CN112080536A - 一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法 - Google Patents

一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法。本发明以竹材这种高纤维素含量的非木材纤维原料为原料，先经过高得率制浆，再进行芬顿处理，得到纤维素酶水解的底物，并对纤维素酶解工艺进行优化，提高纤维素酶酶解效率。本发明将高得率制浆结合芬顿处理，能够有效破坏竹材原料致密的结构，并去除一定量的木素，从而提高纤维素酶的酶解效率。

Description

一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的 方法
技术领域
本发明涉及生物质能源领域，具体涉及一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法。
背景技术
生产力的发展带来的日渐高涨的能源需求，让地球上化石能源的开采加快到了前所未有的速度，与之俱来的是化石能源的日渐枯竭问题，以及化石能源带来的污染危机。寻求新能源物质更大范围的发展成为现代科技需要面临的问题。
生物资源是地球上储量巨大且可再生的能源，木质纤维原料蕴含着丰富的纤维素、半纤维素，与淀粉一样是可以被分解为单糖的高分子糖类化合物。传统乙醇的生产依赖淀粉物质的产出，但是淀粉类物质又是人类摄入碳水化合物和糖类物质的来源，随着世界人口的增加，显然用粮食来生产燃料乙醇是不科学的。木质纤维原料含量巨多，关键是除去人们日常所需建筑用途，生活产品消耗后剩余的废弃物以及农作物的废弃物甚至生活垃圾中的纤维类物质都可以通过合理的手段处理得到可发酵糖产品。光合作用下，地球上植物每年可以产生的纤维素超过一千亿吨，蕴含的能量超过了全球人口消耗量的10倍。利用植物纤维原料生产可发酵糖具有十分重要的意义。
竹子是一种特殊的植物纤维原料，作为非木材纤维原料，含有丰富的纤维素和半纤维素，并且其生长周期较短，易于繁殖，拥有广泛的分布和巨大的生物量。在全球木材资源紧张的情况下，扩大竹材的进一步利用可以有效缓解眼下的困局。
竹类原料用来生产燃料乙醇，主要包括原料预处理/纤维素酶水解和戊糖己糖发酵等工艺。其中将原料中的纤维素和半纤维素转化为可发酵性糖类是至关重要的一步。竹材作为木质纤维原料，因其致密的结构，直接对其进行酶解的效率非常低，需要进行适当的预处理破坏其致密的结构包括对植物细胞壁进行破坏，破坏纤维素-木素-半纤维素之间的连接，降低纤维素结晶度和除去半纤维素、木素，以及增加纤维的比表面积，以达到能够提高纤维素酶的可及度和反应性的目的。从而提高酶解效率，降低生产成本。
目前的预处理方法主要有物理法、化学法、生物法和物理化学联合法等。物理法处理对设备要求高，效果较差，成本高，难以实现大规模工业化生产的弊端。生物法利用白腐菌、褐腐菌等细菌进行处理，存在着有效微生物少，酶活低，生产周期长的问题，同样不利于实现大规模工业化生产。
发明内容
针对目前木质纤维原料短缺以及纤维素酶水解木质纤维原料的酶解效率低的问题，本发明提供一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法，包括以下步骤：
S1.将竹材风干备料后进行高得率制浆；
S2.对制浆得到的浆料进行芬顿预处理；
S3.将芬顿预处理后的浆料进行纤维素酶水解；
所述芬顿预处理的条件为：pH＝3.0～5.0，温度为20～30℃，时间为2～8h，浆料与处理液的料液比为1g:10～15mL；所述处理液的组分包括FeSO4、H2O2、pH缓冲液和水；每克绝干浆料对应添加5～10mL、16mmol/L的FeSO4水溶液；每克绝干浆料对应添加5～10mL、30wt％的H2O2水溶液；
纤维素酶水解的条件为：pH＝4.8～6.0，温度为40～60℃，时间为48～72h；每克绝干浆料的酶用量为10～20FPU，底物浓度为5～10wt％。
优选地，所述高得率制浆为过氧化氢机械浆制浆、磺化化学机械浆制浆或热磨机械浆制浆。
本发明利用高得率浆和芬顿预处理两段联合的方法提高纤维素酶酶解效率，通过高得率制浆初步溶出竹材中的木素及其他非纤维素组分和破坏非纤维素组分的粘结作用，获得更大比表面积的纤维状的浆料，再通过芬顿预处理进一步除去浆料表面的木素和其他非木素组分，并提高浆料的亲水性，达到提高纤维素酶酶解效率的效果，同时本发明针对作为酶解底物的预处理后的浆料，进行纤维素酶解工艺优化，进一步提高纤维素酶酶解效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明操作简单，可利用现有的高得率浆成品进行预处理，比直接利用原料进行预处理生产相比，降低了生产成本。
(2)本发明的芬顿预处理采用的硫酸亚铁和过氧化氢价格低廉，能够有效地破坏木质纤维原料的顽固结构，并为后续的酶解过程提供足够量的羟基，提高酶解底物的亲水性，使得酶解效率大幅度提高。
(3)本方法可满足工业化的要求。
具体实施方式
以下实施例中，葡萄糖浓度、木糖浓度均采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：(1)色谱仪：Agillent1260高效液相色谱仪；(2)色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87P；(3)流动相为超纯水；(4)流速为0.6mL/min；(5)柱温为80℃；(6)进样量为10μL；(7)检测器：示差折光检测器。定量法：外标法测定。
实施例1
S1.竹材高得率浆制浆：
将砍伐的2-3年生粉单竹风干，切成长约5cm的竹条作为原料，将其制成典型的三种高得率浆。
(1)过氧化氢机械浆(APMP)制浆：粉单竹风干备料后切片，室温下再水中浸泡24h后，进行预气蒸，再经两段螺旋挤压和两段化学浸渍，最后进行三段盘磨后再通过酸化消潜筛浆后得到良浆。第一段化学浸渍的浸渍液的质量组分为3.0wt％的NaOH，2.0wt％的Na2SiO3，0.05wt％的MgSO4，2.0wt％的H2O2，0.10wt％的EDTA，其余为水；第一段化学浸渍的料液比为1g:4mL，浸渍时间为30min，浸渍温度为80℃；第二段化学浸渍的浸渍液的质量组分为3.0wt％的NaOH，2.0wt％的Na2SiO3，0.05wt％的MgSO4，4.0wt％的H2O2，0.10wt％的EDTA，其余为水；第二段化学浸渍的料液比为1g:4mL，浸渍时间为45min，浸渍温度为70℃。
(2)磺化化学机械浆(SCMP)制浆：粉单竹风干备料后切片，室温下在水中浸泡12h，进行蒸煮，蒸煮液的质量组分为15wt％的Na2SO3、2wt％的NaOH、其余为水，蒸煮的料液比为1g:5mL，在130℃下保温2h。然后进行三段磨浆，控制浆浓15wt％，三段磨浆工序磨盘间距依次为0.2mm、0.15mm、0.15mm。
(3)热磨机械浆(CTMP)制浆：使用六容器旋转蒸煮器进行蒸煮，每个罐子装满40g样品(料液比为1g:15mL)，不加入其他化学药品，仅利用热水进行蒸煮。在130℃下停留90min。然后使用小型高浓磨浆机进行磨浆，控制浆浓15～20wt％，三段磨浆工序磨盘间距依次为0.2mm、0.15mm、0.15mm。
S2.芬顿预处理：对APMP、SCMP、CTMP三种浆料进行芬顿预处理得到F-APMP、F-SCMP、F-CTMP，具体操作如下：
芬顿预处理的条件为：pH＝3.0，温度为22℃，时间为2h，浆料与处理液的料液比为1g:15mL。处理液的组分包括FeSO4、H2O2、碳酸氢钠缓冲液和水；每克绝干浆料对应添加5mL、16mmol/L的FeSO4水溶液；每克绝干浆料对应添加5mL、30wt％的H2O2水溶液。预处理完毕后，用自来水进行洗浆，洗浆后在4℃冷藏箱中平衡水分后，作为酶解底物备用。另取干燥后的底物进行葡萄糖含量及木糖含量和木素含量的测定。
表1预处理前后浆料的组分分析
Figure BDA0002673848900000031
Figure BDA0002673848900000041
如表1所示，经高得率制浆后，浆料中的木素会有初步的脱除，尤其是APMP脱除的最多，APMP的木素含量从25.6％降低到23.85％，这是因为APMP在制浆过程中使用的过氧化氢能够使木素有较多的脱除。再经过芬顿预处理后，浆料中的木素含量都有了不同程度的下降，APMP的木素含量从23.85％下降到了17.80％，而且由于其他杂质的去除，浆料中的葡萄糖含量有所增加。浆料中木素含量的下降能够降低纤维素酶的非生产性吸附，增加纤维素酶的可及度，从而提高纤维素酶的酶解效率。
表2预处理前后浆料的结晶度
样品 结晶度(％)
竹原料 57.60
APMP 61.97
SCMP 54.83
CTMP 53.94
F-APMP 59.97
F-SCMP 58.44
F-CTMP 60.60
从表2可以得出，经高得率制浆后，SCMP和CTMP的结晶度有了较大程度的降低，分别从57.60％降低到54.83％和53.94％，说明与化学浸渍相比，蒸煮对竹材原料的结构破坏有更好的作用。预处理后，各种高得率浆的结晶度反而都上升了，这是因为预处理进一步去除了非木素组分，纤维素的比例增加，结晶度有所增加。非纤维素组分的去除能够减少纤维素酶的无效吸附，并且能够提高浆料的可及度，从而达到提高酶解效率的效果。
S3.纤维素酶水解生产可还原性糖
分别取预处理前后的高得率浆作为酶解底物，取绝干重量为1g预处理后的浆料于50mL锥形瓶中，按照浆料的质量浓度为5wt％(即底物浓度)加入pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。再加入20FPU诺维信二代纤维素酶，用保鲜膜将瓶口扎紧，然后将锥形瓶放入水浴摇床中反应。摇床温度设置为50℃，转速为150rpm，反应时间为48h。反应结束后，将锥形瓶置于沸水浴中煮沸5min进行灭活，冷却后，收集水解液进行糖分测定。酶解效率的计算方式如下式：
Figure BDA0002673848900000042
表3预处理前后的浆料作为底物的纤维素酶酶解效率
底物 酶解效率(％)
APMP 10.84
SCMP 35.73
CTMP 6.48
F-APMP 22.94
F-SCMP 49.49
F-CTMP 7.63
由表3可以得出，以预处理后的浆料作为底物进行纤维素酶水解，其酶解效率均有提高，相比预处理前的浆料作为底物进行纤维素酶水解，酶解效率分别提高了111.62％、38.51％、17.75％。
实施例2
本实施例的步骤S1与实施例1的步骤S1相同，不同的是步骤S2和步骤S3。步骤S2、步骤S3具体如下：
S2.芬顿预处理：对APMP、SCMP、CTMP三种浆料进行芬顿预处理得到F-APMP、F-SCMP、F-CTMP，具体操作如下：
芬顿预处理的条件为：pH＝4.0，温度为20℃，时间为6h，浆料与处理液的料液比为1g:13mL。处理液的组分包括FeSO4、H2O2、碳酸氢钠缓冲液和水；每克绝干浆料对应添加8mL、16mmol/L的FeSO4水溶液；每克绝干浆料对应添加8mL、30wt％的H2O2水溶液。预处理完毕后，用自来水进行洗浆，洗浆后在4℃冷藏箱中平衡水分后，作为酶解底物备用。另取干燥后的底物进行葡萄糖含量及木糖含量和木素含量的测定。
表4预处理前后浆料的组分分析
样品 葡萄糖(％) 木糖(％) 木素(％)<sup>a</sup> 总比(％)
竹原料 34.65 11.19 25.60 71.73
APMP 35.02 11.87 23.85 70.74
SCMP 34.52 13.21 24.64 72.36
CTMP 39.27 14.34 25.54 53.61
F-APMP 37.33 11.28 17.85 66.46
F-SCMP 41.49 7.43 23.79 72.71
F-CTMP 36.37 12.20 24.73 73.30
表5预处理前后浆料的结晶度
Figure BDA0002673848900000051
Figure BDA0002673848900000061
S3.纤维素酶水解生产可还原性糖
分别取预处理前后的高得率浆作为酶解底物，取绝干重量为1g预处理后的浆料于50mL锥形瓶中，按照浆料的质量浓度为8wt％(即底物浓度)加入pH＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。加入15FPU诺维信二代纤维素酶，用保鲜膜将瓶口扎紧，然后将锥形瓶放入水浴摇床中反应。摇床温度设置为40℃，转速为150rpm，反应时间为60h。反应结束后，将锥形瓶置于沸水浴中煮沸5min进行灭活，冷却后，收集水解液进行糖分测定。酶解效率的计算方式如下式：
Figure BDA0002673848900000062
表6预处理前后的浆料作为底物的纤维素酶酶解效率
底物 酶解效率(％)
APMP 10.84
SCMP 35.73
CTMP 6.48
F-APMP 21.88
F-SCMP 47.30
F-CTMP 6.75
由表6可以得出，以预处理后的浆料作为底物进行纤维素酶水解，其酶解效率均有提高，相比预处理前的浆料作为底物进行纤维素酶水解，酶解效率分别提高了101.85％、32.38％、4.17％。
实施例3
本实施例的步骤S1与实施例1的步骤S1相同，不同的是步骤S2和步骤S3。步骤S2、步骤S3具体如下：
S2.芬顿预处理：对APMP、SCMP、CTMP三种浆料进行芬顿预处理得到F-APMP、F-SCMP、F-CTMP，具体操作如下：
芬顿预处理的条件为：pH＝5.0，温度为30℃，时间为8h，浆料与处理液的料液比为1g:10mL。处理液的组分包括FeSO4、H2O2、碳酸氢钠缓冲液和水；每克绝干浆料对应添加10mL、16mmol/L的FeSO4水溶液；每克绝干浆料对应添加10mL、30wt％的H2O2水溶液。预处理完毕后，用自来水进行洗浆，洗浆后在4℃冷藏箱中平衡水分后，作为酶解底物备用。另取干燥后的底物进行葡萄糖含量及木糖含量和木素含量的测定。
表7预处理前后浆料的组分分析
样品 葡萄糖(％) 木糖(％) 木素(％)<sup>a</sup> 总比(％)
竹原料 34.65 11.19 25.60 71.73
APMP 35.02 11.87 23.85 70.74
SCMP 34.52 13.21 24.64 72.36
CTMP 39.27 14.34 25.54 53.61
F-APMP 36.87 11.54 17.20 65.61
F-SCMP 42.37 6.97 28.65 77.99
F-CTMP 35.95 12.20 23.87 72.02
表8预处理前后浆料的结晶度
样品 结晶度(％)
竹原料 57.60
APMP 61.97
SCMP 54.83
CTMP 53.94
F-APMP 58.97
F-SCMP 56.44
F-CTMP 61.60
S3.纤维素酶水解生产可还原性糖
分别取预处理前后的高得率浆作为酶解底物，取绝干重量为1g预处理后的浆料于50mL锥形瓶中，按照浆料的质量浓度为10wt％(即底物浓度)加入pH＝6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。加入10FPU诺维信二代纤维素酶，用保鲜膜将瓶口扎紧，然后将锥形瓶放入水浴摇床中反应。摇床温度设置为60℃，转速为150rpm，反应时间为72h。反应结束后，将锥形瓶置于沸水浴中煮沸5min进行灭活，冷却后，收集水解液进行糖分测定。酶解效率的计算方式如下式：
Figure BDA0002673848900000071
表9以预处理前后的浆料作为底物的纤维素酶酶解效率
底物 酶解效率(％)
APMP 10.84
SCMP 35.73
CTMP 6.48
F-APMP 21.54
F-SCMP 48.89
F-CTMP 6.52
由表9可以得出，以预处理后的浆料作为底物进行纤维素酶水解，其酶解效率均有提高，相比预处理前的浆料作为底物进行纤维素酶水解，酶解效率分别提高了98.71％、36.83％、0.62％。

Claims (2)

1.一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将竹材风干备料后进行高得率制浆；
S2.对制浆得到的浆料进行芬顿预处理；
S3.将芬顿预处理后的浆料进行纤维素酶水解；
所述芬顿预处理的条件为：pH＝3.0～5.0，温度为20～30℃，时间为2～8h，浆料与处理液的料液比为1g:10～15mL；所述处理液的组分包括FeSO4、H2O2、pH缓冲液和水；每克绝干浆料对应添加5～10mL、16mmol/L的FeSO4水溶液；每克绝干浆料对应添加5～10mL、30wt％的H2O2水溶液；
纤维素酶水解的条件为：pH＝4.8～6.0，温度为40～60℃，时间为48～72h；每克绝干浆料的酶用量为10～20FPU，底物浓度为5～10wt％。
2.根据权利要求1所述的一种结合高得率制浆和芬顿预处理提高纤维素酶酶解效率的方法，其特征在于，所述高得率制浆为过氧化氢机械浆制浆、磺化化学机械浆制浆或热磨机械浆制浆。
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