CN112083110A - 一种何首乌导致药物肝损伤标志物的筛选和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种何首乌导致药物肝损伤标志物的筛选和应用，包括采集何首乌导致药物性肝损伤病人、自身性免疫性肝病病人、乙型肝炎病人及正常健康人群的血清样本，运用LC‑MS血清代谢组学技术对样本信息进行分析，得到原始代谢指纹轮廓图，通过数据处理及挖掘从中筛选出潜在代谢标志物，将筛选得到的潜在标志物二维矩阵建立决策树模型，首次针对何首乌导致肝损伤具有较高诊断价值的标志物建立了可跨实验室的检测试剂盒，使得何首乌药物肝的诊断更加方便易行，为临床医生快速掌握患者病情，降低患者因再次服用何首乌导致肝损伤的几率，为进一步提高临床治疗效果奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤指一种何首乌导致药物肝损伤标志物的筛选和应用。
背景技术
药物性损伤是指在药物使用过程中，因药物本身或及其代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低所导致的肝脏损伤，亦称药物性肝病，临床上可表现为各种急慢性肝病，因此不易与自身性免疫肝病(以下简称自免肝)、乙型肝炎(以下简称乙肝)、酒精肝等肝病区分。药物性肝病患者轻者停药后可自行恢复，严重的需要进行肝移植，若不能及时诊断区分出药物肝损伤还可能导致患者再次服用药物从而引发再次打击，加重机体应答反应，危及生命。正是由于药物性肝病缺乏特异的临床指标，目前药物性肝损伤诊断的基本策略是一种排他性手段，即通过病人病史的回溯、血液生化检测、肝组织取样检测等多种手段对各种急慢性肝脏疾病进行区分，然而采取这样的策略不仅费时，且患者需承担的费用也很高，在临床实践中不切实际。
代谢组学(metabolomics)技术是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后一个新兴的组学领域，其主要研究对象是相对分子量在50-1000Da之间的内源性代谢小分子物质(来源于血清、尿液等)，基因和蛋白表达的微小变化会通过这些小分子物质得到放大。通过对这些代谢产物进行检测，分析其改变情况能够一定程度上揭示机体系统的生理及病理状态，反映疾病的客观变化规律。肝脏作为人体中最主要的代谢器官，承担着内源性物质的合成与外源性物质的代谢，药物对这些内源性物质影响可能会早于目前已有的肝病指标如转氨酶、总胆红素等。自2006年Clayton等人(Clayton,T A.et al.Pharmaco-metabonomicphenotyping and personalized drug treatment.Nature 440,1073–1077(2006).)首次将代谢组学技术能够应用于肝毒性研究开始，已有相关研究将代谢组学技术成功应用于临床药物性肝病研究，例如Winnike等(Winnike,J.H.,Li,Z.,Wright,F.A.,Macdonald,J.M.,O’Connell,T.M.&Watkins,P.B.Use of pharmaco-metabonomics for early predictionof acetaminopheninduced hepatotoxicity in humans.Clin.Pharmacol.Ther.88,5–51(2010).)和Phapale等(Phapale,P.B.et al.An integrative approach for identifyinga metabolicphenotype predictive of individualized pharmacokinetics of tacrolimus.Clin.Pharmacol.Ther.87,426–436(2010))都利用代谢组学手段对药物性肝病进行了研究。
代谢组学目前最为常用的分析方法有核磁共振波谱(NMR)和液质联用LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometer)。与NMR相比，LC-MS具有更高的灵敏度和分辨率优势，因此在代谢组学领域得到了越来越广泛的应用。
何首乌最为一种补益常用药，在广大人民群众中的得到广泛使用，然而近年来其导致肝损伤引发药物性肝病的问题日益突出，给临床安全性和合理用药带来了巨大挑战，损害患者健康、激化医患矛盾，同时很大程度上也加剧了外界对中药安全性的质疑，何首乌导致药物性肝病作为药物性肝病中重要组成部分已成为迫切需要解决的现实性命题，因此寻找特异敏感的临床诊断标志物具有重要的临床意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种何首乌导致药物肝损伤标志物的筛选和应用，该试剂盒能够有效的筛选出何首乌导致要乌肝损伤标志物，筛选出的标志物组合对首乌肝、自身免疫性肝炎、乙型肝炎的鉴别诊断具有较高的灵敏度与特异度，对于及早发现药物性肝病，采取正确的治疗策略，降低患者病情再激发风险有重要临床意义。
为了达到本发明目的，本发明首次提出了这三种物质的组合能够用于鉴别患者所得肝病为首乌肝，并且提供了一种质谱联用的试剂盒，通过反应改变血清中琥珀酸、硫酸对甲酚、1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(溶血磷脂(20:0/0:0))三种代谢物的存在形式，利用相应反应产物的极性变化，进而实现对目标物分离纯化，最后还原为原本的代谢物并用液相质谱检测。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1为负离子模式下QC样本的总离子流图；
图2首乌肝、自免肝、乙肝患者与正常组PCA得分图；
图3首乌肝与正常组PLS-DA得分图；
图4首乌肝与自免肝组PLS-DA得分图；
图5首乌肝与乙肝组PLS-DA得分图；
图6训练组诊断决策树模型(组合A,组合B)；
图7测试组诊断决策树模型；
图8使用试剂盒测试前后结果对比。
图9实施例5试验1至4实验结果对比。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
本发明依托解放军第302医院肝病平台，获得何首乌致肝病15例、自身免疫性肝炎15例、乙型肝炎29例患者共59例疾病组血清标本以及正常对照组15例的血清标本。诊断依据国际现行诊断标准。
实施例1
何首乌导致药物肝损伤诊断标志物的筛选
一、研究对象
在59例疾病组血清标本中，随机选择27例(10例首乌肝，17例非首乌肝)，作为训练组。非首乌肝包括了自免肝和乙肝，以及正常对照组的血清标本。
二、液质联用(LC-MS)的血清代谢组学检测
所有采集的血清样本离心后放于-80℃冰箱内保存，每个样品使用超高效液相色谱-质谱联用仪进行代谢组学检测，获得样本的包含色谱和质谱信息的原始代谢指纹图谱。具体操作如下：
2.1血清样本前处理
取冷冻储存的样本，室温解冻后涡旋震荡5s。分别去100μl样本加入300μl色谱级甲醇，涡旋震荡20s，静置于4℃环境中30min；完成所述操作后，将样本进行冷冻离心沉淀蛋白，取上清液200μl过0.22μm尼龙头滤膜后转入进样小瓶。
2.2血清LC-Q-TOF/MS检测
本实验的仪器分析平台为LC-Q-TOF/MS(1290infinity UHPLC，6550ifunnel Q-TOF/MS)分离色谱柱为ZORBAX SB 300C18(100mm×2.1，1.8μm)。进样顺序完全随机化，以排除进样顺序带来的偏差。色谱分离条件为：柱温：35℃；流速：0.3mL/min；流动相组成：A：水，B：乙腈；梯度洗脱：5.00％B at 0-1min；40％B at 1-9min；90％B at 9-19min；100％B at19-25min；其中B的百分含量为体积百分含量；进样量：4μl；整个检测过程中，保持进样器温度为4℃。
质谱条件：采用电喷雾离子源的负离子模式ESI-，毛细管电压为-3000V，喷嘴电压为-500V，喷嘴压力设置为45psig，干燥气温度为225℃，流速为11L/min。质荷比采集范围为80-1200Da。采集期间持续性的注入校正离子以获取高精度的信号。实验中所用试剂均为色谱纯，实验用水为去离子水，校正离子为三氟乙胺TFANH4、嘌呤Purine。得到各血清样本的原始代谢指纹图谱。
三、数据预处理
使用Aglient profinder软件对采集到的各样本原始代谢指纹图谱进行对齐，校准，相关参数设置为：保留时间窗为剔除噪音干扰后得到每行为分析样本，每列为代谢物信息的二维矩阵。经MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)进行数据标准化程序后用于下一步统计分析。
四、LC-MS实验质量控制
采用Agilent MassHunter工作站对采集到的质量控制样品总离子流(TIC)进行可视化检查，通过重叠多个质量控制样本图谱，直观的判断仪器分析样本是否符合代谢组学分析要求，即稳定性与重复性考察，如图1所示。说明样本检查过程中的质量控制情况良好，所获得的代谢组学数据真实可信。
实施例2
一、PCA整体分析
将所获得的代谢组学数据使用无监督的分析方法(principal componentanalysis即主成分分析，PCA)来初步观察不同疾病组之间的分类趋势和离群点，如图2。从图2中可以看出，乙肝与首乌肝和自免肝及正常组良好的分离，而首乌肝与正常及自免肝组有一定分类趋势，但仍有部分交叉，需采用有监督的学习方法进行进一步的分析。
二、偏最小二乘判断分析(PLS-DA分析)
通过主成分分析后，将原始矩阵重新分配为三组，即：首乌肝-正常(A)、首乌肝-自免肝组(B)、首乌肝-乙肝(C)，分别建立相应的三个PLS-DA模型。模型的参数R2Y表示解释率，Q2表示模型的预测率，一般以Q2大于0.4即表示此模型可靠。A、B、C三组模型的参数分别为首乌R2Y＝0.509，Q2＝0.791；R2Y＝0.385，Q2＝0.696；R2Y＝0.262，Q2＝0.787，相应的PLS-DA得分图如图3-5。
由图3、4、5可知,图中各自两组样本在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)获得明显的区分，有分离的趋势。说明正常组、首乌肝组、自免肝和乙肝的血液内源性代谢指纹存在显著的差异。
实施例3
一、代谢物的挖掘及鉴定
为筛选出潜在标志物，采用变量重要性评分和单变量的非参数检验进行差异代谢物筛选，采用VIP(Variable Importance in the Projection)值大于1，并结合t检验P值小于0.05作为筛选标准。潜在标志物的定性方法为：搜索Metlin数据库(https://metlin.scripps.edu/index.php)和HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)中化合信息进行比对，通过比较准分子离子、加合物及同位素信息获得潜在的代谢标志物。结果如表1所示。
表1鉴定得到的差异性代谢物
a:与正常组比较，b:与首乌肝比较；(↑)呈上升趋势(↓)呈下降趋势；
二、决策树模型的建立与筛选
采用SPSS 22.0软件，绘制决策树的具体操作如下：将上述筛选得到标志物二维矩阵数据导入SPSS 22.0软件，参数设置，父节点:4，子节点：2，增长法为CART(Classification and regression tree)，验证方式为拆分样本法，其余参数为默认值。结果如图6。
图6中可以看出通过第一个节点硫酸对甲酚可以诊断9个非首乌肝患者，通过第二个节点1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺可以诊断5个非首乌肝患者，通过第三个节点琥珀酸可以诊断2个非首乌肝患者，最终余下11个患者判断为首乌肝患者，其中1名患者为假阳性。
图7中可以看出通过第一个节点尿酸-3-核糖核苷可以诊断7个非首乌肝患者，通过第二个节点脑啡肽可以诊断3个首乌肝患者，且其中1名患者为假阳性，通过第三个节点二氢蝶酸可以诊断5个非首乌肝患者，且其中1名患者为假阳性，最终余下12个患者判断为首乌肝患者，其中4名患者为假阳性。
三、结论
通过决策树分析，比较潜在标志物的各种组合后得出结论，，以甲酚硫酸盐、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺作为标志物模型可使首乌肝患者诊断的准确率最高，故测试组每个血清样本经LC-MS血清代谢组学技术分析后，获取硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺标志物的提取离子流的(Extract ion chromatogram，EIC)峰面积来建立诊断标准，具体的诊断标志物为硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
以标志物的提取离子流峰面积平均值或相对含量为诊断标准，其中按顺序首先硫酸对甲酚>600264.038，其次1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺≤838206.149，最后琥珀酸≤1129993.184；
或者按顺序首先对比硫酸对甲酚含量大于正常值的0.201倍，其次对比1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺含量小于等于正常值的2.024倍，最后比较琥珀酸含量小于等于正常值2.194倍，则能够判断患者所患肝病为何首乌肝损伤。
实施例4
对59例临床血清样本中除实施例3已经检测过的27例样本，对剩余32例临床血清样本按照如下步骤进行分析，验证诊断标志物及诊断标准的准确性：
第一步，血清样本经液质联用血清代谢组学技术分析以及ProFinder提取后，获取硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺标志物的提取离子流的峰面积平均值；
第二步，根据诊断标准判断峰面积是否符合诊断标准，对实施例3中的所述何首乌肝损伤的诊断标准进行验证。
在训练组27例样本中，11例符合首乌肝标志物诊断标准，真阳性10例，假阳性1例，真阴型16例。验证组32例样本结果如图8所示，可以看出通过第一个节点硫酸对甲酚可以诊断17个非首乌肝患者，通过第二个节点1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺可以诊断3个首乌肝患者，通过第三个节点琥珀酸可以诊断10个非首乌肝患者，且其中4名患者为假阳性，最终余下2个患者判断为首乌肝患者，其中1名患者为假阳性。诊断结果的灵敏度和特异性为100％和94.1％。
实施例5：血清前处理试剂盒
一、实验原理：
通过化学反应改变血清中琥珀酸、硫酸对甲酚、1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三种代谢物的存在形式，利用相应反应产物的极性变化，进而对目标物分离纯化，最后还原为原本的代谢物并用液相质谱检测。
二、何首乌鉴别诊断质谱前处理试剂盒组成：
试剂A质谱级乙腈20毫升
试剂B氯仿：甲醇(体积比9:1)
试剂C乙醇和乙酸乙酯
试剂D氢氧化钠
试剂E乙酸
试剂F甲基橙
试剂G盐酸
试剂H 75％质谱级乙腈(每毫升含1毫克4-氯苯丙氨酸)
三、试剂准备：
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
四、样本处理及要求：
1.取100微升血样，加入300微升试剂A，涡旋60秒，低温离心机4℃，14000转离心20分钟。
2.取步骤1上清，加400微升试剂B，涡旋30秒，14000转离,15分钟，上下层液体分别保留，下层液体为标液体1。
3.步骤2上层液体加200微升试剂C，涡旋30秒，水浴加热55℃，20分钟后加入乙酸乙酯300微升，涡旋30秒，下层液体标为液体2。
4.取步骤3上层液体，加500微升试剂D，混匀，加500微升试剂E，混匀，静置，分层后取下层液体加50微升试剂F，混匀后液体显黄色，不断滴加试剂G至液体颜色显红色，标为液体3。
5.混合液体1、液体2、液体3，真空干燥3小时，用400微升75％试剂H溶解。
6.用液相质谱联用技术检测样品。
7.通过内标物4-氯苯丙氨酸的峰面积对琥珀酸、硫酸对甲酚、1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三种代谢物的峰面积进行校正。
五、需要而未提供的试剂和器材：
1.低温离心机
2.高精度加样器及枪头：20-200uL、200-1000uL
3.水浴锅
4.真空干燥机
5.涡旋仪
六、注意事项：
严格按照规定的时间和温度进行操作以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即4℃冷藏保存试剂。
七、试剂盒检测结果对比
从59例患者的临床血清样本中随机选取10个样本混合均匀，分别按照实施例1中所述方法处理血清样本记为实验1，按照实施例5中方法处理血清样本记为实验2，并且在另一个实验室的液相质谱上重复上述两种方法分别记为实验3和实验4。实验结果如图9所述，通过实验1和实验2的结果比较，实验3和实验4的结果比较可以看出试剂盒处理后三种目标代谢物在质谱中的峰面积显著提高；通过比较实验1和实验3的结果，可以发现实施例1中的血清处理方法在不同实验室检测的峰面积和组内误差波动较大，相反的，按照实施例5的血清处理方法得到的实验2和实验4的数据其峰面积和误差棒与相同环境下按实施例1的方法得到的数据比较，误差棒的范围减小，峰面积的强度增高，即数据质量得到显著提升。
由以上内容可以得出，本专利申请所保护的何首乌导致药物肝损伤诊断标志物筛选方法及诊断标志物的试剂盒其灵敏度和特异性均高于目前现有的检测技术。临床上不同肝病存在一定的相似性，对其准确诊断造成干扰，其中以自免肝与药物性肝损伤为代表。本发明提出以三种生物标志物组合的方法构建了何首乌导致药物性肝损伤的鉴别诊断模型，对临床鉴别不同肝病有重要意义。
除此之外，为了加快效率，可以同时采集多人的血清样本进行编号，将多个样本一次性进行LC-MS检测、图谱处理，PLS-DA分析，标志物筛选，代谢物的挖掘鉴定。
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但发明的保护范围仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (10)
1.硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤标志物中的应用。
2.根据权利要求1所述的硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤标志物中的应用，其中，所述硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺在应用前还需进行前处理操作。
3.根据权利要求2所述的硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤标志物中的应用，其中，所述前处理操作使用前处理试剂盒，前处理试剂盒包含下列组分：乙腈、氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸、甲基橙、盐酸和4-氯苯丙氨酸。
4.硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤诊断试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤诊断试剂盒中的应用，其中，所述硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺在应用前还需进行前处理操作。
6.根据权利要求5所述的硫酸对甲酚、琥珀酸及1-花生四烯酸-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺联合用于制备何首乌导致药物肝损伤诊断试剂盒中的应用，其中，所述前处理操作使用前处理试剂盒，前处理试剂盒包含下列组分：乙腈、氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸、甲基橙、盐酸和4-氯苯丙氨酸。
7.一种何首乌导致药物肝损伤诊断标志物的筛选方法，其中，包括以下步骤，
1)收集何首乌导致药物肝损伤病人以及其他肝病病人人群的血清样本，其他肝病为自身免疫性肝病和乙型肝炎病；
2)建立各血清样本的代谢物信息的二维矩阵，筛选出差异代谢物，建立偏最小二乘判断分析模型；
3)验证差异代谢物与何首乌药物肝损伤的关系，获得潜在标志物；
4)将潜在标志物进行决策树分析，确定何首乌药物肝损伤诊断标志物。
8.根据权利要求7所述的何首乌导致药物肝损伤诊断标志物的筛选方法，其中，步骤2)包含如下步骤：
a)将步骤1)中获得的每个血清样本采用液质联用血清代谢组学技术进行分析，得到各血清样本的原始代谢指纹图谱；
b)使用Aglient profinder软件对采集到的各样本原始代谢指纹图谱进行对齐，校准，剔除噪音干扰后得到每行为分析样本，每列为代谢物信息的二维矩阵，用于后续统计分析；
c)将步骤b)中得到的二维矩阵经MetaboAnalyst3.0进行数据标准化程序，后依次进行主成分分析和偏最小二乘判别分析，分别得到何首乌肝损伤-自生免疫性肝病与何首乌肝损伤-乙型肝炎病偏最小二乘判断分析模型。
9.根据权利要求7或8所述的何首乌导致药物肝损伤诊断标志物的筛选方法，其中，步骤3)验证差异代谢物与何首乌药物肝损伤的关系，包含以下步骤：
根据步骤2)中得到的差异代谢物的偏最小二乘判断分析模型，采用偏最小二乘判断分析建模的变量重要性评分和单变量的非参数检验进行差异代谢物筛选，筛选标准为：VIP≥1，p<0.05，筛选出潜在的代谢标志物，之后将获得的潜在标志物，导入SPSS22.0软件进行决策树分析，得到一组何首乌肝损伤诊断标志物组合。
10.根据权利要求9所述的何首乌导致药物肝损伤诊断标志物的筛选方法，其中，所述决策树的参数设置为父节点：4，子节点：2；增长法为CART(Classification andregression tree)，验证方式为拆分样本法，其余参数为默认值。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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