CN112076312A - 具有免疫调节作用的疫苗、多抗血清注射剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了一种具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，包括以下步骤：从名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏中提取多菌种组合物；培养所述多菌种组合物，收集培养得到的微生物；将培养得到的微生物依次经冲洗、过滤、纯化、灭活处理，得到多菌种全菌体抗原原液；混合所述多菌种全菌体抗原原液、氯化钠溶液、注射用聚山梨酯80和注射用水，配置成所述具有免疫调节作用的疫苗；所述的具有免疫调节作用的疫苗，可以激活多种免疫途径，具有广谱的抗菌效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有免疫调节作用的疫苗、多抗血清注射剂及其制备方法。
背景技术
机体的免疫系统由免疫器官(如脾脏、胸腺、淋巴结等)、免疫细胞(如单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等)以及免疫活性物质(如抗体、补体、淋巴因子、白细胞介素等)组成。如果免疫调节功能异常，对自身成分产生强烈的免疫攻击，造成细胞破坏，功能丧失，就会发生自身免疫病。如果免疫系统对外界病原微生物感染不能产生适度的反应，也可造成对机体的有害作用。
目前，将微生物及其有效成分或代谢产物作为免疫调节剂的药物越来越多，但是免疫调节剂主要采用单一菌种制备，如草分枝杆菌F.U.36注射液，其主要成分为灭活的草分枝杆菌F.U.36，进入人体后刺激活化淋巴细胞，释放淋巴因子和抗体，从而增强机体免疫能力，主要用于肺和肺外结核的辅助治疗。通常采用单一微生物作为抗原，其抗原决定簇有限，而且一种抗原只能引起机体产生相应的抗体，此抗体也只能与相应的抗原发生结合，所以目前所常用的免疫调节剂并不能激活多种免疫途径，并不具备广谱的抗菌效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种具有免疫调节作用的疫苗、多抗血清注射剂及其制备方法，可以激活多种免疫途径，具有广谱的抗菌效果。
为实现上述目的，本发明第一方面采用的技术方案为：一种具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，包括以下步骤：从名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏中提取多菌种组合物；培养所述多菌种组合物，收集培养得到的微生物；将培养得到的微生物依次经冲洗、过滤、纯化、灭活处理，得到多菌种全菌体抗原原液；混合所述多菌种全菌体抗原原液、氯化钠溶液、注射用聚山梨酯80和注射用水，配置成所述具有免疫调节作用的疫苗；其中，所述九曲香酯醋为在酒精发酵中利用了名酒大曲菌系制得的原浆醋；所述九曲香酯醋醋膏为所述九曲香酯醋陈放至少一年以上形成的半固态或固态的醋膏；所述发酵酒醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的酒醅；所述发酵醋醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的醋醅；所述熏醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的熏醅产物。
优选地，所述培养所述多菌种组合物的步骤，包括：
将所述的多菌种组合物，分别置于一种或两种以上的培养基中进行培养；其中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、沙氏培养基、高氏培养基、察氏培养基、尿素培养基、血琼脂平板培养基、肠道杆菌培养基、罗氏培养基、牛心脑浸液培养基或MRS培养基。
优选地，所述培养的温度为20℃～45℃，培养的时间为1天～30天。
优选地，所述灭活的方式为高温灭活、化学试剂灭活、辐射灭活、超声破碎或高压均质破碎中的一种或两种以上方式的组合。
本发明另一方面提供了一种具有免疫调节作用的疫苗，由上述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法制备获得。
优选地，所述的具有免疫调节作用的疫苗包括多菌种组合物，所述多菌种组合物包括立克次氏体目、放线菌属、链霉菌属、短杆菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、葡萄球菌属、糖多孢菌属、小球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母目、黑孢属、青霉属、曲霉属、毛霉属、木霉属、镰孢霉属、嗜热真菌属中的一种或两种以上。
优选地，所述的具有免疫调节作用的疫苗包括灭活菌体，所述灭活菌体的数量为105～1010个/mL。
优选地，所述注射用聚山梨酯80的体积百分比是0.01％-0.2％。
本发明又一方面提供了一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法，包括以下步骤：
将上述的具有免疫调节作用的疫苗注射至免疫动物内；
从免疫动物中取血、分离血清、纯化抗血清，得到具有免疫调节作用的血清注射剂。
本发明又一方面提供了一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，所述的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂由上述的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法制备获得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏为提取菌体的原料，原料中含有丰富的微生物，提取得到的多菌种组合物中菌体种类丰富；
且在制备过程中对微生物进行灭活，使得本发明制备得到的免疫调节作用的疫苗失去致病性，但其仍携带抗原，可以刺激免疫系统产生抗体，发挥免疫调节作用；
本发明制备得到的具有免疫调节作用的疫苗，作为多免疫源可以刺激机体产生免疫反应，可以激活多种免疫途径，产生广谱的抗菌效果；
本发明制备得到的具有免疫调节作用的疫苗和多抗血清注射剂均可用于由于人体或动物体的机体免疫功能低下引起的病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫病等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明实施例所属技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。如果此部分中陈述的定义与通过引用纳入本文的所述专利、专利申请、公布的专利申请和其他出版物中陈述的定义相反或其他方面不一致，此部分中列出的定义优先于通过引用纳入本文中的定义。
另外，本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的重量单位。
本发明实施例第一方面提供了一种具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S101、从名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏中提取多菌种组合物；
S102、培养所述多菌种组合物，收集培养得到的微生物；
S103、将培养得到的微生物依次冲洗、过滤、纯化、灭活，得到多菌种全菌体抗原原液；
S104、混合所述多菌种全菌体抗原原液、氯化钠溶液、注射用聚山梨酯80和注射用水，配置成所述具有免疫调节作用的疫苗；
其中，所述九曲香酯醋为在酒精发酵中利用了名酒大曲菌系制得的原浆醋；
所述九曲香酯醋醋膏为所述九曲香酯醋陈放至少一年以上形成的半固态或固态的醋膏；
所述发酵酒醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的发酵酒醅；
所述发酵醋醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的发酵醋醅；
所述熏醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的熏醅。
其中，多菌种组合物是指包含多种微生物的组合物。
本发明实施例中，名酒指的是中国1952年以来五次全国评酒会获得名酒称号的各种香型白酒，包括但不限于：茅台、五粮液、泸州老窖、剑南春、汾酒、洋河大曲、郎酒、古井贡酒、董酒、西凤酒、双沟大曲等，均可以在名酒产地环境下进行制备或者直接从当地的大曲制造商处购得。优选地，名酒可以指茅台、五粮液、泸州老窖、剑南春酒、董酒、古井贡酒；进一步优选地，名酒指的是茅台、五粮液和泸州老窖。
名酒大曲是指用于酿造上述名酒的酒曲，名酒大曲菌系指的是名酒大曲中的微生物群。优选地，名酒大曲菌系为茅台大曲的微生物群。
名酒大曲菌系中所包含的细菌OTUs高于110个，真菌OTUs高于80个。其中，OTU为operational taxonomic unit的缩写，为微生物群落单位的总称。
其中，所述九曲香酯醋的制备包括：将谷物原料用水浸润，蒸料，焖料，得到待发酵原料；将所述待发酵原料依次进行酒精发酵、醋酸发酵、熏醅、淋醋和陈酿。
优选地，在所述淋醋和所述陈酿之间，还包括：冻醋；所述冻醋包括：将醋液冷冻为固态的醋块，然后将所述醋块融化，收集融化的浓稠醋液。
作为本发明一具体实施例，所述九曲香酯醋的制备包括：
S001、在谷物原料中加入谷物原料重量30％～50％的水进行浸润，使其充分吸水，得浸润后的谷物原料；
S002、将S001中浸润后的谷物原料，蒸料90min～180min，得到蒸料；
S003、在S002得到的蒸料中加入谷物原料重量180％～280％的水，在水蒸气下焖15min～80min，得到待发酵原料；
S004、将谷物原料重量20％～70％的名酒大曲菌系加入S003得到的待发酵原料中，混匀；
S005、加入谷物原料重量40％～70％的水，在28℃～35℃下酒精发酵15～730天，得到发酵酒醅；步骤S005中所述发酵醋醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的醋醅；
S006、在S005得到的发酵酒醅中加入谷物原料重量100％～300％的粮食加工皮类物质作为疏松材料，混匀；
S007、加入谷物原料重量5％～15％的发酵6～8天的醋醅，进行醋酸发酵，发酵8～360天，得到发酵醋醅；所述发酵6～8天的醋醅指的是前一次醋酸发酵过程中发酵6～8天的醋醅，或者为采用醋酸菌种进行醋酸发酵6～8天得到的醋醅；由于采用醋酸菌种进行醋酸发酵制得的原浆醋香气较淡，活性物质也会相应减少。步骤S007中所述的发酵醋醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的发酵醋醅。
因而，在本发明实施例中，发酵6～8天的醋醅优选为前一次发酵6～8天的醋醅，其醋酸发酵效果更佳，物质成分更为丰富。
S008、取25％～75％所述S007得到的发酵醋醅，于60℃～80℃下熏醅4～8天，得熏醅；步骤S008中所述熏醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的熏醅产物。
S009、将S008剩余的发酵醋醅中加入冷水和淋醋的淡醋液，使得总重量增加至原重量的2～3倍，浸泡12h以上，淋出醋液，得到第一醋液；将第一醋液加热至80℃～90℃，加入所述熏醅，浸泡10h以上，再次淋出醋液，得到第二醋液；
S010、将步骤S009的第二醋液置于冷冻环境中进行冷冻，使其成为醋块；然后，将醋块置于0～20℃的环境中，使其缓慢融化，收集流下的浓稠醋液；冷冻环境优选为冷库、冰柜或冰箱。醋块可指外表刚凝固并基本呈现为固态的醋块，也可以指从里到外完全凝固时的醋块。
S011、将步骤S010收集的浓醋液放入陈酿缸中，露天陈酿至少12个月，得到九曲香酯醋。
上述谷物原料包括但不限于禾谷类、豆菽类和薯类，优选为禾谷类，如高粱、大米、小米和小麦等。
经检测，通过上述方法制得的九曲香酯醋的的酸度不低于9.0g/100mL，多糖含量不少于96.0mg/g，多肽含量不少于58.8mg/g，游离氨基酸总量不少于4.21mg/g，生物总黄酮含量不少于5.60mg/g，多酚含量不少于6.75mg/g。
所述九曲香酯醋物质成分丰富，还含有阿魏酸、γ-氨基丁酸、川芎嗪、儿茶素、表儿茶素等活性成分。
所述九曲香酯醋醋膏为九曲香酯醋陈放至少一年以上自然形成的半固态或固态的醋膏。
其中半固态是指醋膏的状态介于液体流动状和固体状之间的状态。
其中，所述九曲香酯醋醋膏中的多糖含量不少于140.5mg/g，多肽含量不少于135.6mg/g，生物总黄酮含量不少于16.5mg/g，干物质含量不少于380mg/g。
所述九曲香酯醋与九曲香酯醋醋膏中微生物丰富，所含微生物数量不少于107个/ml。
本发明实施例中，采用名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏为提取菌体的原料，原料中含有丰富的微生物，提取得到的多菌种组合物中菌体种类丰富；
且在制备过程中对微生物进行灭活，使得本发明实施例制备得到的免疫调节作用的疫苗失去致病性，但其仍携带抗原，可以刺激免疫系统产生抗体，发挥免疫调节作用；
本发明实施例制备得到的免疫调节作用的疫苗，作为多免疫源可以刺激机体产生免疫反应，可以激活多种免疫途径，产生广谱的抗菌效果。
其中，步骤S102，具体包括，
将所述的多菌种组合物，分别置于一种或两种以上的培养基中进行培养；其中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、沙氏培养基、高氏培养基、察氏培养基、尿素培养基、血琼脂平板培养基、肠道杆菌培养基、罗氏培养基、牛心脑浸液培养基或MRS培养基，但不限于上述培养基，还可以是任一适合培养所述多菌种组合物的培养基。
本发明实施例可以将所述多菌种组合物置于不同的培养基中进行培养，对多菌种组合物中的菌体进行复苏、富集培养，在不同的培养基中扩培不同数量和种类的菌体。
具体地，所述培养的温度为20℃～45℃，培养的时间为1天～30天。
其中，步骤S103，具体包括，
将培养得到的微生物用质量份数为0.8％～1.0％的氯化钠溶液进行冲洗，冲洗后过滤、纯化、灭活处理，得到多菌种全菌体抗原原液；
具体地，所述灭活的方式为高温灭活、化学试剂灭活、辐射灭活、超声破碎或高压均质破碎中的一种或两种以上方式的组合。灭活方式具体可以采取高温高压灭活，也可以采取紫外线灭活的方式。
灭活处理后，所述的具有免疫调节作用的疫苗失去致病性，但是仍携带抗原，能够刺激免疫系统产生抗体，在医学和生物学上有很大利用价值。
如，被灭活处理的细小棒状杆菌和百日咳杆菌可以增强巨噬细胞功能和抗肿瘤反应；
被灭活处理的金黄色葡萄球菌能诱导人体或动物体的成骨细胞大量分泌白细胞介素-6(Interleukin-6，缩写IL-6)、白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)和单核细胞趋化蛋白-1等免疫炎性因子，诱导成骨细胞膜表面表达主要组织相容性复合体Ⅱ和分化抗原簇40等免疫反应受体，诱导激活成骨细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体、I型跨膜蛋白质(Toll-like receptors，缩写TLR，也称为Toll样受体)及丝裂原活化蛋白激酶等免疫反应通路，参与免疫反应；
被灭活处理的乳杆菌，其表面成分如脂磷壁酸、细胞壁肽聚糖、细胞表面蛋白等作为配体被受体识别后，激活免疫信号通路，诱导宿主产生免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，缩写lgA)和有益细胞因子如白细胞介素-1(Interleukin-1，缩写IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)；而在受到抗原刺激时会大量分泌免疫球蛋白，免疫球蛋白是具有抗体活性的球蛋白，可促进吞噬细胞活性，提高机体非特异性免疫调节，同时增强T细胞和B淋巴细胞对抗原的应激性，显著增加血清中免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，缩写IgM)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，缩写IgA)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)的水平，使机体更好的抵御外来感染；
被灭活处理后的立克次氏体感染小鼠后，在其肺组织的上清液体中能够获得干扰素，干扰素不仅能够抑制立克次氏体在小鼠中的繁殖，还能使受感染小鼠发热期缩短，体重下降减缓，缓解感染症状，并且一般经感染后，可获得持久免疫。
且菌体在经灭活处理后，也可以导致其细胞结构破裂，释放菌体中产生的活性成分，如有机酸、蛋白质、细菌素、多糖、抗生素、维生素、激素等。例如：糖多孢红霉菌合成的次生代谢产物，其包括大环内酯类抗生素，大环内酯类抗生素包括红霉素A、红霉素B、红霉素C和红霉素D，这四种红霉素均有抑菌活性。放线菌可以产生多种不同类别抗生素，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、大环内酯类、四环素类、多烯类和烯二炔类等，具有广泛的抗菌、抗肿瘤活性。枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中丝氨酸纤溶性蛋白酶和脂肪酶具有改善血液循环、软化血管等作用。子囊菌中的烟曲霉合成的次级代谢产物中的活性成分主要存在于细胞内，有一定的抗菌和抗肿瘤活性。
其中，步骤S104中，所述的具有免疫调节作用的疫苗包括灭活菌体，所述灭活菌体的数量为105～1010个/mL。所述注射用聚山梨酯80的体积百分比为0.01％～0.2％；所述氯化钠的重量百分比为0.8％～1.0％。
本发明实施例另一方面提供了一种具有免疫调节作用的疫苗，由上述各实施例中的任一实施例所述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法制备获得。
具体地，所述的具有免疫调节作用的疫苗包括多菌种组合物，所述多菌种组合物包括立克次氏体目、放线菌属、链霉菌属、短杆菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、葡萄球菌属、糖多孢菌属、小球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母目、黑孢属、青霉属、曲霉属、毛霉属、木霉属、镰孢霉属、嗜热真菌属中的一种或两种以上。
所述的具有免疫调节作用的疫苗包括灭活菌体，所述灭活菌体的数量为105～1010个/mL。
本发明实施例提供的具有免疫调节作用的疫苗用于人或动物时，可以采用静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射等方式。
本发明实施例又一方面提供了一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法，包括以下步骤：
S201、将上述实施例所述的具有免疫调节作用的疫苗注射至免疫动物内；
S202、从免疫动物中取血、分离血清、纯化抗血清，得到具有免疫调节作用的多抗血清注射剂。
其中，所述免疫动物为兔子、绵羊、马、猪、驴、奶牛、豚鼠或鸡。
具体，步骤S201中，将所述的具有免疫调节作用的疫苗注射至免疫动物内的方式可以为皮下注射法、皮内注射法、肌肉注射法、腹腔注射法、多点注射法或静脉注射法；其中免疫动物的免疫剂量为0.2～3.0ml/只。
本发明实施例另一方面提供了一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，由上述各实施例中的任一实施例所述的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法制备获得。
本发明实施例提供的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，用于人或动物时，可以采用静脉注射的方式。
本发明制备得到的具有免疫调节作用的疫苗和多抗血清注射剂均可用于由于人体或动物体的机体免疫功能低下引起的病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫病等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
一种具有免疫调节作用的疫苗，由以下制备步骤制备得到：
S301、分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、MRS培养基，将上述各培养基于121℃下灭菌30分钟后备用；
S302、于无菌条件下，取10g发酵醋醅加入90mL无菌水中，混合摇匀，自然沉淀后取上清；
S303、分别在牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、MRS培养基接种上述上清液样品，接种后分别将牛肉膏蛋白胨培养基置于35～38℃环境下培养，麦芽汁培养基置于28～32℃环境下培养，马铃薯培养基置于25～32℃环境下培养，MRS培养基置于32～40℃环境下培养；
上述培养基培养2～15天后收集扩培的菌体；
S304、将步骤S303收集的菌体，用0.8～1.0％的NaCl溶液进行多次冲洗、离心并收集菌体，混合后重悬于NaCl溶液，将收集的菌悬液在121℃下进行灭活处理30min，获得多菌种全菌体抗原原液；
S305、将注射用聚山梨酯80、氯化钠溶液和注射用水混合，过滤配制成稀释液，稀释液中聚山梨酯80的体积百分比是0.01％-0.2％，氯化钠溶液的重量百分比是0.8％～1.0％；
S306、将多菌种全菌体抗原原液与稀释液混合，灌封在清洁灭菌后的安瓿瓶中，终端灭菌检漏后，获得所述具有免疫调节作用的疫苗；其中，所述具有免疫调节作用的注射剂中灭活菌体数量为105～1010个/mL。
实施例2
一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，由以下制备步骤制备得到：
S401、选取健康纯种的新西兰大白兔，免疫前采血作为阴性对照。采用实施例1制备的所述具有免疫调节作用的疫苗免疫大白兔，在兔皮内多点注射进行初次免疫，免疫剂量为0.5mL/次；
在初次免疫后，以皮下多点注射方式加强免疫4次，分别于初次免疫后第7天、第14天、第21天、第28天加强免疫；
其中初次免疫加注0.5mL完全福氏佐剂，之后每次加强免疫时加注0.5mL福氏不完全佐剂。
S402、第31天从免疫兔子的耳缘静脉采血，分离血清，间接斑点ELISA检测法检测血清中抗体的效价以考察免疫效果，抗体的效价(titer)是评价抗体性能的一个重要指标，是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标。效价即为抗血清经过一系列稀释与定量的抗原反应，当阳性抗血清吸光度值大于2.1倍阴性血清的对照吸光度值时抗血清的稀释倍数。
当免疫兔子抗体的效价达到最高时，颈动脉放血大量采血，高速离心机11000rpm离心10min，取上清液分装，获得多抗血清；
S403、选用饱和硫酸铵对步骤S402获得的多抗血清进行盐析法纯化，然后采用层析法进一步纯化，获得具有免疫调节作用的多抗血清注射剂。
实施例3
动物实验，考察实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗以及实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，对免疫调节的作用。
1、实验方法
选取BALB/c小鼠，雌雄各半。
分别将雌性小鼠随机分组，将雄性小鼠随机分组，共分为空白对照组、模型组、疫苗组、多抗血清注射剂组及阳性对照组，每组10只小鼠，每组包含5只雄性小鼠和5只雌性小鼠。
其中，空白对照组，尾静脉注射0.1mL/10g无菌生理盐水，每日1次，注射10日。
模型组，第1～3日腹腔注射环磷酰胺注射液75mg/kg；第4～10日尾静脉注射0.1mL/10g生理盐水，每日1次。
疫苗组，第1～3日给予环磷酰胺注射液75mg/kg；第4～10日尾静脉注射0.1mL/10g实施例1制备的具有免疫调节作用的疫苗，每日1次。
多抗血清注射剂组，第1～3日给予环磷酰胺注射液75mg/kg；第4～10日尾静脉注射0.1mL/10g实施例2制备的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，每日1次。
阳性对照组，第1～3日腹腔注射环磷酰胺注射液75mg/kg；第4～10日给予0.2mg/kg胸腺素α1，每日1次。
2、检测指标
于末次给药次日，分别精确称量空白对照组、模型组、疫苗组、多抗血清注射剂组及阳性对照组的小鼠体重，眼球取血后处死，取脾脏用滤纸吸干脏器表面液体并称重，并计算胸腺和脾脏指数。
按如下公式计算：脾脏指数＝脾脏质量(mg)/体重(g)；
胸腺指数＝胸腺质量(mg)/体重(g)。
分别取空白对照组、模型组、疫苗组、多抗血清注射剂组及阳性对照组的小鼠眼球眼静脉丛血液0.5～1ml，将所取的血液在室温静止放置2h，离心2000g×20min，收集血清，分装在-20℃备用。按照酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA)的检测试剂盒要求测定血清中白细胞介素-2(Interleukin-2，缩写IL-2)，白细胞介素-6(Interleukin-6，缩写IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10，缩写IL-10)、白细胞介素-12(Interleukin-10，缩写IL-12)及干扰素α(IFN-α)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子kappaB(NFkappaB)的水平。
3、实验结果
3.1对小鼠体重及脏器指数的影响
如表1结果所示，与空白对照组相比，模型组小鼠的脾脏指数显著降低，胸腺指数也有所下降，可见注射环磷酰胺成功引起小鼠的免疫抑制；而与模型组相比，疫苗组、多抗血清注射剂组及阳性对照组均能引起小鼠脾脏指数、胸腺指数显著增加。可见本发明实施例1所制备的具有免疫调节作用的疫苗和实施例2所制备的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，均可以通过脾脏、胸腺调节小鼠的免疫功能。
表1
| 组别 | 脾脏指数mg/g | 胸腺指数mg/g |
| 空白对照组 | 4.52±0.27 | 4.85±0.30 |
| 模型组 | 3.29±0.11 | 3.67±0.22 |
| 疫苗组 | 4.31±0.20 | 4.19±0.16 |
| 多抗血清注射剂组 | 4.07±0.15 | 4.36±0.15 |
| 阳性对照组 | 4.23±0.19 | 4.18±0.27 |
3.2对小鼠免疫相关因子的影响
细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的、能够调节细胞功能的小分子多肽，在免疫应答过程中，细胞因子能够调节细胞间相互作用，参与免疫调节和炎症的发展。
采用ELISA检测法检测血清中免疫调节因子水平，包括白介素家族中的IL-2、IL-6、IL-10、IL-12以及IFN-α、IFN-γ、TNF-α和NFkappaB。
结果如表2、表3所示，表2和表3的结果表明，本发明实施例1所制备的具有免疫调节作用的疫苗、实施例2所制备的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，对环磷酰胺引起的免疫力低下的反应有一定的消除作用。
其中，白介素家族是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，调节免疫系统细胞的增殖、分化和功能。
表2和表3的结果表明，造模后的小鼠注射实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗、或造模后的小鼠注射实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂后，都能逆转环磷酰胺诱导的IL-2、IL-6、IL-10、IL-12等细胞因子的异常分泌作用。
干扰素α、干扰素γ具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，干扰素α的免疫调节作用很强，具有增强免疫对病毒感染细胞的免疫杀伤活性、增强巨噬细胞的吞噬功能和细胞毒活性，干扰素γ激活抗原提呈细胞，通过上调转录因子T-bet而促进I型辅助T细胞(Th1细胞)的分化。
与对照组相比，模型组小鼠的干扰素α、干扰素γ均有一定程度的降低，而通过注射实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗或注射实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂后，小鼠的干扰素α、干扰素γ含量有所回升，并且其含量高于阳性对照组。
TNF-α能导致关节炎症和软骨破坏，诱导其他炎性细胞因子的释放，介导感染和败血症，参与肿瘤监视等。与对照组相比，模型组小鼠的TNF-α显著升高，而通过注射实施例1制备得到的实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗或注射实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂后，TNF-α的含量降低恢复正常。
表2
表3
实施例4
动物实验，考察实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗以及实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的体内体外抗菌活性。
1、实验方法
1.1体内抑菌试验
选取健康ICR小鼠，雌雄各半，4周龄，平均体质量20g，适应性饲养3天后用于实验。
将ICR小鼠随机分组为空白对照组1，模型组，药物组；
其中模型组分为模型组1(绿脓杆菌)、模型组2(肺炎杆菌)、模型组3(沙门氏菌)；药物组分为疫苗组1、多抗血清注射剂组1、疫苗组2、多抗血清注射剂组2、疫苗组3、多抗血清注射剂组3；
其中，空白对照组1，模型组1(绿脓杆菌)、疫苗组1、多抗血清注射剂组1、模型组2(肺炎杆菌)、疫苗组2、多抗血清注射剂组2、模型组3(沙门氏菌)、疫苗组3、多抗血清注射剂组3，每组20只，每组包含10只雌性ICR小鼠和10只雄性ICR小鼠。
空白对照组1小鼠不做处理，其余各组小鼠分别用感染菌株悬浮于生理盐水和5％粘蛋白溶液进行腹膜感染；模型组1(绿脓杆菌)、疫苗组1、多抗血清注射剂组1采用绿脓杆菌进行腹膜感染；模型组2(肺炎杆菌)、疫苗组2、多抗血清注射剂组2采用肺炎杆菌进行腹膜感染；模型组3(沙门氏菌)、疫苗组3、多抗血清注射剂组3采用沙门氏菌进行腹膜感染；药物组的小鼠在腹膜感染15min、6h后分别尾静脉注射给药，模型组的小鼠感染后，分别在尾静脉注射等量的生理盐水，观察7天内小鼠的生存数量与生存状态。
1.2体外抑菌试验
分别在培养基上接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，37℃培养7～8h后，分别吸取实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗以及实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，滴入平板内磁环，继续过夜培养观察抑菌圈。
2、实验结果
2.1小鼠体内抑菌试验结果
在整个试验周期内，空白对照组1的小鼠均正常，毛色有光泽；模型组的小鼠精神状态萎靡不振，缺乏活力，进食量和饮水量都较少，死亡率较高；药物组的小鼠精神状态轻度萎靡活力较低，随着时间延长，大部分逐渐会恢复，精神状态有所好转，进食和饮水量都有所增加，过程中有部分小鼠死亡。
如表4结果所示，与模型组相比，药物组的小鼠死亡率显著降低，说明实施例1制备得到的具有免疫调节作用的疫苗以及实施例2制备得到的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂均具有预防和治疗绿脓杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌等致病菌感染的效果。
表4
2.2体外抑菌试验结果
表5为大肠杆菌的抑菌实验结果表，从表5可知，氨苄青霉素组作为阳性对照组可以观察到的抑菌圈较小，疫苗组1和多抗血清注射剂组1具有明显的抑菌作用，其中多抗血清注射剂组1的抑菌圈最大，抑菌作用最强。
表6为金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果表，从表6可知，氨苄青霉素组作为阳性对照组未观察到抑菌圈，而疫苗组2和多抗血清注射剂组2均观察到明显的抑菌圈，其中多抗血清注射剂组2的抑菌圈最大，抑菌作用最强。
表5
| 组别 | 抑菌圈大小/cm |
| 氨苄青霉素组 | 1.9 |
| 疫苗组1 | 2.6 |
| 多抗血清注射剂组1 | 4.1 |
表6
| 组别 | 抑菌圈大小/cm |
| 氨苄青霉素组 | 0 |
| 疫苗组2 | 1.3 |
| 多抗血清注射剂组2 | 3.5 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
从名酒大曲、发酵酒醅、发酵醋醅、熏醅、九曲香酯醋或九曲香酯醋醋膏中提取多菌种组合物；
培养所述多菌种组合物，收集培养得到的微生物；
将培养得到的微生物依次经冲洗、过滤、纯化、灭活处理，得到多菌种全菌体抗原原液；
混合所述多菌种全菌体抗原原液、氯化钠溶液、注射用聚山梨酯80和注射用水，配置成所述具有免疫调节作用的疫苗；
其中，所述九曲香酯醋为在酒精发酵中利用了名酒大曲菌系制得的原浆醋；
所述九曲香酯醋醋膏为所述九曲香酯醋陈放至少一年以上形成的半固态或固态的醋膏；
所述发酵酒醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的酒醅；
所述发酵醋醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的醋醅；
所述熏醅为所述九曲香酯醋酿造过程中产生的熏醅产物。
2.根据权利要求1所述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，其特征在于，所述培养所述多菌种组合物的步骤，包括：
将所述的多菌种组合物，分别置于一种或两种以上的培养基中进行培养；其中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、沙氏培养基、高氏培养基、察氏培养基、尿素培养基、血琼脂平板培养基、肠道杆菌培养基、罗氏培养基、牛心脑浸液培养基或MRS培养基。
3.根据权利1所述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为20℃～45℃，培养的时间为1天～30天。
4.根据权利1所述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活的方式为高温灭活、化学试剂灭活、辐射灭活、超声破碎或高压均质破碎中的一种或两种以上方式的组合。
5.一种具有免疫调节作用的疫苗，其特征在于，由权利要求1～4任一权利要求所述的具有免疫调节作用的疫苗的制备方法制备获得。
6.根据权利要求5所述的具有免疫调节作用的疫苗，其特征在于，所述的具有免疫调节作用的疫苗包括多菌种组合物，所述多菌种组合物包括立克次氏体目、放线菌属、链霉菌属、短杆菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、葡萄球菌属、糖多孢菌属、小球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母目、黑孢属、青霉属、曲霉属、毛霉属、木霉属、镰孢霉属、嗜热真菌属中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的具有免疫调节作用的疫苗，其特征在于，所述的具有免疫调节作用的注射剂包括灭活菌体，所述灭活菌体的数量为105～1010个/mL。
8.根据权利要求5所述的具有免疫调节作用的疫苗，其特征在于，所述注射用聚山梨酯80的体积百分比是0.01％-0.2％。
9.一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求5～8任一权利要求所述的具有免疫调节作用的疫苗注射至免疫动物内；
从免疫动物中取血、分离血清、纯化抗血清，得到具有免疫调节作用的多抗血清注射剂。
10.一种具有免疫调节作用的多抗血清注射剂，其特征在于，所述的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂由权利要求9所述的具有免疫调节作用的多抗血清注射剂的制备方法制备获得。
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