CN113380342A - 基于mrp2/3的何首乌中肝毒性化合物的快速筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于计算机分子对接技术的何首乌中肝毒性化合物的筛选方法，其包括以下步骤：(1)获得何首乌中至少一种待检化合物的三维化学结构；(2)获得MRP2、MRP3的蛋白同源模建结构，并分别确定MRP2和MRP3的活性位点；(3)将所述待检化合物、具有MRP2抑制效应的阳性化合物1、具有MRP3抑制效应的阳性化合物2分别与所述活性位点进行计算机分子对接，获得对接打分；(4)所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：所述待检化合物的对接打分达到对接判定值。本发明的筛选方法快速、经济，操作简单，而且可实现众多化合物的高通量筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种何首乌中肝毒性化合物的快速筛选方法，具体涉及基于分子对接技术的、以多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)或多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associated protein 3，MRP3)为作用靶点的何首乌中肝毒性化合物的筛选方法。
背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，具有补肝肾、益精血、乌须发的功效，是历代医家广为推崇的补益药和抗衰老药，其临床应用非常广泛，但近年来有关何首乌其毒性问题逐渐凸显，国家食品药品监督管理局(SFDA)不良反应监测中心近几年收集到何首乌制剂(涉及1000多种)的不良反应报告超过2万份，肝功能损害是其主要的不良反应。何首乌引发的药物性肝损伤占全部药物肝损害病例的1.06％(排名第15位)，占全部中药肝损害病例5.69％(排名第1位)。
何首乌成分众多，主要包括蒽醌类、二苯乙烯类、磷脂类、鞣质类、酚类、甾醇类等化合物等，但其中的肝毒性成分不明确，通过化学成分分析方法并不能有效地表征何首乌的肝毒性。因此，需要明确其肝毒性物质，指导临床安全、合理用药。
已经报道的何首乌中肝毒性成分的筛选方法主要采用体外细胞或微组织实验、或者动物实验。杨敏等(何首乌肝毒性物质基础探索研究[J].中国中药杂志,2016,41(7):1289-1296.DOI:10.4268/cjcmm20160721.)报道了运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及萘类共11个单体成分对Hep G2细胞的毒性，将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养后制备肝组织匀浆，通过BCA法测定匀浆液中蛋白含量对细胞毒成分进行验证，以考察这些成分对肝组织的毒性作用。卫培峰等(制首乌不同成分诱导肝细胞凋亡与肿瘤坏死因子α的相关性研究，四川中医，2009,27(10):47)报道了用制首乌、大黄酸、大黄素、大黄酚对大鼠灌胃给药3个月，检测出TNF-α与制首乌不同成分引发大鼠肝脏细胞凋亡有相关性。采用体外细胞、微组织实验的筛选方法存在肝毒性成分靶点不明确的问题，采用动物实验的筛选方法存在耗时长、费用高等问题。因此，提供一种快速且准确的用于筛选何首乌中肝毒性分子的方法是本领域亟待解决的问题。
多药耐药相关蛋白(MRP)是多药耐药(MDR)形成机制之一，其主要参与细胞内外多种复合物的转运；调整细胞内物质的分布；作为转运泵参与物质转运在多种癌症中都有表达。MRP蛋白家族由9个成员组成(MRP1，MRP2，MRP3，MRP4，MRP5，MRP6，MRP7，MRP8，MRP9)。MRP2主要在人体肝细胞基底膜上表达，在肾近曲小管的上皮细胞等极性细胞的顶膜上也有表达。它能在阻塞性黄疸中调节肝细胞的损伤，作用机制包括：①参与细胞内外多种毒性复合物的转运，调节机体大部分酸性配基的分泌(如葡萄糖醛酸、硫酸盐、谷胱甘肽等)，结合体内内外源性的毒性物质，保护机体免受毒性阴离子的伤害。②参与调整细胞内物质的重分布，保护细胞。当MRP2过表达的细胞受到有害物侵袭时，MRP2能将毒素和有害药物转运到膜囊泡起到屏障作用，从而使机体细胞免受伤害。③MRP2是胆汁流的重要推动力，能促进胆汁的分泌，增加胆汁酸盐的脂溶性。有研究者发现脂溶性的胆盐可以增加脂质过氧化从而诱导血管的舒张效应，减少肝脏的损伤。④MRP2表达下调时引起炎症细胞因子过度释放，进而造成肝脏损伤。炎症细胞因子如IL-1也可抑制肝细胞外调节激酶使MRP表达下调，从而形成恶性循环。MRP2还是胆红素的主要转运子，主要负责胆红素和其他胆汁成分的排泄，如果先天或后天原因引起MRP2表达或功能损伤，将引起胆红素排泄障碍。除此之外，MRP2缺乏还会引起Dubin-Johnson综合征。人Dubin-Johnson综合征、动物模型和RT-突变兔都是缺乏MRP2而表现出的高胆红素血症。MRP2还和胆囊结石的形成相关。在胆固醇结石患者的肝细胞中，MRP2的表达是低于正常人群的。MRP3主要在肝、结肠、小肠和肾上腺组织中表达，在其他一些组织中也有低水平表达。MRP3是一种有机阴离子转运蛋白，不同于MRP1和MRP2，它和葡萄糖醛酸共轭化合物的亲和力较高而和谷胱甘肽共轭化合物的亲和力较差，并可以通过肠上皮细胞囊小泡转运甲氨蝶呤。有研究发现肝门胆管细胞癌化疗药物阿霉素、吡柔比星的半抑制浓度与MRP3的表达相互关联，因此MRP3的表达可能影响某些化疗药物的耐药。而且MRP可能在胆汁酸盐的循环中起重要的作用。此外，MRP3还参与调节旁细胞和细胞的溶解物在血液、胆汁中的运动。
分子对接技术主要应用于药物分子设计领域，是基于计算机科学，通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用,并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。同时，分子对接也可用于预测小分子之间的结合。通过对肽库中多肽的结构进行模拟，预测其与对应目标分子结合的方法可以节省大量的在肽适体筛选过程中的人力物力消耗，避免筛选过程中的有毒试剂对实验人员的危害，极大的提高筛选效率和肽库容量带来的限制等问题。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明提供了一种基于计算机分子对接技术的何首乌中肝毒性化合物的筛选方法，其包括以下步骤：(1)获得何首乌中至少一种待检化合物的三维化学结构；(2)获得MRP2、MRP3的蛋白同源模建结构，并分别确定MRP2和MRP3的活性位点；(3)将所述待检化合物、具有MRP2抑制效应的阳性化合物1、具有MRP3抑制效应的阳性化合物2分别与所述活性位点进行计算机分子对接，获得对接打分；(4)所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：所述待检化合物的对接打分达到对接判定值。
在一些实施方案中，步骤(1)还包括对所述待检化合物进行预处理的步骤，所述预处理包括三维结构生成、结构优化、和/或删除重复结构。
在一些实施方案中，采用Discovery Studio2.5软件对所述待检化合物进行预处理。
在一些实施方案中，所述待检化合物的化学结构通过文献检索获得。
在一些实施方案中，所述待检化合物可以是何首乌中的至少1种、至少10种、至少100种或者全部成分化合物。
在一些实施方案中，步骤(2)还包括所述同源模建结构进行预处理的步骤，所述预处理包括结构优化、和/或质子化。
在一些实施方案中，所述同源模建结构通过文献检索获得MRP2、MRP3同源模建结构，例如PDB数据库中编号为6uy0的同源模建结构。
在一些实施方案中，识别活性位点的方法选自：文献或数据库调研法、实验筛查法和软件预测法。
在一些实施方案中，可通过文献调研，从他人/前人的实验结果中获悉该蛋白的主要功能和所属家族，找到它的活性位点信息。例如，MRP2的半径为
位点的三维坐标位置为157.158707，176.372707，163.243586，其关键氨基酸残基为LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261；MRP3的半径为
位点的三维坐标位置为171.206066，173.948148，165.653377，其关键氨基酸残基为GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245。通过对已有较多研究的其他种属的同源蛋白进行比较研究，找到对应的口袋信息。UniprotKB数据库(https://www.uniprot.org/)整合了丰富的蛋白结构-功能信息，有的还包含突变位点信息。
在一些实施方案中，实验筛查法包括定点突变法和荧光探针标记法。
在一些实施方案中，MRP2、MRP3的活性位点(又称为活性口袋)可以通过计算方法预测，预测口袋的软件包括但不限于：Fpocket、POCASA。
在一些实施方案中，MRP2活性位点根据关键氨基酸位点LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261定义。
在一些实施方案中，MRP3活性位点根据关键氨基酸位点GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245定义。
在一些实施方案中，所述MRP2活性位点定义为：半径为
位点的三维坐标位置为157.158707，176.372707，163.243586。
在一些实施方案中，所述MRP3活性位点定义为：半径为
位点的三维坐标位置为171.206066，173.948148，165.653377。
在一些实施方案中，计算机分子对接通过选自以下的软件进行：Dock、Autodock、LibDock、FlexX、Glide、GOLD、MOE Dock、Surflex-Dock和LigandFit，优选LibDock。
在一些实施方案中，分子对接的方法选自刚性对接、半柔性对接和柔性对接，优选刚性对接。
在一些实施方案中，分子对接的算法包括但不限于：匹配算法、蒙特卡洛模拟和遗传算法、集成对接。
在一些实施方案中，对接打分通过打分函数计算得出。打分函数包括但不限于：基于力场的打分函数、基于先验知识的打分函数、基于经验的打分函数。
在一些实施方案中，步骤(4)中所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
在一些实施方案中，所述具有MRP2抑制效应的阳性化合物1是吲哚美辛或胆红素；所述具有MRP3抑制效应的阳性化合物2是伊马替尼或胆红素。
在一些实施方案中，当所述阳性化合物1是吲哚美辛或胆红素时，所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％。
在一些实施方案中，当所述阳性化合物2是伊马替尼或胆红素时，所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％。
在一些实施方案中，本发明的基于计算机分子对接技术的何首乌中肝毒性化合物的筛选方法包括以下步骤：(1)获得何首乌中至少一种待检化合物的三维化学结构；(2)获得MRP2、MRP3的蛋白同源模建结构，并分别确定MRP2和MRP3的活性位点；(3)通过Libdock软件将所述待检化合物、具有MRP2抑制效应的吲哚美辛、具有MRP3抑制效应的伊马替尼分别与所述活性位点进行计算机分子对接，获得对接打分；(4)所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP2结合，则对接打分达到至少56；若所述待检化合物与MRP3结合，则对接打分达到至少98；
当采用LibDock软件进行分子对接且所述阳性化合物1是胆红素、阳性化合物2是胆红素时，所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP2结合，则对接打分达到至少125或至少133；若所述待检化合物与MRP3结合，则对接打分至少达到123或至少130。
在一些实施方案中，待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP2结合，则对接打分达到至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、或至少130；
在一些实施方案中，待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP3结合，则对接打分达到至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125或至少130。
在一些实施方案中，所述方法还包含：(5)检验步骤，例如通过肝细胞毒性筛选模型检验判定为肝毒性化合物的肝毒性是否与步骤(4)的判断一致。
在一些实施方案中，所述肝细胞毒性筛选模型是HepaRG细胞。
在一些实施方案中，所述肝毒性通过HepaRG细胞存活率的IC50表征。
在一些实施方案中，按如下公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(A给药组－A空白对照组)/(A溶媒对照组－A空白对照组)×100％。
本发明提出的何首乌中肝毒性化合物的快速筛选方法至少实现了以下有益效果之一：
本发明首次提出了针对FXR靶点开展何首乌中肝毒性成分研究的思路，通过将MRP2/3抑制与肝毒性相关联，选择以MRP2/3为靶点，并采用计算机分子对接技术高通量筛选何首乌中具有MRP2/3抑制活性的成分，并根据对接打分直接判断其肝毒性，从而实现了何首乌中肝毒性化合物有针对性的和快速有效的筛选，特别适合用于药物的早期毒性筛选，相较于传统的体外细胞/组织实验或者动物实验，大大节省了时间、减少了人力和物力投入；
MRP2活性位点：半径
位点的三维坐标位置(157.158707，176.372707，163.243586)和MRP3活性位点：半径
位点的三维坐标位置为(171.206066，173.948148，165.653377)准确性和可重复性好，可准确地将对接打分与肝毒性相关联，能直接有效地预测药物的潜在用药风险，为中药安全性评价提供了新的思路；
本发明的筛选方法快速、经济，操作简单，而且可实现众多化合物的高通量筛选。
附图说明
图1显示了阳性化合物1吲哚美辛的肝细胞毒性考察结果。
图2显示了阳性化合物2伊马替尼的肝细胞毒性考察结果。
图3显示了芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷的肝细胞毒性考察结果。
图4显示了大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的肝细胞毒性考察结果。
图5显示了反式二苯乙烯苷(TSG)的肝细胞毒性考察结果。
图6显示了大黄素的肝细胞毒性考察结果。
图7显示了阳性化合物胆红素的肝细胞毒性考察结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。
除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。
本发明中，分子对接就是把配体分子放在受体活性位点的位置，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用好坏，并找到两个分子之间最佳的结合模式。
分子对接方法包括：(1)刚性对接：刚性对接方法在计算过程中，参与对接的分子构像不发生变化，仅改变分子的空间位置与姿态，刚性对接方法的简化程度最高，计算量相对较小，适合于处理大分子之间的对接；(2)半柔性对接：半柔性对接方法允许对接过程中小分子构像发生一定程度的变化，但通常会固定大分子的构像，另外小分子构像的调整也可能受到一定程度的限制，如固定某些非关键部位的键长、键角等，半柔性对接方法兼顾计算量与模型的预测能力，是应用比较广泛的对接方法之一；(3)柔性对接：柔性对接方法在对接过程中允许研究体系的构像发生自由变化，由于变量随着体系的原子数呈几何级数增长，因此柔性对接方法的计算量非常大，消耗计算机时很多，适合精确考察分子间识别情况。
可用于本发明的分子对接的软件包括但不限于：Dock、Autodock、LibDock、FlexX、Glide、GOLD、MOE Dock、Surflex-Dock和LigandFit。
Dock是应用最广泛的分子对接软件之一，由Kuntz课题组开发。Dock应用半柔性对接方法，固定小分子的键长和键角，将小分子配体拆分成若干刚性片断，根据受体表面的几何性质，将小分子的刚性片断重新组合，进行构像搜索。在能量计算方面，Dock考虑了静电相互作用、范德华力等非键相互作用，在进行构像搜索的过程中搜索体系势能面。最终软件以能量打分和原子接触罚分之和作为对接结果的评价依据。
Autodock是另外一个应用广泛的分子对接程序，由Olson科研组开发。AutoDock应用半柔性对接方法，允许小分子的构像发生变化，以结合自由能作为评价对接结果的依据。自从AutoDock3.0版本以后，对能量的优化采用拉马克遗传算法(LGA)，LGA将遗传算法与局部搜索方法相结合，以遗传算法迅速搜索势能面，用局部搜索方法对势能面进行精细的优化。
FlexX是德国国家信息技术研究中心生物信息学算法和科学计算研究室开发的分子对接软件，已经作为分子设计软件包BioSolveIT LeadIT的一个模块实现商业化。FlexX使用碎片生长的方法寻找最佳构像，根据对接自由能的数值选择最佳构像。FlexX程序对接速度快效率高，可以用于小分子数据库的虚拟筛选。
LibDock也是一种快速的分子对接工具，适用于对大规模数据库进行快速精确的虚拟筛选。LibDock根据小分子构象与受体相互作用热区匹配的原理将这些构象刚性对接到受体的结合口袋当中，其最大的优势在于速度快，可以并行运算，适合于进行大规模虚拟筛选。LibDock基于受体结合位点的结构特征而进行对接，首先要计算表征受体位点特征的热区，产生配体多构象后进行对接。热区分为两种类型“极性热区”和“非极性热区”，“极性热区”表示可以匹配配体分子中可以形成氢键的原子，“非极性热区”表示可以匹配配体分子中的非极性原子。具体步骤如下：(1)产生小分子构象集：LibDock可以把每个配体的多个构象与受体进行对接，可以使用多种方法来产生配体的构象用于对接，也可以在LibDock对接之前产生配体构象，如果输入的配体结构已经包含多构象，那么在LibDock过程中就不需要在产生构象了；(2)定义蛋白活性部位：可直接从DS界面导入或本地存储可从文件中打开蛋白结构，定义蛋白活性位点；(3)产生热区及对接结果；(4)结果分析：可依次查看每个配体构象的对接结构，按照LibDockScore进行排序。
对接打分通过打分函数计算得出，常用的打分函数主要分为三类：其一是基于力场的打分函数，它涵盖了范德华力、静电力、氢键力等相互作用，根据第一性原理从头模拟计算分子的结合能；其二是基于先验知识的打分函数，它利用现有数据库中已知的结构数据及其结合能来产生一些简化的系数项来逼近复杂的物理作用，例如建立所有原子类型成对的结合能系数并求和作为结合能的近似；其三是基于经验的打分函数，它整合了基于力场的和基于先验知识的打分函数，既包括了一些力场的物理参数，同时也设定诸如疏水性作用、去溶剂化作用等参数，这些参数可以通过现有已知数据来进行回归拟合。
实施例1计算机分子对接筛选肝毒性化合物
通过文献及数据库检索收集何首乌主要成分，共得到49个分子，采用DiscoveryStudio2.5对这些分子进行预处理，预处理主要包括以下操作：三维结构生成、结构优化、删除重复结构，获得49个分子的化学结构，基于这些结构构建配体库并以此进行后续的虚拟筛选。
以“MRP2”、“MRP3”为关键词搜索Swiss-model数据库，并根据筛选规则获得一个同源模建结构，MRP2及MRP3的模板PDB编号为6uy0。根据文献[1-2]记录的氨基酸残基定义活性位点，MRP2的半径为
位点的三维坐标位置为157.158707，176.372707，163.243586，其关键氨基酸残基为LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261；MRP3的半径为
位点的三维坐标位置为171.206066，173.948148，165.653377，其关键氨基酸残基为GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245。选择文献[3-5]中记载的具有MRP2/MRP3抑制效应的阳性化合物吲哚美辛(MRP2抑制剂)、伊马替尼(MRP3抑制剂)、胆红素(MRP2/3共抑制剂)进行初步对接。其肝细胞毒性IC50及对接打分如表1所示。
表1 MRP2/MRP3抑制剂对接打分
通过以下四个公式之一计算对接打分与吲哚美辛和伊马替尼IC50的皮尔森相关系数，相关性大于0.6，可见MRP2/MRP3抑制剂活性IC50与对接打分呈线性关系，所定义的活性位点具有准确性。
公式一：
公式二：
公式三：
公式四：
以上列出的四个公式等价，其中E是数学期望，cov表示协方差，N表示变量取值得个数。
经过对接之后，何首乌总成分的对接结果如表2、3所示(其中，35个目标成分无法与MRP2结合，26个目标成分无法与MRP3结合)。以两个阳性化合物为参照，选取其对接打分(libdoc score)的80％数值作为参照，规定抑制剂潜在化合物得分应不低于56.8705(MRP2)和98.2808(MRP3)。
由实验结果可知，大黄素-6-O-β-D葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷，反式二苯乙烯苷，大黄酸-8-O-葡萄糖苷明显高于吲哚美辛对接打分80％的化合物可以被认定为MRP2抑制剂的潜在化合物；大黄素-6-O-β-D葡萄糖苷，大黄酚-8-O-葡萄糖苷，大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷等明显高于伊马替尼对接打分80％的化合物可以被认定为MRP3抑制剂的潜在化合物。
采用胆红素作为阳性对照化合物时，选取其对接打分(libdoc score)的85％数值作为参照，规定抑制剂潜在化合物得分应不低于133.43(MRP2)和130.47(MRP3)。大黄素-6-O-β-D葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷明显高于胆红素对接打分85％的化合物可以被认定为MRP2抑制剂的潜在化合物；大黄素-6-O-β-D葡萄糖苷，大黄酚-8-O-葡萄糖苷，大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷等明显高于胆红素对接打分85％的化合物可以被认定为MRP3抑制剂的潜在化合物。
表2何首乌成分与MRP2对接结果
| 化合物 | 对接打分 |
| 大黄素-6-O-β-D葡萄糖苷 | 139.643 |
| 大黄素甲醚-8-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷 | 137.405 |
| 反式二苯乙烯苷 | 126.311 |
| 大黄酸-8-O-葡萄糖苷 | 124.099 |
| 虎杖苷 | 123.022 |
| 大黄酚-8-O-葡萄糖苷 | 118.936 |
| 大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷 | 118.936 |
| 大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷 | 117.792 |
| 大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷 | 95.2464 |
| Emodin 1-O-beta-D-glucoside | 95.1051 |
| 2-乙酰基大黄素 | 93.7326 |
| 白藜芦醇 | 72.7515 |
| 芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷 | 61.0121 |
| 大黄素 | 53.3076 |
表3何首乌成分与MRP3对接结果
实施例2肝细胞毒性考察
为进一步验证实施例1方法的准确性以及MRP2/3抑制与肝毒性之间的相关性，本实施例进行了肝细胞毒性考察。
对数生长期的HepaRG细胞经消化后，调整至5×104个/mL，于96孔板中每孔接种约5000个细胞，孵育18～24h后给药。分设空白对照组(不含HepaRG细胞)，溶媒对照组(0.5％DMSO)，阳性对照组(MRP2/MRP3抑制剂)及不同浓度的目标化合物给药组。首先根据化合物在溶媒中的溶解度开展预实验，初步确定各目标化合物的浓度范围，再根据预试验结果进一步开展毒性试验，确定半抑制浓度(IC50)。不同化合物的处理浓度范围如下：
胆红素的浓度范围为0、0.04、0.1、0.3、1和3μg/mL；吲哚美辛的浓度范围为0、0.04、0.1、0.3、1和3μg/mL；伊马替尼的浓度范围为0、0.04、0.1、0.3、1和3μg/mL；芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷的浓度范围为0、0.3、1、3、9和27μg/mL；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的浓度范围为0、4、13、40、120和360μg/mL；反式二苯乙烯苷的浓度范围为0、4、13、40、120和360μg/mL；大黄素的浓度范围为0、4、13、40、120和360μg/mL。体系于37℃，5％CO2条件下孵育24h后，每孔加入10μL细胞计数试剂盒法(CCK-8)检测试剂，37℃避光孵育2h后采用酶标仪检测各孔450nm波长处的吸光度值，按公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(A给药组－A空白对照组)/(A溶媒对照组－A空白对照组)×100％，并根据细胞存活率计算IC50。
分别选择MRP2受体抑制剂吲哚美辛，MRP2受体抑制剂伊马替尼为阳性对照，另选取何首乌中含量较高，同时具有代表性的目标化合物芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷(MRP2对接打分值61.0121，MRP3对接打分值125.003)，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(MRP2对接打分值118.936，MRP3对接打分值132.315)，反式二苯乙烯苷(MRP2对接打分值126.311，MRP3对接打分值103.965)和大黄素-6-O-β-D-葡萄糖苷(MRP2对接打分值139.643，MRP3对接打分值134.325)进行体外毒性验证实验。结果见表4，图1-6。
由实验结果可知，MRP2抑制剂阳性对照IC50值为2.51μM或10.51μM，MRP3抑制剂阳性对照IC50值为2.51μM或12.25μM，肝细胞毒性显著。分子对接实验中对接打分高于对接判定值133.43(MRP2)和130.47(MRP3)的芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷均表现较明显的肝细胞毒性趋势，而对接打分较低的大黄素肝细胞毒性较小。
表4肝细胞毒性结果
上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
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5.Pavlo V.Zadorozhnii,Vadym V.Kiselev,Aleksandr V.Kharchenko.Insilicotoxicity evaluation of Salubrinal and its analogues[J].European Journalof Pharmaceutical Sciences 155(2020).
Claims (10)
1.一种基于计算机分子对接技术的何首乌中肝毒性化合物的筛选方法，其包括以下步骤：(1)获得何首乌中至少一种待检化合物的三维化学结构；(2)获得MRP2、MRP3的蛋白同源模建结构，并分别确定MRP2和MRP3的活性位点；(3)将所述待检化合物、具有MRP2抑制效应的阳性化合物1、具有MRP3抑制效应的阳性化合物2分别与所述活性位点进行计算机分子对接，获得对接打分；(4)所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：所述待检化合物的对接打分达到对接判定值。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)还包括对所述待检化合物进行预处理的步骤，所述预处理包括三维结构生成、结构优化、和/或删除重复结构；步骤(2)还包括所述同源模建结构进行预处理的步骤，所述预处理包括结构优化、和/或质子化；
优选地，采用Discovery Studio2.5软件对所述待检化合物的化学结构和所述同源模建结构进行预处理。
3.根据权利要求2所述的方法，步骤(2)中所述同源模建结构通过文献检索获得MRP2、MRP3同源模建结构，例如PDB数据库中编号为6uy0的同源模建结构。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)中，MRP2活性位点根据关键氨基酸位点LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261定义；MRP3活性位点根据关键氨基酸位点GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245定义。
5.根据权利要求4所述的方法，步骤(2)中，所述MRP2活性位点定义为：半径为
位点的三维坐标位置为157.158707，176.372707，163.243586；和/或所述MRP3活性位点定义为：半径为
位点的三维坐标位置为171.206066，173.948148，165.653377。
6.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中所述计算机分子对接采用LibDock软件。
7.根据权利要求1所述的方法，步骤(4)中所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％。
8.根据权利要求1所述的方法，所述具有MRP2抑制效应的阳性化合物1是吲哚美辛或胆红素；所述具有MRP3抑制效应的阳性化合物2是伊马替尼或胆红素。
9.根据权利要求1所述的方法，当所述阳性化合物1是吲哚美辛或胆红素时，所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％；和/或当所述阳性化合物2是伊马替尼或胆红素时，所述对接判定值为阳性化合物对接打分的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％。
10.根据权利要求1所述的方法，当采用LibDock软件进行分子对接且所述阳性化合物1是吲哚美辛、阳性化合物2是伊马替尼时，所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP2结合，则对接打分达到至少56；若所述待检化合物与MRP3结合，则对接打分至少达到98；
当采用LibDock软件进行分子对接且所述阳性化合物1是胆红素、阳性化合物2是胆红素时，所述待检化合物判定为肝毒性化合物的条件是：若所述待检化合物与MRP2结合，则对接打分达到至少125或至少133；若所述待检化合物与MRP3结合，则对接打分至少达到123或至少130。
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| 马宁辉 等: "何首乌相关肝损伤研究进展", 中国中药杂志, vol. 45, no. 15, pages 3594 - 3602 * |
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