CN112080539B - 一种芸豆生物活性肽及其在制备降尿酸药物中应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芸豆生物活性肽，它是按以下方法制备得到：1)采用碱提酸沉法从芸豆中提取蛋白；2)将提取的蛋白用水溶解，然后加入蛋白酶进行酶解，加热灭活后离心，取上清液；3)将上清液用超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。本发明提供的芸豆生物活性肽对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用，体外抑制率最高可达50％，因此可用来制备黄嘌呤氧化酶抑制剂用于体外或体内，或用来制备降尿酸药物用于高尿酸血症、痛风等疾病的治疗。

Description

一种芸豆生物活性肽及其在制备降尿酸药物中应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种芸豆生物活性肽及其在制备降尿酸药物中应用。
背景技术
高尿酸血症是由于尿酸分泌过多或者排泄不足而引起的一种代谢类疾病，持续的高尿酸血症可增加痛风的患病率，可导致急性关节炎、痛风石、间质性肾炎、严重的关节畸形和功能障碍。高尿酸血症还与一些慢性代谢性疾病密切相关，可显著增加高血压、二型糖尿病、肾脏、心血管疾病的风险。
在人体中，尿酸主要来源于肝脏中的黄嘌呤，其中黄嘌呤氧化酶(XO)是参与其产生的关键酶。黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸，并在催化过程中产生超氧阴离子、H2O2和活性氧(ROS)。过量ROS可引起细胞损伤，并参与炎症、动脉粥样硬化和癌症等病理过程。同时，过量的尿酸会导致高尿酸血症、痛风，尿酸浓度是判断痛风早期的标准。
目前已有一些降尿酸药物用于高尿酸血症的治疗并有显著的效果，但是它们具有较大的毒副作用。别嘌呤醇极易与其他药物发生交叉反应，并可能引起胃肠道症状、皮疹、斯蒂芬·约翰逊综合征和别嘌呤醇过敏综合征。相比别嘌呤醇，非布索坦有更为显著的降尿酸效果，适用于具有痛风症状的高尿酸血症的治疗，但其使用早期易引起痛风，可能还会引发心血管疾病并且价格昂贵。苯溴马隆会导致肝功能异常，丙磺舒会使肾功能受损。因此，开发一种无副作用，更为安全有效的抗痛风活性物质至关重要。
芸豆是一种优质蛋白质，氨基酸比例比较均衡，是我国居民膳食中蛋白质的良好来源。据医籍记载，芸豆具有利尿消肿的作用，但是其潜在降尿酸活性并未有相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种芸豆生物活性肽，本发明的第二个目的是提供所述芸豆生物活性肽在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中应用。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种芸豆生物活性肽，它是按以下方法制备得到的：
1)采用碱提酸沉法从芸豆中提取蛋白；
2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为1-6％的蛋白溶液，然后按蛋白重量的1-5％向溶液中加入蛋白酶，在pH为7.5-10，温度为40-60℃条件下酶解1-5小时，加热灭活后离心，取上清液；
3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1-10kDa的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选地，所述蛋白溶液的浓度为2-3％。
优选地，所述蛋白酶的加入量为蛋白重量的2-3％。
优选地，所述酶解时间为1-2小时。
进一步优选地，所述蛋白溶液的浓度为2.5％，所述蛋白酶的加入量为蛋白重量的2.5％，所述酶解时间为1.5小时。
优选地，所述碱提酸沉法的具体操作为，将芸豆磨粉后加水，加入氢氧化钠，在温度为50-70℃，pH为8-11的条件下浸提1-5h，离心后用HCl调节上清液pH至3-6，静置沉淀后再次离心，将沉淀冻干。
优选地，所述超滤膜的截留分子量为5kDa。
本发明提供的芸豆生物活性肽对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用，体外抑制率最高可达50％，因此可用来制备黄嘌呤氧化酶抑制剂用于体外或体内，或用来制备降尿酸药物用于高尿酸血症、痛风等疾病的治疗。
本发明提供的芸豆生物活性肽还具有水解度高，产物收率和纯度大等优点。
附图说明
图1是不同酶对芸豆蛋白水解度和黄嘌呤抑制率的影响。
图2是酶添加量对芸豆蛋白水解度和黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。
图3是酶解时间对芸豆蛋白水解度和黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。
图4是底物浓度对芸豆蛋白水解度黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。
图5是芸豆肽的分子量大小对黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。
具体实施方案
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
以下各实施例中，体外黄嘌呤氧化酶抑制率测定的方法如下：
(1)溶液的配制
0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5):称取3.12g NaH2PO4·2H2O用超纯水定容到100ml；称取35.8g Na2HPO4·12H2O定容到500ml。最后把16份NaH2PO4·2H2O溶液与84份Na2HPO4·12H2O混合即为磷酸盐缓冲液。
黄嘌呤溶液(0.3mM)：准确称量0.00456g黄嘌呤，先加少量氢氧化钠使其溶解，然后用磷酸盐缓冲液定容到100ml。
黄嘌呤氧化酶(0.2U/ml):准确称量0.0019g黄嘌呤氧化酶，并用缓冲液定容到100ml。
(2)黄嘌呤氧化酶抑制率的测定
样品溶于缓冲液中得到20mg/ml的样品溶液。在96孔酶标板中依次加入50μl样品与50μl黄嘌呤氧化酶。37℃温育10min后加入150μl黄嘌呤，在290nm处20s读取一次吸光值，总计10min。以缓冲液作为空白对照，每个样品做3个平行。
Figure BDA0002648342840000041
其中，(dA/dt)空白和(dA/dt)样品分别代表没添加抑制剂的反应速率和添加抑制剂的反应速率。
实施例1：芸豆蛋白的提取
(1)芸豆浸泡一晚后剥皮、55℃烘干，磨成粉末备用。
(2)碱提：取40g芸豆粉末于烧杯中，加入1L去离子水，在温度为60℃，pH为10的条件下浸提2h。
(3)酸沉：在3800r/min转速条件下离心20min，用1mol/L的HCl调节上清液pH至4.3，静置一定时间后离心，沉淀冷冻干燥后即为芸豆蛋白。
实施例2：酶的筛选
(1)取3g芸豆蛋白，加入100ml去离子水，水浴加热30min。
(2)加1mol/L NaOH调至各酶最适pH值，在各酶的最适温度下加入蛋白酶，记录水解过程中NaOH的体积消耗量。
(3)酶解3h后，取出灭酶10min，冷却至室温后，在转速为8000rpm/min条件下离心20min，上清液即为芸豆蛋白的酶解液，冷冻干燥后备用。
(4)将冻干后的芸豆蛋白酶解物溶解，测定不同酶作用下芸豆蛋白酶解液的黄嘌呤氧化酶抑制率，比较各个酶对芸豆蛋白降尿酸活性的影响。
如图1所示，从水解度来看，碱性蛋白酶的水解度最高，为12.98％。胰酶水解度最低，仅为2.12％；从黄嘌呤氧化酶的抑制率来看，碱性蛋白酶的酶解产物抑制率最高，为31.81％，中性蛋白酶及木瓜蛋白酶次之，胰酶酶解产物的降尿酸活性最差。综上，选取碱性蛋白酶来制备芸豆降尿酸肽是最为合适的。
实施例3：芸豆降尿酸肽制备单因素实验
确定好最佳用酶后，通过单因素实验，考察不同底物浓度(w/w)、不同酶添加量(w/w)、不同酶解时间对芸豆蛋白水解度与其酶解液XO抑制活性的影响。具体实施如下：
(1)将芸豆蛋白加入到去离子水中形成一定浓度的蛋白溶液，加热30min使蛋白的一级结构断裂。
(2)调节芸豆蛋白溶液的pH至8.0，温度为55℃，按不同的酶底比加入碱性蛋白酶，在酶解过程中加入1mol/L NaOH使酶解pH恒为8.0，并记录水解过程中消耗NaOH的体积。
(3)酶解一定时间后，灭酶10min。冷却后在转速为8000rpm/min条件下离心20min，上清液即为芸豆蛋白的酶解液，冷冻干燥后备用。
(4)以黄嘌呤氧化酶抑制率为主要指标，水解度指标为辅，从而确定芸豆蛋白的酶解条件。
由图2可知，当加酶量为3％时，其水解度最高，此后趋于平稳。当加酶量量处于1-2％时，黄嘌呤抑制率也逐渐升高，当加酶量大于2％后，XOI活性逐渐降低并最终趋于平缓。综上可知碱性蛋白酶添加量为2％时能使芸豆肽呈现出最有效的降尿酸活性。
从图3可知，水解时间越长，蛋白酶的作用时间越长，芸豆蛋白水解度增加；而黄嘌呤抑制率在一定范围内随着酶解时间增长而提高，2-3h间略有下降，3h后慢慢趋于平稳，故酶解时间选择2h最为合适。
由图4可知，当底物浓度在2-3％这一范围时，芸豆蛋白的水解度和黄嘌呤抑制率都在不断升高。而当底物浓度大于3％之后，芸豆蛋白的水解度趋于稳定，黄嘌呤氧化酶抑制率也没有显著变化。所以酶解的底物浓度选择3％最为适宜。
实施例4：芸豆降尿酸肽制备正交实验
表1蛋白酶解的正交实验结果与方差分析
Figure BDA0002648342840000051
Figure BDA0002648342840000061
由表1可知，三个因素中，底物浓度对芸豆蛋白酶解的影响最大，酶解时间次之。底物浓度为2.5％，加酶量为1.5％，酶解时间为1.5h时，芸豆肽的降尿酸活性最强，为48.35％。此后经进一步验证实验确定了芸豆降尿酸肽的最佳酶解条件为：底物浓度为2.5％，加酶量为2.5％，酶解时间为1.5h。该条件下所得芸豆肽的黄嘌呤氧化酶抑制率为50.31％。
实施例5：芸豆蛋白酶解液的分级
(1)按实施例2方法得到芸豆蛋白酶解液。
(2)蛋白酶解液分别过截留分子量为5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行膜分离，最终得到三种不同级分的酶解液。
(3)测定三种级分以及芸豆蛋白酶解液(KBH)的黄嘌呤氧化酶活性，比较不同级分芸豆肽的降尿酸活性。
由图5可知，经膜分离后的芸豆肽的降尿酸活性有了显著的提高。虽然在三种级分中，分子量<3kDa的级分对黄嘌呤氧化酶的抑制活性最强(59.34％)，但三种级分之间的抑制效果并无显著差异(p>0.05)。考虑到生产时间和生产成本，<5kD级分的芸豆肽更适合应用于降尿酸药物的制备。

Claims (5)

1.芸豆生物活性肽在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中应用，所述芸豆生物活性肽按以下方法制备得到：
1）采用碱提酸沉法从芸豆中提取蛋白，所述碱提酸沉法的具体步骤为，将芸豆磨粉后加水，加入氢氧化钠，在温度为50-70℃，pH为8-11的条件下浸提1-5h，离心后用HCl调节上清液pH至3-6，静置沉淀后再次离心，将沉淀冻干；
2）将步骤1）提取的蛋白用水溶解成浓度为1-6％的蛋白溶液，然后按蛋白重量的2-3％向溶液中加入碱性蛋白酶，在pH为7.5-10，温度为40-60℃条件下酶解1-5小时，加热灭活后离心，取上清液；
3）将步骤2）的上清液用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白溶液的浓度为2-3％。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述酶解时间为1-2小时。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述蛋白溶液的浓度为2.5％，所述蛋白酶的加入量为蛋白重量的2.5％，所述酶解时间为1.5小时。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述超滤膜的截留分子量为5 kDa。
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