CN112094336A - 一种Avexitide的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备Avexitide的方法，方法中采用氨基树脂为起始树脂，按Avexitide的氨基序列反相依次接入相应的保护氨基酸得到Avexitide肽树脂，Avexitide保护肽树脂经酸解后获得Avexitide粗品，Avexitide粗品再经过纯化和冻干得到Avexitide纯品。本发明工艺操作简单，产品总收率高，适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种Avexitide的制备方法。
背景技术
Avexitide是一种GLP-1受体拮抗剂，这种多肽类药物包含31个氨基酸序列，可选择性地与GLP-1受体结合，阻断GLP-1的作用，从而防止胰岛素过度分泌，减少餐后低血糖的发生。Avexitide具有以下的结构：
Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
Avexitide的制备方法已有很少有报道，本发明提供一种高效的Avexitide制备方法，以满足医药用途。
发明内容
本发明提供了一种高效的制备方法，采用氨基树脂为起始树脂，制备工艺操作简单，产品收率高、纯度高。
本发明提供了一种Avexitide的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，按Avexitide的氨基序列反相依次接入相应的保护氨基酸得到Avexitide肽树脂，Avexitide保护肽树脂经酸解后获得Avexitide粗品，Avexitide粗品再经过纯化和冻干得到Avexitide纯品。
上述Avexitide的制备方法中，所述的氨基树脂的取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.6mmol/g树脂。
进一步的，所述氨基树脂选自Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂和RinkAmide树脂，优选Rink Amide-MBHA树脂。
上述Avexitide的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸的用量为起始树脂氨基总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～4.0倍。
作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
Avexitide肽树脂为：
X-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂
其中X为Boc，或为H
优选的，Avexitide肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到Avexitide粗品：
进一步优选的，所述Avexitide肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。
更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。
所述酸解剂用量为每克Avexitide肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利Avexitide肽树脂需要9～11mL酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。
进一步的，Avexitide粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到Avexitide纯品，具体方法为：
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Avexitide纯化中间体浓缩液；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Avexitide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Avexitide纯品。
本发明工艺操作简单，产品总收率高，适合规模化生产。
具体实施方式
本发明公开了一种合成Avexitide的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见下表。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 Avexitide肽树脂的合成
Avexitide肽树脂为：
Boc-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂
用Rink Amide-MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得Avexitide肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如表下所示：
| 接肽顺序n＝ | 保护氨基酸 |
| 1 | Fmoc-Ser(tBu) |
| 2 | Fmoc-Pro |
| 3 | Fmoc-Pro |
| 4 | Fmoc-Pro |
| 5 | Fmoc-Ala |
| 6 | Fmoc-Gly |
| 7 | Fmoc-Ser(tBu) |
| 8 | Fmoc-Ser(tBu) |
| 9 | Fmoc-Pro |
| 10 | Fmoc-Gly |
| 11 | Fmoc-Gly |
| 12 | Fmoc-Asn(Trt) |
| 13 | Fmoc-Lys(Boc) |
| 14 | Fmoc-Leu |
| 15 | Fmoc-Trp(Boc) |
| 16 | Fmoc-Glu(OtBu) |
| 17 | Fmoc-Ile |
| 18 | Fmoc-Phe |
| 19 | Fmoc-Leu |
| 20 | Fmoc-Arg(Pbf) |
| 21 | Fmoc-Val |
| 22 | Fmoc-Ala |
| 23 | Fmoc-Glu(OtBu) |
| 24 | Fmoc-Glu(OtBu) |
| 25 | Fmoc-Glu(OtBu) |
| 26 | Fmoc-Met |
| 27 | Fmoc-Gln(Trt) |
| 28 | Fmoc-Lys(Boc) |
| 29 | Fmoc-Ser(tBu) |
| 30 | Fmoc-Leu |
| 31 | Boc-Asp(OtBu) |
1、接入第2个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Rink Amide-MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
2、接入第2～31个保护氨基酸
采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～31个保护氨基酸，得到Avexitide肽树脂。
实施例2 Avexitide肽树脂的合成
Avexitide肽树脂为：
H-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂
用Rink Amide-MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得Avexitide肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如表下所示：
1、接入第1个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Rink Amide-MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
2、接入第2～31个保护氨基酸
采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～31个保护氨基酸，得利Fmoc-保护的Avexitide肽树脂。
3、最后去保护
取Fmoc-保护的Avexitide肽树脂，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到Avexitide肽树脂
实施例3 Avexitide粗品的制备
取实施例1制得的利Avexitide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得Avexitide粗品。
实施例4 Avexitide粗品的制备
取实施例2制得的利Avexitide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得Avexitide粗品。
实施例5 Avexitide粗品的纯化
取实施例3制得的Avexitide粗品，用10％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Avexitide纯化中间体浓缩液；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Avexitide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Avexitide纯品8.5g，纯度为99.1％，最大单一杂质0.10％，总收率为25.2％，分子量为3369.8(100％M+H)。
实施例6 Avexitide粗品的纯化
取实施例4制得的Avexitide粗品，用10％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Avexitide纯化中间体浓缩液；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Avexitide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Avexitide纯品8.9g，纯度为99.3％，最大单一杂质0.09％，总收率为26.4％，分子量为3369.6(100％M+H)。
上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，产品总收率大于25％，具有广泛的实用价值和应用前景。
Claims (7)
1.一种Avexitide的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，按Avexitide的氨基序列反相依次接入相应的保护氨基酸得到Avexitide肽树脂，Avexitide保护肽树脂经酸解后获得Avexitide粗品，Avexitide粗品再经过纯化和冻干得到Avexitide纯品:
Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-
Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-
Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH。2
2.根据权利要求1所述的Avexitide的制备方法，其特征在于：所述氨基树脂的取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.6mmol/g树脂。
3.根据权利要求2所述的氨基树脂选自Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂和Rink Amide树脂，优选Rink Amide-MBHA树脂。
4.根据权利要求1所述的Avexitide的制备方法，其特征在于：所述的Avexitide肽树脂为：
X-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-
Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-
Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂
其中X为Boc，或为H。
5.根据权利要求1所述的Avexitide的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-保护氨基酸的用量为起始树脂氨基总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～4.0倍。
6.根据权利要求1～5任一项所述的Avexitide的制备方法，其特征在于：Avexitide肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到Avexitide粗品。
7.根据权利要求1所述的Avexitide的制备方法，其特征在于：Avexitide粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到Avexitide纯品。
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| WO2005100388A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Biocon Limited | Production of insulinotropic peptides |
| CN101280009A (zh) * | 2005-06-29 | 2008-10-08 | 常州制药厂有限公司 | Exendin 4多肽片段 |
| CN102584944A (zh) * | 2012-02-06 | 2012-07-18 | 成都圣诺科技发展有限公司 | 一种依非巴特的制备方法 |
| CN104854126A (zh) * | 2012-11-30 | 2015-08-19 | 国立大学法人京都大学 | 多肽及成像方法 |
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