CN112080512A - 一种带安全开关的car-nk及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的NY‑ESO‑1单链基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段；其中，所述改造的表皮生长因子受体基因片段包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列，一方面提高了杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体靶向性，另一方面使CAR‑NK细胞在治疗过程产生了相应的副作用之后，能够迅速通过NK细胞的ADCC作用被迅速清除。

Description

一种带安全开关的CAR-NK及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞及其制备方法。
背景技术
自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，来源于造血干细胞，在骨髓内发育成熟。在外周血中约占淋巴细胞总数的10％～15％，脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。与T细胞比较，NK细胞具有很多特点：固有免疫细胞、非特异性直接杀伤靶细胞、不需要预先由抗原致敏、不需要抗体参与、无MHC限制性、发挥免疫杀伤作用早。NK细胞可非特异性直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
NK细胞通过多种细胞表面受体包括NKG2D，CD16(ADCC效应介导受体)以及天然细胞毒性受体NKp44，NKp46，NKp30等识别被感染的和恶性癌变的细胞。这些受体激活含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构的调控蛋白DAP10、DAP12，ITAM结构能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放并调控IFN-γ和TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌。近年来肿瘤细胞免疫治疗治疗技术中，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)修饰的T细胞技术在治疗血液系统肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。另外，由于肿瘤微环境的免疫抑制及免疫逃逸作用，CAR-T细胞在实体瘤治疗方面尚未获得明确疗效。
NK细胞由于其特点：发挥杀伤作用不需要预先致敏，也不受主要组织相容性复合物的限制，可以使用异体来源的NK细胞而不会在患者体内引起排异反应；不会产生细胞因子风暴(比如，不会发生白细胞介素-6的大量释放)。如果使用具有肿瘤杀伤能力的NK细胞系，则可以按需要提供质量一致的产品，因此，NK细胞具有开发成“通用”的CAR-NK细胞药物的潜能。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。
寻找和鉴定新的肿瘤特异性或相关性抗原是肿瘤免疫学研究的关键之一。随着重组cDNA文库血清学分析技术(serological analysis of recombinantcDNA expressionlibraries，SEREX)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)克隆识别技术、生物信息学技术为基础的抗原鉴定体系的应用，大量的肿瘤特异性和相关性抗原被发现，其中癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CT)被认为是最具有前景的肿瘤相关抗原之一，其特点是在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织。由于生殖细胞不表达HLA分子以及血睾屏障的存在，因此针对CT抗原的肿瘤免疫治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma1，NY-ESO-1)是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，并在多种肿瘤组织(恶性黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等)中表达而在肿瘤治疗领域备受关注。
尽管如今出现了一些含有与NY-ESO-1特异结合的特异受体的转基因NK细胞，但大部分用于NK细胞中表达的CAR都是仅有T细胞CD3ζ结构域的一代CAR载体，与NK自身兼容性不高，同时增大转染后NK细胞的负荷，使得转染效率偏低，使得NK细胞靶向肿瘤细胞的特异杀伤性较差；同时，由于患者体内有可能存在排异情况，导致将改造得到的CAR-NK细胞在机体内，容易产生细胞因子风暴或系统性神经毒性等副作用，由于目前的CAR-NK细胞均表达于细胞内，在产生了相应的副作用之后，无法迅速被抗体识别并进行清除，导致治疗不及时，CAR-NK细胞治疗的安全性能较低、有效性较差，在使用过程中容易给机体造成伤害，影响其使用的广泛性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞及其制备方法，旨在解决现有技术中杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体靶向性差及CAR-NK细胞在治疗过程产生了相应的副作用之后，无法迅速被抗体识别的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的NY-ESO-1单链基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段；其中，所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.1；所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列如Sequence No.2，包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列。
以及，一种带安全开关的嵌合抗原受体，所述带安全开关的嵌合抗原受体包括顺次连接的NY-ESO-1单链受体和改造的表皮生长因子受体，所述NY-ESO-1单链受体的氨基酸序列如Sequence No.3，所述改造的表皮生长因子受体的氨基酸序列如Sequence No.4。
以及，一种带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或上述的带安全开关的嵌合抗原受体。
以及，一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或所述的带安全开关的嵌合抗原受体。
以及，一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，包括如下步骤：
合成上述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；
包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
利用含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
与现有技术相比，本发明所述的一种用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的NY-ESO-1单链基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段；其中，NY-ESO-1单链基因片段作为所述带安全开关的嵌合抗原受体的识别信号，所述NY-ESO-1单链基因片段能够表达NY-ESO-1单链抗原受体，能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进一步将带安全开关的嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，提高其靶向性，提高了杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体定位的准确性。此外，还连接了一段改造的表皮生长因子受体基因片段，所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列，经改造得到的表皮生长因子受体基因片段不包含胞内酪氨酸激酶结构域基因片段，其中，胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列是表皮生长因子受体的抗体的结合位点，由于改造后的表皮生长因子受体不包含胞内酪氨酸激酶结构域基因片段，因此改造后的表皮生长因子受体能够表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
本发明所述的一种带安全开关的嵌合抗原受体，所包括顺次连接的NY-ESO-1单链受体和改造的表皮生长因子受体，所述NY-ESO-1单链受体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进而激活下游的信号分子，使信号分子发挥作用，快速特异性杀死肿瘤细胞；所述改造的表皮生长因子受体不包含胞内酪氨酸激酶结构域，且胞外结构域III、胞外结构域IV是表皮生长因子受体的抗体的结合位点，因此改造后的表皮生长因子受体能够表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
本发明所述的一种带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或上述的带安全开关的嵌合抗原受体。该慢病毒表达载体能够分别发挥快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性；另一方面，所述安全开关为改造的表皮生长因子受体，其不包含胞内酪氨酸激酶结构域，因此可以表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
本发明所述的一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或所述的带安全开关的嵌合抗原受体。所述自然杀伤细胞能够成功诱导表达上述的带安全开关的嵌合抗原受体，使其能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性；同时所述安全开关为改造的表皮生长因子受体，其不包含胞内酪氨酸激酶结构域，因此可以表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
本发明所述一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，该制备方法能够在实现本发明带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞上述有益效果的同时，赋予所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的稳定性能，同时，此制备方法工艺简单，条件可控，操作便捷。
附图说明
图1是本发明实施例提供的合成得到的NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12的CAR结构图。
图2是本发明实施例提供的筛选得到的入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt质粒酶切产物的电泳图。
图3是本发明实施例提供的慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP1质粒酶切产物的电泳结果。
图4是本发明实施例提供的获得慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt的重组质粒图谱。
图5是本发明实施例提供的各效应细胞体外杀伤检测图。
图6是本发明实施例提供的NK细胞IFN-γ分泌量检测。
图7是本发明实施例提供的anti-EGFR抗体抑制带有安全性开关CAR-NK细胞的体外抗肿瘤活性检验分析图。
图8是本发明实施例提供的治疗结束后荷瘤NOD-SCID小鼠体内CAR-NK细胞抑瘤作用检测。
图9是本发明实施例提供的治疗结束后荷瘤NOD-SCID小鼠体内肿瘤重量分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，所述“NY-ESO-1”是指纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophagealsquamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1)，是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，在许多肿瘤中再表达。NY-ESO-1具有引发自发性体液免疫和细胞免疫应答的功能以及限制性表达模式，是肿瘤免疫治疗的良好候选靶标。
在本发明中，所述“慢病毒表达载体”是指以人类免疫缺陷病毒-1(H IV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
在本发明中，所述“自然杀伤细胞”，即natural killer cell(NK)，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
本发明实例提供一种用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的NY-ESO-1单链基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段；其中，所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.1；所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列如Sequence No.2，包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列。
具体的，NY-ESO-1单链基因片段作为识别信号，所述NY-ESO-1单链基因片段能够表达NY-ESO-1单链抗原受体，能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进一步将双信号嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，提高其靶向性，提高了杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体定位的准确性。
优选的，所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.1，碱基序列如下：
5’-GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACCAGATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCGTTTCTTCTGGTGGCTCTACTGCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGGGGGAGCTACTTCCCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCTCAGAGCGAATTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGGACCAGCCGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATAATTCATGATGTCATAGAGCGGTCGTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGCTGGTCATTTGCAGGCTCCTATTATGTCTTCGGGACAGGGACCGACGTCACCGTCCTCCCCAAGCTTGGG-3’。
具体的，所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列。经改造得到的表皮生长因子受体基因片段不包含胞内酪氨酸激酶结构域基因片段，其中，胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列是表皮生长因子受体的抗体的结合位点，由于改造后的表皮生长因子受体不包含胞内酪氨酸激酶结构域基因片段，因此改造后的表皮生长因子受体能够表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
优选的，所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列如Sequence No.2，碱基序列如下：
5’-CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG-3’。
在发明具体实施例中，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的第一信号肽SP基因片段、NY-ESO-1单链基因片段、CD8铰链区及跨膜结构域基因片段、41BB胞内结构域基因片段及DAP12-ITAM结构域基因片段、T2A基因片段、第二信号肽SP基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段。
本发明另一实施例提供了一种带安全开关的嵌合抗原受体，所述带安全开关的嵌合抗原受体包括顺次连接的NY-ESO-1单链受体和改造的表皮生长因子受体，所述NY-ESO-1单链受体的氨基酸序列如Sequence No.3，所述改造的表皮生长因子受体的氨基酸序列如Sequence No.4。
具体的，本发明所述的一种带安全开关的嵌合抗原受体，所包括顺次连接的NY-ESO-1单链受体和改造的表皮生长因子受体，所述NY-ESO-1单链受体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进而激活下游的信号分子，使信号分子发挥作用，快速特异性杀死肿瘤细胞。
优选的，所述NY-ESO-1单链抗体包括NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL。所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL由连接肽(Gly4Ser)3连接。
优选的，所述NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1scFv片段)的氨基酸序列如SequenceNo.3，氨基酸序列如下：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLPKLG。
具体的，所述改造的表皮生长因子受体包含表皮生长因子受体的胞外结构域III、胞外结构域IV及跨膜结构域，不包含胞内酪氨酸激酶结构域，且胞外结构域III、胞外结构域IV是表皮生长因子受体的抗体的结合位点，因此改造后的表皮生长因子受体能够表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
优选的，所述改造的表皮生长因子受体的氨基酸序列如Sequence No.4，氨基酸序列如下：
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM。
在本发明具体实施例中，所述带安全开关的嵌合抗原受体包括顺次连接的第一信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽SP以及改造的表皮生长因子受体。其中，所述NY-ESO-1单链受体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进而激活下游的信号分子CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，使信号分子发挥作用，快速特异性杀死肿瘤细胞；所述改造的表皮生长因子受体包含表皮生长因子受体的胞外结构域III、胞外结构域IV及跨膜结构域，不包含胞内酪氨酸激酶结构域，且胞外结构域III、胞外结构域IV是表皮生长因子受体的抗体的结合位点，因此改造后的表皮生长因子受体能够表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
本发明又一实施例提供了一种带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或上述带安全开关的嵌合抗原受体。
在本发明优选实施例中，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成序列用，构建本发明带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，即SP-NY-ESO-1scFv-CD8-41BB-DAP12-T2A-SP-EGFRt慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括所述带安全开关的抗原受体，所述带安全开关的抗原受体包括顺次连接的第一信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽SP以及改造的表皮生长因子受体。
并且，在所述带安全开关的抗原受体整个表达框的5’端和3’端分别添加限制性酶切位点EcoR I和XhoI，合成后的序列克隆在pUC57载体，质粒命名为pUC57-NY-ESO-1/CAR-EGFRt。
本发明再一实施例提供了一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或所述的带安全开关的嵌合抗原受体。
具体的，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，包括如下步骤：
S01.合成上述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；
S02.包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
S03.利用含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
具体的，在上述步骤S01中，按照上述方法合成上述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，并克隆至pUC57载体，得到质粒pUC57-NY-ESO-1/CAR-EGFRt。将所述NY-ESO-1/CAR-EGFRt序列进行Gateway入门克隆构建入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt，具体操作方法如下：
S011.pUC57-NY-ESO-1/CAR-EGFRt质粒及Gateway入门载体pENTR 11vector分别用EcoR I/Xho I双酶切，体系如下：
Figure BDA0002094569060000081
Figure BDA0002094569060000091
进行酶切条件为37℃水浴锅中酶解2h。
S012.分别胶回收NY-ESO-1/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体酶切后大片段；
S013.将所述回收得到的NY-ESO-1/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体片段连接，体系如下：
Figure BDA0002094569060000092
进行连接条件为16℃连接12小时。
S014.取连接产物转化至DH5α感受态细菌中，放置37℃细菌培养箱中过夜培养，挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切鉴定，将正确的Gateway入门克隆质粒命名为pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt。
将上述制备得到的入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt与现有的目的载体PLV-EASYT-2.1/V5-DEST进行重组反应，构建慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt。具体操作步骤如下：
S11.入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt与现有的目的载体PLV-EASYT-2.1/V5-DEST进行LR反应，反应体系如下：
Figure BDA0002094569060000093
同时，冰上解冻
Figure BDA0002094569060000094
LR ClonaseTM II Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。
S12.将LR反应产物的转化至DH5α感受态细菌中，步骤S014。
S13.阳性克隆的筛选与扩增
(1)用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打。
(2)吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下：
Figure BDA0002094569060000101
反应条件如下：95℃1min；94℃45s；60℃1min，72℃1min；30个循环；72℃10min。
(3)三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在2.6kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。
(4)提取质粒，获得慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt。
具体的，在上述步骤S02中，包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；具体操作方法如下：
S021.Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
S022.Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0002094569060000102
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
S023.
Figure BDA0002094569060000103
2000复合物的制备：
S0231.将1.5ml无血清的
Figure BDA0002094569060000104
I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒，轻柔混合。
其中，所述慢病毒表达质粒为上述合成得到的含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体。
S0232.将1.5ml无血清的
Figure BDA0002094569060000105
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0002094569060000106
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
S0233.将S0231和S0232两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
S0234.室温下孵育20min，得到
Figure BDA0002094569060000107
2000复合物。
S024.将得到的
Figure BDA0002094569060000108
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
S025.Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
S026.Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
S027.吸取病毒原液，在4℃条件下4000g离心10min去除细胞碎片。
S028.将去除了细胞碎片的病毒原液在4℃条件下25000rpm离心2h。弃去上清，用PBS按照1:100(PBS:病毒原液)重悬病毒沉淀。
S029.重悬后的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。
利用上述制备方法，对慢病毒进行包装制备，得到的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。其中，包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒PLV-Easy-T-2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt。
具体的，在上述步骤S03中，利用含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。具体包括如下步骤：
S031.分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC细胞)；
S032.带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)细胞的制备。
具体的，在上述步骤S031中，分离健康志愿者PBMC细胞，具体步骤如下：
S0311.抽取健康志愿者外周血25ml，加入肝素继续拧抗凝，在室温条件下离心，所述离心条件为转速700g/min，时间为20min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，进行离心，所述离心条件为转速900g/min，时间为30min，取自体血浆4℃保存备用。
S0312.取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心，所述离心条件为转速800g/min，时间为15min。
S0313.吸取白膜层细胞，加入到装有5ml培养基RPMI 1640的50ml离心管中。
S0314.利用培养基RPMI 1640进行离心洗涤，离心条件为转速600g/min，时间为10min，洗涤两次，收集细胞即为PBMC细胞。
具体的，在上述步骤S032中，带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)细胞的制备方法如下：
S0321.用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
S0322.每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
S0323.在培养的第7天，将NK细胞分成两组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔，每组设两个复孔。
第1组：感染PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为NY-ESO-1-CAR组。
第2组：空白NK细胞对照组，命名为NK组。
第1组按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)加入含有慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。第2组加入空白Alys505完全培养基100μl。两组细胞分别加入终浓度为8μg/ml的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
S0324.第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μl Alys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
S0325.在培养的第10天，分别收获NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NK组成熟细胞，用于后续分析。
所述的一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或所述的带安全开关的嵌合抗原受体。所述自然杀伤细胞能够成功诱导表达上述的带安全开关的嵌合抗原受体，使其能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性；同时所述安全开关为改造的表皮生长因子受体，其不包含胞内酪氨酸激酶结构域，因此可以表达并分泌至细胞外，当带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞在治疗过程中产生了副作用时，在机体内注射抗体，抗体可以快速、特异性地识别分泌至胞外的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞，从而通过自然杀伤细胞自身的ADCC作用，快速清除体内产生副作用的带安全开关的嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
该制备方法能够在实现本发明带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞上述有益效果的同时，赋予所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的稳定性能，同时，此制备方法工艺简单，条件可控，操作便捷。
下边以具体实施例来进一步说明本发明上述一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用。
实施例1
慢病毒表达载体的构建
第一步：序列合成
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成序列用，构建本发明带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，即SP-NY-ESO-1scFv-CD8-41BB-DAP12-T2A-SP-EGFRt慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括所述带安全开关的抗原受体，所述带安全开关的抗原受体包括顺次连接的第一信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽SP以及改造的表皮生长因子受体；并克隆至pUC57载体，得到质粒pUC57-NY-ESO-1/CAR-EGFRt。
合成得到的NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12的CAR结构图如图1，长为1303bp。
第二步：入门质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt的克隆
将所述NY-ESO-1/CAR-EGFRt序列进行Gateway入门克隆构建入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt，具体操作方法如下：
(1)pUC57-NY-ESO-1/CAR-EGFRt质粒及Gateway入门载体pENTR 11vector分别用EcoR I/Xho I双酶切，体系如下：
Figure BDA0002094569060000131
进行酶切条件为37℃水浴锅中酶解2h。
(2)分别胶回收NY-ESO-1/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体酶切后大片段；
(3)将所述回收得到的NY-ESO-1/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体片段连接，体系如下：
Figure BDA0002094569060000132
进行连接条件为16℃连接12小时。
(4)取连接产物转化至DH5α感受态细菌中，放置37℃细菌培养箱中过夜培养，挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，进行酶切鉴定，将入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt质粒经过EcoR I/Xho I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在2.3kb和1.3kb处有清晰条带(图2)，与预期结果一致。证明NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt基因正确插入到pENTR载体中。将正确的Gateway入门克隆质粒命名为pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt。
第三步：构建慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt
将上述制备得到的入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt与现有的目的载体PLV-EASYT-2.1/V5-DEST进行重组反应，构建慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt。具体操作步骤如下：
(1)入门克隆质粒pENTR-NY-ESO-1/CAR-EGFRt与现有的目的载体PLV-EASYT-2.1/V5-DEST进行LR反应，反应体系如下：
Figure BDA0002094569060000141
同时，冰上解冻
Figure BDA0002094569060000142
LR ClonaseTM II Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。
(2)将LR反应产物的转化至DH5α感受态细菌中，步骤S014。
(3)阳性克隆的筛选与扩增
①用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打。
②吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下：
Figure BDA0002094569060000143
反应条件如下：95℃1min；94℃45s；60℃1min，72℃1min；30个循环；72℃10min。
③三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在2.6kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。
对PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt质粒经过EcoR V酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在大约5218bp和1792bp以及1496bp处有清晰条带(图3)，与预期片结果一致。
证明PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt质粒构建成功。
④提取质粒，获得慢病毒表达质粒PLV-Easy-T2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt/CAR-EGFRt，构建得到的重组质粒图谱如图4。
实施例2
慢病毒的包装制备
慢病毒的包装制备，具体操作方法如下：
(1)Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
(2)Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0002094569060000151
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
(3)
Figure BDA0002094569060000152
2000复合物的制备：
①将1.5ml无血清的
Figure BDA0002094569060000153
I培养液加入5ml离心管中，加入9μg ViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒，轻柔混合。
其中，所述慢病毒表达质粒为上述合成得到的含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体。
②将1.5ml无血清的
Figure BDA0002094569060000154
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0002094569060000155
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
③将S0231和S0232两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
④室温下孵育20min，得到
Figure BDA0002094569060000156
2000复合物。
(4)将得到的
Figure BDA0002094569060000157
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
(5)Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
(6)Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
(7)吸取病毒原液，在4℃条件下4000g离心10min去除细胞碎片。
(8)将去除了细胞碎片的病毒原液在4℃条件下25000rpm离心2h。弃去上清，用PBS按照1:100(PBS:病毒原液)重悬病毒沉淀。
(9)重悬后的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。
利用上述制备方法，对慢病毒进行包装制备，得到的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。其中，包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒PLV-Easy-T-2.1-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12/CAR-EGFRt。
实施例3
带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)的制备
第一步：分离健康志愿者PBMC细胞，具体操作方法如下：
(1)抽取健康志愿者外周血25ml，加入肝素继续拧抗凝，在室温条件下离心，所述离心条件为转速700g/min，时间为20min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，进行离心，所述离心条件为转速900g/min，时间为30min，取自体血浆4℃保存备用。
(2)取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心，所述离心条件为转速800g/min，时间为15min。
(3)吸取白膜层细胞，加入到装有5ml培养基RPMI 1640的50ml离心管中。
(4)利用培养基RPMI 1640进行离心洗涤，离心条件为转速600g/min，时间为10min，洗涤两次，收集细胞即为PBMC细胞。
第二步：带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)的制备，具体方法如下：
(1)用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(2)每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
(3)在培养的第7天，将NK细胞分成两组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔，每组设两个复孔。
第1组：感染PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为NY-ESO-1-CAR组。
第2组：空白NK细胞对照组，命名为NK组。
第1组按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)加入含有慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。第2组加入空白Alys505完全培养基100μl。两组细胞分别加入终浓度为8μg/ml的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
(4)第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μl Alys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
(5)在培养的第10天，分别收获NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NK组成熟细胞，用于后续分析。
对上述实施例3制备得到的：带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)进行抗肿瘤活性检测分析，具体操作方法如下：
(一)带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)体外抗肿瘤活性检测：
(1)以上述NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NK组成熟细胞为效应细胞，NCI-H1299(NY-ESO-1+)，NCI-H520(NY-ESO-1-)，NCI-H1395(NY-ESO-1-)肺癌细胞为靶细胞。于96孔板中按照1:1以及5:1的效靶比混合效应细胞及靶细胞，轻轻混匀；同时设置无细胞的培养液孔以及只有靶细胞的样品对照孔和只有靶细胞用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性孔)置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
(2)共孵育的第3h，在样品最大酶活性孔加入总体积10％的LDH释放试剂。
(3)共孵育的第4h，400g离心5min，每孔各取120ul上清液加入至新的96孔板。
(4)每孔加入60ulLDH工作液，充分混匀，室温避光孵育30min。
(5)于490nm处测定吸光度。
细胞毒性/死亡率＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。
(二)带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)IFN-γ分泌检测：
(1)样品制备；
①NCI-H1299(NY-ESO-1+)，NCI-H520(NY-ESO-1-),NCI-H1395(NY-ESO-1-)肺癌细胞作为靶细胞按照5×103/孔的细胞密度接种于96孔板中。
②按照5:1，2.5:1，1:1的效靶比加入NY-ESO-1-CAR-NK细胞以及NK细胞效应细胞。置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
③共孵育24h后，400g离心5min，吸取上清。
(2)ELISA检测：
①包被：用包被缓冲液将Capture antibody稀释至建议浓度，在96孔酶标板中加0.1mL，用保鲜膜封板，置于37℃恒温箱2h或4℃过夜；弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板3次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
②封闭：每孔加入250ul的封闭液，用保鲜膜封板，置于室温封闭1h，洗板同上。
③加样品：设立8个标准孔，每孔均设立2个复孔，用稀释缓冲液稀释标准品至浓度为2ng/mL，进行孔内稀释，终浓度分别为：2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.25pg/mL，0pg/mL；同时将上述细胞共孵育24h后收集的上清液，加入到设定的孔中，100μl/well，设空白对照和阴性对照孔；用保鲜膜封板，置于室温孵育2h或4℃过夜。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
④加二抗：用稀释缓冲液将detect antibody稀释至建议浓度，每孔加入100ul，用保鲜膜封板，置于室温孵育1h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
⑤加Avidin-HRP：用稀释缓冲液将Avidin-HRP稀释至建议浓度，每孔加入100ul，用保鲜膜封板，置于室温孵育30min，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5-7次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
⑥加TMB显色：每孔加入100ul的TMB显色液，室温避光反应15分钟。
⑦终止：每孔加入50ul的1mol/L的H2SO4。
⑧结果显示：放入全自动酶标仪检测450nm波长处的OD值。读数，输出到Excel中，绘制标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度。
(三)anti-EGFR抗体对带有安全性开关CAR-NK细胞的体外抗肿瘤活性影响的检测分析
NK或者CAR-NK细胞与2ug/ml的anti-EGFR抗体共孵育24h后效应细胞，NCI-H1299肺癌细胞为靶细胞，于96孔板中按照5:1的效靶比混合效应细胞及靶细胞，轻轻混匀；以未与anti-EGFR抗体孵育过的NK以及CAR-NK细胞为效应细胞作为对照组，NCI-H1299肺癌细胞为靶细胞,于96孔板中按照5:1的效靶比混合效应细胞及靶细胞。同时设置无细胞的培养液孔以及只有靶细胞的样品对照孔和只有靶细胞用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性孔)置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。共孵育的第3h，在样品最大酶活性孔加入总体积10％的LDH释放试剂。共孵育的第4h，400g离心5min，每孔各取120ul上清液加入至新的96孔板。每孔加入60ulLDH工作液，充分混匀，室温避光孵育30min。于490nm处测定吸光度。细胞毒性/死亡率＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。
(四)带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)动物体内抗肿瘤活性检测：
取对数生长期的人肺癌NCI-H1299细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1ml于NOD-SCID小鼠肩胛部皮下注射。实验分组及治疗情况见下表，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量NOD-SCID小鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/2a×b2。治疗结束后取出NOD-SCID小鼠体内的肿瘤，对其重量进行称量统计。
实验分组及治疗情况
Figure BDA0002094569060000181
对上述实施例3制备得到的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)进行抗肿瘤活性检测分析的结果如下：
如图5所示，以NCI-H1299(NY-ESO-1+)，NCI-H520(NY-ESO-1-),NCI-H1395(NY-ESO-1-)肺癌细胞作为靶细胞；以NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NK组成熟细胞作为效应细胞，应用LDH法检测NK细胞对3种肺癌细胞系的杀伤效率。实验结果显示，NY-ESO-1-CAR组细胞对NCI-H1299(NY-ESO-1+)肺癌细胞的杀伤率明显强于NK组，而没有提高对NCI-H520(NY-ESO-1-)，NCI-H1395(NY-ESO-1-)的杀伤。此外，作用于NCI-H1299(NY-ESO-1+)肺癌细胞时，当效靶比为5:1时，NY-ESO-1-CAR组成熟细胞对肺癌细胞的杀伤率为40％，而NK组细胞对肺癌细胞的杀伤率仅为20％。说明3制备得到的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)对NY-ESO-1+肺癌细胞具有高效的杀伤作用。
对上述实施例3制备得到的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)IFN-γ分泌量检测分析的结果如下：
如图6所示，以各组细胞作为效应细胞，应用ELISA法检测各组NK细胞与3种肺癌细胞共孵育后IFN-γ的分泌量，实验结果显示，NY-ESO-1-CAR-NK细胞与肺癌细胞NCI-H1299(NY-ESO-1+)共孵育后IFN-γ的分泌量明显高于NK细胞组，而处理NCI-H520(NY-ESO-1-)，NCI-H1395(NY-ESO-1-)的时候，IFN-γ的分泌量没有明显变化。具体的，当效靶比为1:1时，NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为800pg/mL；NY-ESO-1-CAR-NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1000pg/mL；当效靶比为5:1时，NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1000pg/mL；NY-ESO-1-CAR-NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1200pg/mL证明，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞在经过抗原刺激以后，细胞活化程度更高，分泌更多的IFN-γ，可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长，并且延长小鼠的生存周期。
对上述实施例3制备得到的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)利用anti-EGFR抗体进行抑制带有安全性开关CAR-NK细胞的体外抗肿瘤活性检验，分析结果如下：
如图7所示，以各组细胞作为效应细胞，应用LDH法检测anti-EGFR抗体孵育后的NK细胞对NCI-H1299肺癌细胞系的杀伤效率，实验结果显示将NK细胞以及带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)与anti-EGFR抗体孵育后，带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)对NCI-H1299的杀伤能力明显降低，而普通NK的肿瘤杀伤能力并未受到影响。
对上述实施例3制备得到的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)进行动物体内抗肿瘤活性检测分析的结果如下：
如图8所示，进行体内抗肿瘤实验发现，空白对照组以及NK对照组的小鼠体型消瘦，进食及饮水量明显减少，精神状态不佳，空白对照组在第20天肿瘤体积明显增大，到第35天，肿瘤体积大约为2000mm3，NK对照组在第20天肿瘤体积明显增大，到第35天，肿瘤体积超过1000mm3。而经过NY-ESO-1-CAR-NK治疗组的小鼠则体重、饮食、饮水正常，精神状态良好，在第20天肿瘤体积逐渐增大，到第35天，肿瘤体积不超过1000mm3，治疗小鼠肿瘤的生长得到了一定程度上的的抑制。NY-ESO-1-CAR治疗组小鼠体重、饮食、饮水正常，精神状态良好，在第20天肿瘤体积逐渐增大，到第35天，肿瘤体积不超过250mm3，肿瘤得到了明显的抑制并且生存周期得到延长。说明带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。
如图9所示，测定治疗结束后荷瘤NOD-SCID小鼠体内肿瘤重量，其中，空白对照组中小鼠体内肿瘤重量较高，为3-4g；而NK对照组中小鼠体内肿瘤重量较高，为1-2g；NY-ESO-1-CAR-NK治疗组得到的小鼠体内肿瘤重量大约为0.5-1g。进一步证明，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> 一种带安全开关的CAR-NK及其制备方法
<130> 2019.06.11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttaccaga tgtcttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcgtttctt ctggtggctc tactgcttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gggggagcta 300
cttccctact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcaagcggt 360
ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctcagagcga attgactcag 420
cctcgctcag tgtccgggtc tcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tgggaccagc 480
cgtgatgttg gtggttataa ctatgtctcc tggtaccaac aacacccagg caaagccccc 540
aaactcataa ttcatgatgt catagagcgg tcgtcagggg tccctgatcg cttctctggc 600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggatgaggct 660
gattattatt gctggtcatt tgcaggctcc tattatgtct tcgggacagg gaccgacgtc 720
accgtcctcc ccaagcttgg g 741
<210> 2
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960
ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005
<210> 3
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu
195 200 205
Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys
210 215 220
His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg
225 230 235 240
Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His
245 250 255
Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu
260 265 270
Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro
275 280 285
Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr
290 295 300
Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
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115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu
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210 215 220
His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg
225 230 235 240
Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His
245 250 255
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Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro
275 280 285
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290 295 300
Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330

Claims (10)

1.一种用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，其特征在于，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的NY-ESO-1单链基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段；其中，所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如SequenceNo.1；所述改造的表皮生长因子受体基因片段的碱基序列如Sequence No.2，包含表皮生长因子受体的胞外结构域III碱基序列、胞外结构域IV碱基序列及跨膜结构域碱基序列。
2.根据权利要求1所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，其特征在于，所述用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的第一信号肽SP基因片段、NY-ESO-1单链基因片段、CD8铰链区及跨膜结构域基因片段、41BB胞内结构域基因片段及DAP12-ITAM结构域基因片段、T2A基因片段、第二信号肽SP基因片段以及改造的表皮生长因子受体基因片段。
3.一种带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述带安全开关的嵌合抗原受体包括顺次连接的NY-ESO-1单链受体和改造的表皮生长因子受体，所述NY-ESO-1单链受体的氨基酸序列如Sequence No.3，所述改造的表皮生长因子受体的氨基酸序列如SequenceNo.4。
4.根据权利要求3所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述改造的表皮生长因子受体包含表皮生长因子受体的胞外结构域III、胞外结构域IV及跨膜结构域。
5.根据权利要求3所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述NY-ESO-1单链抗体包括NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL，且所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL由连接肽(Gly4Ser)3连接。
6.根据权利要求3-5任一所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述带安全开关的嵌合抗原受体包括顺次连接的第一信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽SP以及改造的表皮生长因子受体。
7.一种带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体，其特征在于，所述带安全开关的嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述权利要求1-2任一所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或上述权利要求3-6任一所述的带安全开关的嵌合抗原受体。
8.一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有权利要求1-2任一所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段或上述权利要求3-6任一所述的带安全开关的嵌合抗原受体。
9.一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，包括如下步骤：
合成上述权利要求1-2任一所述的用于表达带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；
包装含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
利用含有所述带安全开关的嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
10.根据权利要求9所述的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体为PLV-Easy-T-2.1，且所述包装慢病毒表达载体的细胞为293FT细胞。
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