CN112094332A

CN112094332A - 一种糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用

Info

Publication number: CN112094332A
Application number: CN202011023895.2A
Authority: CN
Inventors: 张在宝; 冯志国; 刘慧娟; 张弛; 黄珂; 胡梦辉; 袁红雨
Original assignee: Xinyang Normal University
Current assignee: Xinyang Normal University
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明涉及一种糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用，该糖转运蛋白是由序列表中所示的氨基酸序列组成的，并提供糖转运蛋白或糖转运蛋白基因在调控植物雄性不育中的应用；提供利用上述糖转运蛋白基因培育转基因植物的方法为，抑制目的植物中糖转运蛋白基因的表达，即得到雄性不育的转基因植物。上述技术方案中提供的糖转运蛋白基因(花药发育控制基因)，补充现有雄性不育基因序列，在实际应用方面，能够提供糖信号在不育系制备中的应用的新方法，利用本发明克隆的基因进行分子水平的转基因育种，以克服常规的杂交和回交育种方法育种的时间长、育种效果不确定的缺陷。

Description

一种糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用

技术领域

本发明涉及拟南芥雄性不育技术领域，具体涉及一种糖转运蛋白及其在调控拟南芥雄性不育中的应用。

背景技术

花药是植物的雄性生殖器官，其发生发育直接影响到植物的雄性育性，进而影响传种接代和农作物的产量，因此一直是植物生殖发育领域研究的热点。根据细胞学的特征，花药的发育可以分为2个阶段14个时期，其中第1阶段(花药发育1-7期)为花药形态建成阶段，第2阶段为小孢子发生阶段(花药发育8-14期)。在第1期，花药原基由3层细胞组成，由外而内为L1、L2、L3，它们的分裂(增殖)及分化产生花药的各种组织；其中，L1产生的细胞分化为表皮层，L3细胞分裂分化形成维管束和支撑组织，而L2层细胞则不断的分化、分裂并在第5期产生内皮层、中间层、绒毡层和小孢子母细胞，形成四个药室以及典型的5层细胞的结构，从而完成花药分化；在6-8期，小孢子母细胞进行减数分裂形成单倍体的小孢子；9-12期，绒毡层降解、小孢子经过有丝分裂发育为成熟的三核花粉粒；13-14期花药壁开裂释放出成熟花粉粒到柱头上。

花药的表面由两种脂质生物聚合物：角质和蜡质，组成角质层覆盖花药表面，同时花粉的表面也有花粉壁保护。这些结构对于花粉的形成、成熟、扩散以及成功授粉是必需的，花粉壁主要由外壁(外部花粉壁)和内壁(花粉内壁)组成，外壁的主要成分是孢粉素，可帮助花粉粒抵抗脱水、病原体以及化学和物理损伤。不同植物的花粉外壁呈现不同的表面特征，对于柱头识别花粉粒是重要的，花粉外壁发育缺陷的突变体大多表现出雄性不育特征。

孢粉素是一种复杂的疏水性生物聚合物，其组成物质了解的还不多，难以纯化和分离以用于分析。长期以来人们只知道孢粉素的成分来源于酚类和脂肪酸，通过酯键或醚键共价连接。近期遗传和分子方面的研究在孢粉素生物合成和转运方面发现了许多关键基因：拟南芥的MS2及其水稻直系同源基因DPW编码一类质体定位的脂肪酰基载体蛋白还原酶，催化脂肪酰基载体蛋白转化成相应脂肪醇。在内质网中，这些脂肪醇被进一步催化产生三酮或四酮吡喃酮，之后在一些关键酶如酰基辅酶A合成酶(ACOS5)、LAP5/6、TETRAKETIDEa-吡喃酮还原酶(TKPRs)、细胞色素P45家族(CYP703A2，CYP704B1)等的作用下生成孢粉素。

参与孢粉素生物合成的大多数酶优先在绒毡层细胞中表达，暗示孢粉素前体的合成主要发生在花药最内侧的孢子体细胞层。这些前体分泌和从绒毡层细胞到小孢子转移是由ATP结合盒(ABC)转运蛋白、脂质转运蛋白(LTP)和MATE蛋白所介导。ABC转运蛋白利用ATP产生的能量将多种脂质分子移动穿过细胞膜。AtABCG26及其直系同源OsABCG15能够转运孢粉素前体蛋白穿过绒毡层质膜，OsABCG26及其直系同源AtABCG1在花药角质层和花粉外壁形成中起关键作用。LTP能够携带脂质分子并进入细胞外，其在外壁的运输功能已在拟南芥和水稻中被证实，例如拟南芥III型LTPs、GPI锚定的非特异性LTPs(LTPGs)和水稻OsC6在孢粉素前体到小孢子表面的转运过程中起重要作用。

糖是基本的生命元素，其合成与代谢在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。在糖基化多肽基因RGP1，RGP2突变体中，雄蕊可以正常形成，但花粉发育出现异常，在小孢子第一次有丝分裂时，花粉空泡化增大，花粉壁发育不完整，导致花粉破裂。对蔗糖磷酸合成酶(SPS1-4)的研究表明，不同的SPS在不同的组织中表达，在雄蕊的不同组织及不同发育时期也有不同的表达，表明蔗糖信号在雄蕊发育中起调控作用。

但目前对于雄蕊发育过程中糖信号是在什么时期，什么组织中合成，及又是如何运输的目前都不清楚。在实验中发明人筛选到一株新的拟南芥雄性不育突变体rms1803。遗传分析发现，此突变体是由一个隐性核基因控制的。细胞学分析表明，rms1803突变体小孢子发育过程异常，后期小孢子发生破裂，空泡化，最终无可育花粉形成。根据拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)上的基因注释知，此基因编码与一个糖运输相送转化蛋白，目前尚未有其在花药发育中的功能报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖转运蛋白及其在拟南芥雄性不育控制中的应用，能有效解决现有技术中存在的无法得知糖信号机理的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

一种糖转运蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的。

另外还保护编码上述糖转运蛋白的基因RMS1803，如序列表中序列2所示的CDS序列。

同时保护糖转运蛋白或糖转运蛋白基因在调控植物雄性不育中的应用。

利用上述糖转运蛋白基因培育转基因植物的方法为，抑制目的植物中糖转运蛋白基因的表达，即得到雄性不育的转基因植物。

利用上述糖转运蛋白基因培育雄性不育植物的方法为，抑制目的植物中糖转运蛋白基因的表达，得到雄性不育植物。

其中，抑制糖转运蛋白基因表达的方式为：将T-DNA插在糖转运蛋白基因的第一个外显子上。

上述技术方案中提供的糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用，上述糖转运蛋白是RMS1803基因表达的，其是一个糖信号运输蛋白质，介导了糖信号从细胞质到内质网的运输，该基因突变后花粉完全败育。RMS1803在花药发育早期的绒毡层表达，是与糖信号转导途径相关的参与小孢子发育的关键基因。该基因是拟南芥雄性不育的调控基因，可用于拟南芥或其他植物的雄性不育系的构建；利用RMS1803基因，通过cas9敲除的手段提供一种雄性不育植株获得方法，可应用于不同物种的同源基因功能的研究；同时本发明建立的糖信号分析方法可以推广应用到其他糖代谢功能基因及其他物种糖信号的功能研究中；建立的花药活体蛋白时空表达的分析方法可以推广应用到植物功能基因的研究中。

本发明提供了一种新的花药发育控制基因，补充现有雄性不育基因序列，此基因具备鉴定拟南芥或其他植物的雄性不育植物的基因型的潜力；在实际应用方面，能够提供糖信号在不育系制备中的应用的新方法，利用本发明克隆的基因进行分子水平的转基因育种，以克服常规的杂交和回交育种方法育种的时间长、育种效果不确定的缺陷。

附图说明

图1为RMS1803突变体的基因结构图；图中显示基因结构与T-DNA位置，黑色长方形代表外显子，基因内黑线代表内含子；

图2为RMS1803突变体与野生型拟南芥植株、花朵和花药图片；图中A、C、E为野生型，B、D、F为RMS1803突变体；A、B标尺＝10mm，C、D标尺＝1mm，E、F标尺＝100μm；

图3为RMS1803突变体与野生型拟南芥花药半薄切片分析；

图4为RMS1803突变体小孢子母细胞减数分裂分析图；A-E为DAPI染色结果；F-J为着丝粒探针荧光标记原位杂交(FISH)结果；A、F为偶线期，箭头指示同源配对区域；B、G为终变期，箭头指示交叉区，三角箭头指示着丝粒；C、H为前期Ⅱ，箭头指示两组染色体间的小细胞器带区域；D、I为后期Ⅱ；E、J为4个新形成的核；

图5为RMS1803突变体和野生型拟南芥花粉的扫描电镜图；A、D为野生型拟南芥花粉；B、C、E、F为RMS1803突变体拟南芥花粉；A、B标尺＝50μm；C标尺＝20μm；D、E、F标尺＝10μm；

图6为RMS1803在拟南芥花药中的表达模式分析；T为绒毡层；RMS1803-GFP，RMS1803与GFP融合基因表达蛋白；Msp为小孢子。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。

本发明经过科学的研究，从拟南芥筛选分离出控制花药发育的新的糖信号转导相关的突变体rms1803，功能研究表明该突变体无活性花粉的产生，植株完全不育，对该基因的深入开发和利用为进行人工创制不育系等农业应用方面具有很大的经济效益。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例

1.拟南芥突变体rms1803，原始野生型为Ler生态型(信阳师范学院植物分子生物学实验室保存)。

2.拟南芥种植条件：拟南芥在4℃春化2-4天(0.1％的琼脂糖)，然后种植在黑土：蛭石：珍珠岩(1:9:0.25)的混合土中；光照时间为16小时光照，8小时黑暗，湿度保持在60-70％，温度控制在22-25℃，光照强度为50μEm-2s-1，营养液为PNS(表1)。

表1 PNS母液成分和1升1×PNS配方

a：取Na₂-EDTA 7.45g及FeSO₄ 5.57g分别溶于400mL水中加热至沸，然后混合，并继续煮沸30min，冷却并定容至1L即可。

b：将硼酸0.434g；硫酸锰1.7626g；硫酸铜0.0798g；硫酸锌0.172g；钼酸钠0.432g；氯化钠0.585g；氯化锰0.00129g混合，加水搅拌并定容至1L即可。

c：将磷酸二氢钾130.4g和磷酸氢二钾9.12g混合溶于1L水中即可。

细胞学观察

1、花药半薄切片分析：取rms1803突变体和野生型的新鲜花序放入装有新配制的FAA固定液(50％酒精，5.0％冰醋酸和3.7％甲醛)的青霉素小瓶，抽气使材料到底部，4℃过夜。第二天开始进行梯度酒精脱水(50％×2，60％，70％，80％，90％，95％和100％×2)，每次30分钟，转移到二甲苯中20分钟(2次)，浸入树脂中过夜(Spurr树脂)。第三天把材料包入加入硬化剂的树脂中，摆正材料位置，65℃放置2-3天，让树脂完全硬化。然后树脂块用lecia R250切片机切片，厚度为1μm，经过甲苯胺蓝染色，置于显微镜中观察。

2、花粉扫描电镜制作：取rms1803突变体和野生型新鲜成熟花药和花粉用导电胶固定在铜台上，24℃干燥箱中干燥过夜，第二天将样品表面喷上8nm的金粉，置于扫描电镜中观察。

3、花药透射电镜制作：取rms1803突变体和野生型新鲜花药放入含2.5％戊二醛(pH7.2)的新配制的磷酸缓冲液中固定，更换新鲜的固定液4℃过夜。第二天用磷酸缓冲液洗涤材料3次，然后在在含有2％锇酸的磷酸缓冲液中后固定过夜，保证材料都染成黑色。第三天酒精梯度脱水(15％，30％，50％，60％，70％，80％，90％，95％和100％×2)，最后将材料包埋在纯树脂中(epon树脂)。65℃放置2-3天，让树脂完全硬化。用超薄切片机切片，厚度为40-70nm，切片在醋酸双氧铀和柠檬酸铅中染色，后置于透射电镜中观察。

花序组织RNA提取，RT-PCR及qPCR分析

取新鲜将rms1803突变体和野生型花序材料，在研钵中用液氮将材料研磨充分。将研好的粉未倒入预先加入1mL TRIZOL的EP管中，振荡混匀。15-30℃温育后加入200μL氯仿，室温静置10分钟，12000g 4℃离心10分钟，小心将上层水相移至另一新EP管中，加入0.6倍体积异丙醇，室温静置20分钟，12000g4℃离心10分钟，弃上清用75％酒精洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10分钟，干燥RNA，溶于20-40μL DEPC-H₂O中。跑胶检测RNA质量，取适量RNA用AMV reverse transcriptase反转录合成cDNA第一链，将合成好的cDNA作为RT-PCR的扩增模板；半定量RT-PCR程序为预变性95℃5min，变性95℃30sec，退火56℃30sec，延伸72℃30sec，此三步执行30个循环。实时定量RT-PCR使用DNA荧光染料试剂SYBR Green I程序为95℃5min；变性95℃10sec，退火及延伸62℃1min，此两步执行40个循环。半定量及定量的引物序列如表1所示。β-tubulin基因作为组成型表达的对照。

表1

RMS1803达载体的构建，拟南芥转化及荧光观察

根据TAIR数据库(www.arabidopsis.org)上拟南芥rms1803基因的genomic序列设计引物，以野生型DNA为模板，用于PCR扩增RMS1803基因的启动子和基因区域，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30sec；54℃退火50sec；72℃延伸240sec，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。回收PCR产物，用无缝克隆的方式将基因与1300-venus连接，转化大肠杆菌感受态，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒，测序确定序列无突变。将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，28℃培养2天。挑取农杆菌克隆挑在液体培养基中28℃培养2天，以菌液为模板进行PCR鉴定结果。

拟南芥转化：将培养4周大的材料去除其顶生花序，刺激侧枝花序的生长。转化前，将已授粉的花及果荚去除掉，并使土壤吸足水。把已转化了相应质粒的农杆菌菌种接入10mL LB培养基中过夜培养，转化前一天早上接入大瓶100mL LB培养至OD600约1.2到1.6之间，室温5000rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于等体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右。将植株浸没在渗透培养液中10sec，避光保存过夜，第二天移入恒温室培养。3-4周后，收种子并干燥2周。

转基因苗筛选：用70％酒精浸泡种子5分钟，用无菌水洗四次。均匀涂布在加入筛选潮霉素的PNS培养基平板上。低温4℃春化2-3天，移入恒温室培养，潮霉素抗性的转化子在萌发2周后通过对幼苗的发育来判断。取抗性幼苗的真叶组织进行遗传背景检测。

转基因荧光观察：取转基因材料的花序，在解剖镜下取出不同发育时间的花药，做水封片，用激光共聚焦显微镜，514激发，活体观察荧光信号，确定蛋白的时空表达。

糖信号染色方法

取半薄切片的材料(1-4μm厚度)，用KOH和甲醇脱掉树脂，然后将片子依次用60％，70％，80％，90％，100％酒精脱水，浸入PAS染液(100ml:1g碱性品红，1.8g偏亚硫酸氢钠，1ml盐酸，5g木炭)60℃染色1小时，70％酒精与流动水冲洗染过色的片子，荧光显微镜观察染色结果，有糖的部位会发出红色荧光。

在本发明中我们筛选到rms1803突变体，其T-DNA插在第一个外显子上，导致基因不能表达(如图1所示)，该基因编码一个糖转运蛋白，其介导了糖信号从细胞质到内质网的转运，进一步参与了蛋白糖基化的修饰。

不育突变体rms1803果荚短小，无种子产生(如图2所示)：花朵照片显示雄蕊发育异常，柱头上无花粉；进一步的亚历山大红染色发现，rms1803突变体花粉发育异常，无可育花粉产生。为了深入地了解花粉发育出现异常的具体时期，发明人对rms1803突变体花序进行固定并包埋，之后进行半薄切片，结果显示，与对照相比，rms1803突变体花粉发育在第8期开始出现异常，其中小孢子发生粘连、空泡化加大，绒毡层不规则，是导致雄性不育的主要原因(如图3所示)。经DAPI染色和着丝粒探针荧光标记原位杂交(FISH)比较分析发现，rms1803突变体减数分裂过程正常，且最后分裂形成4个小孢子(如图4所示)，说明rms1803基因突变后不影响减数分裂过程。扫描电镜结果显示，rms1803突变体花粉内陷，残留的花粉不正常，数目少，发生粘连(如图5所示)。时空表达分析发现，RMS1803-GFP融合蛋白在绒毡层和小孢子中都有分布(如图6所示)，即与糖类代谢有关的酶RMS1803在绒毡层和小孢子的碳水化合物代谢过程中扮演着关键作用，rms1803的突变导致花粉的淀粉积累受阻，进而造成花粉败育。本发明公开糖转运蛋白与育性发育的关系，可以利用该基因推广到其它物种不育系的制备中，同时也可以做为新的分子标记用于农业生产中。

附注：实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。常规无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，限制性内切酶购自Takara公司，引物由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，荧光PCR仪为美国ABI公司产品，激光共聚焦显微镜为BD公司。

上面结合实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 信阳师范学院

<120> 一种糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Thr Ala Asn Gly Ala Lys Ser Pro Ser Ser Met Gly Pro Lys

1 5 10 15

Val Leu Phe Tyr Ser Ile Leu Leu Thr Leu Gln Tyr Gly Ala Gln Pro

20 25 30

Leu Ile Ser Lys Arg Cys Ile Arg Lys Asp Val Ile Val Thr Ser Ser

35 40 45

Val Leu Thr Cys Glu Ile Val Lys Val Ile Cys Ala Leu Ile Leu Met

50 55 60

Ala Arg Asn Gly Ser Leu Lys Gly Leu Ala Lys Glu Trp Thr Leu Met

65 70 75 80

Gly Ser Leu Thr Ala Ser Gly Leu Pro Ala Ala Ile Tyr Ala Leu Gln

85 90 95

Asn Ser Leu Leu Gln Ile Ser Tyr Arg Ser Leu Asp Ser Leu Thr Phe

100 105 110

Ser Ile Leu Asn Gln Thr Lys Ile Phe Phe Thr Ala Phe Phe Thr Phe

115 120 125

Ile Ile Leu Arg Gln Lys Gln Ser Ile Leu Gln Ile Gly Ala Leu Cys

130 135 140

Leu Leu Ile Met Ala Ala Val Leu Leu Ser Val Gly Glu Gly Ser Asn

145 150 155 160

Lys Asp Ser Ser Gly Ile Asn Ala Asp Gln Lys Leu Phe Tyr Gly Ile

165 170 175

Ile Pro Val Leu Ala Ala Ser Val Leu Ser Gly Leu Ala Ser Ser Leu

180 185 190

Cys Gln Trp Ala Ser Gln Val Lys Lys His Ser Ser Tyr Leu Met Thr

195 200 205

Val Glu Met Ser Ile Val Gly Ser Leu Cys Leu Leu Val Ser Thr Leu

210 215 220

Lys Ser Pro Asp Gly Glu Ala Ile Lys Lys Tyr Gly Phe Phe His Gly

225 230 235 240

Trp Thr Ala Leu Thr Leu Val Pro Val Ile Ser Asn Ala Leu Gly Gly

245 250 255

Ile Leu Val Gly Leu Val Thr Ser His Ala Gly Gly Val Arg Lys Gly

260 265 270

Phe Val Ile Val Ser Ala Leu Leu Val Thr Ala Leu Leu Gln Phe Ala

275 280 285

Phe Glu Gly Lys Pro Pro Ser Ser Tyr Cys Leu Val Ala Leu Pro Leu

290 295 300

Val Met Ser Ser Ile Ser Met Tyr Gln Lys Tyr Pro Tyr Ile Asp Lys

305 310 315 320

Lys Lys Lys Lys Val

325

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgacgg ctaacggagc aaagagtccg tcgagtatgg gccctaaggt tttgttttat 60

tccatattgc tcacacttca gtacggagcc cagcctctga tctccaaacg ctgcatcaga 120

aaggatgtta ttgtaacttc atctgttttg acgtgcgaga ttgttaaggt catatgtgct 180

ctgattctca tggcaagaaa tggtagtttg aagggattag caaaagagtg gacgttgatg 240

ggatccttga cagcatcagg acttcctgca gccatatatg cactgcagaa cagtttgctg 300

cagatctcat acaggagtct tgattccttg acattttcaa ttctgaatca gacgaaaatc 360

tttttcacag cattctttac tttcataata ctaaggcaga agcaatcaat tctacaaata 420

ggagccttgt gtctattgat catggcagca gtccttctaa gtgttggtga aggctctaac 480

aaagattcaa gcggcattaa tgcggatcaa aagctgtttt atggaattat cccggtcttg 540

gcagcctctg tcctgtcggg tttagcctct tctctgtgtc aatgggcttc tcaggtcaag 600

aagcattcat catacttaat gacggttgaa atgtctatcg ttggaagcct ctgtttatta 660

gtaagtactc ttaaatctcc agatggtgaa gcgattaaaa aatatggctt ctttcatggt 720

tggactgctt taacactggt cccagtaata agcaatgctc ttggtgggat tcttgttggc 780

ctagttacat cacatgccgg tggtgtaaga aagggatttg tgattgtgtc ggcattactt 840

gtgacggcgc tacttcaatt tgcgtttgaa ggaaaaccgc catcatcgta ttgcctagtt 900

gctcttcctc ttgtgatgag tagtatctca atgtaccaga aatacccata cattgacaag 960

aagaagaaga aggtgtaa 978

Claims

1.一种糖转运蛋白，其特征在于，糖转运蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的。

2.编码权利要求1所述糖转运蛋白的基因RMS1803，如序列表中序列2所示的CDS序列。

3.权利要求1所述的糖转运蛋白或权利要求2所述的糖转运蛋白基因在调控植物雄性不育中的应用。

4.一种利用权利要求2所述的糖转运蛋白基因培育转基因植物的方法，其特征在于：抑制目的植物中权利要求2所述的糖转运蛋白基因的表达，得到雄性不育的转基因植物。

5.一种利用权利要求2所述的糖转运蛋白基因培育雄性不育植物的方法，其特征在于：抑制目的植物中权利要求2所述糖转运蛋白基因的表达，得到雄性不育植物。

6.根据权利要求5所述的培育雄性不育植物的方法，其特征在于，所述抑制糖转运蛋白基因表达的方式为：将T-DNA插在糖转运蛋白基因的第一个外显子上。