肝细胞可以表达重要的肝功能基因AAT、ALB、CYP3A11。
实施例4荧光显微镜验证YACD培养基扩增培养的小鼠原代肝细胞的肝功能基因表达
培养后的细胞经PBS洗涤后，用4％多聚甲醛固定。用含有10％驴血清的PBS封闭30分钟，PBS洗涤后分别孵育相应的一抗和二抗(一抗厂家Bethyl Lab，货号A90-134A，稀释比例1:500，室温孵育3h或者4℃过夜孵育；二抗厂家Jackson，货号712-165-147，稀释比例1:200，室温孵育1h)并用荧光显微镜进行相应的检测。
结果如图4所示，经YACD培养基扩增长期传代培养的肝细胞可以表达重要的肝功能基因ALB。
实施例5PAS染色验证YACD培养基扩增培养的小鼠原代肝细胞的糖元贮存功能
培养后的细胞经PBS洗涤后，用4％多聚甲醛固定，氧化剂(厂家Yeasen，货号40760ES40)室温氧化15～20分钟，流水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次，Schiff Reagent(厂家Yeasen，货号40760ES40)室温浸染10～20分钟，流水冲洗2分钟，用苏木素染色液复染1～2分钟。水洗，晾干后镜检。
如图5所示，PAS染色显示，经YACD培养的肝细胞具有相应的糖元贮存功能，表明经其长期传代扩增的肝细胞仍较好的保持了相应的肝功能。
实施例6验证YACD培养基扩增培养的小鼠原代肝细胞不表达肝祖细胞标志因子
实验方法同实施例3。
结果如图6所示，YACD培养基培养扩增的肝细胞不表达肝祖细胞标志因子细胞角蛋白19(CK19)，这说明，经YACD长期传代的扩增的肝细胞为具有良好肝功能的肝细胞而非退分化的肝祖细胞。
实施例7验证ODF培养基诱导YACD培养基扩增的肝细胞肝功能基因表达
实验方法同实施例3。结果如图7所示，诱导6天后的肝细胞较YACD培养基培养的细胞肝功能相关基因表达显著上调，表明ODF培养基可以诱导YACD培养基扩增的肝细胞进一步成熟。
实施例8不同肝细胞的肝功能基因表达
本实施例对比了用普通肝细胞培养基(HMM培养基)培养的肝细胞、用YACD和ODF两种培养基诱导7天后的肝细胞与原代肝细胞肝功能相关基因表达情况，实验方法同实施例3。
实验发现用YACD培养基培养原代肝细胞，细胞能够长期传代扩增，而且用ODF培养基诱导7天后可以检测到肝功能基因表达，原代肝细胞用现有的普通肝细胞培养基培养时，细胞很快死亡。用本发明的培养基(YACD培养基和ODF培养基)培养的肝细胞与原代肝细胞的基因表达情况结果如图8所示，诱导7天后的肝细胞虽然与原代细胞肝功能相关基因表达程度存在一定差距，但是诱导后的表达丰度足以将此肝细胞用于体外实验研究相关科学问题。
实施例9验证体外培养的肝细胞体内增殖能力
本实施例将体外传代扩增5次的小鼠肝细胞约1x 106通过脾脏注射，移植到Fah-/-小鼠肝脏，并撤除小鼠的NTBC[2-(2-硝基-4-三氟甲基苄基)-环己烷-1,3-二酮]供给。观察25天后，取小鼠肝脏组织，用4％的多聚甲醛进行固定，用30％的蔗糖进行脱水，对脱水后的组织进行冰冻切片。切片用含有10％驴血清的PBS封闭30分钟，然后分别孵育相应的一抗和二抗(一抗厂家上海邦律生物，货号MN055，稀释比例1:500，室温孵育3h或者4℃过夜孵育；二抗厂家Jackson，货号712-165-147，稀释比例1:200，室温孵育1h)，并用荧光显微镜进行相应的检测。
结果如图9所示，移植到小鼠肝脏的细胞可以定植，并具有较强的克隆生成能力，这说明培养后的肝细胞具有较强的体内定植和增殖能力，帮助受损肝脏恢复相应的功能。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种肝细胞培养基，其特征在于，所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：
2.根据权利要求1所述的肝细胞培养基，还进一步包括成熟培养基，所述成熟培养基以成熟培养基的总量为基础计，包括以下成分：
3.根据权利要求2所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林。
4.根据权利要求3所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述弗斯可林的浓度为0.1μM-100μM，优选为1～50μM。
5.根据权利要求1或2所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述液体基础培养基为MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、F12中的一种或几种。
6.根据权利要求1或2所述的肝细胞培养基，其特征在于，还包括以下项中的一种或几种：
1)所述半乳糖的浓度为1.0～2.0g/L，优选为1.6～2g/L；
2)所述脯氨酸的浓度为：0.1～1.0g/L，优选为0.1～0.5g/L；
3)所述鸟氨酸的浓度为：0.01～0.3g/L，优选为0.05～0.15g/L；
4)所述烟酰胺的浓度为：0.4～0.8g/L，优选为0.5～0.7g/L；
5)所述转化生长因子α的浓度为10～80ng/mL，优选为20～40ng/mL。
7.一种肝细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用含FBS的基础培养基培养原代肝细胞，使其贴壁；
2)去除未贴壁的细胞，更换为权利要求1所述的肝细胞培养基中的所述增殖培养基扩增培养；
3)细胞使用前更换为权利要求2-4任一所述的肝细胞培养基中的所述成熟培养基培养。
8.根据权利要求7所述的肝细胞培养方法，其特征在于，步骤3)中细胞使用前5～7天更换成熟培养基。
9.一种体外分离的肝细胞，其特征在于，所述肝细胞为原代肝细胞经权利要求7或8所述的肝细胞培养方法中，采用所述步骤1)和所述步骤2)扩增培养后得到的完全分化的肝细胞，或为原代肝细胞经权利要求7或8所述的肝细胞培养方法培养获得的成熟肝细胞。
10.一种如权利要求9所述肝细胞的用途，其特征在于，所述肝细胞用于体外研究肝细胞死亡机制、增殖机制、肝脏疾病机制、肝细胞疗法、肝细胞移植、制备生物人工肝、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价。
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