CN112067714B - 一种测定花生油中花生油香精的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定花生油中花生油香精的方法,以2,3,5‑三甲基吡嗪作为花生油中花生油香精掺伪的定量标记化合物,本底值为618μg/L。使用顶空气相色谱‑飞行时间质谱测定花生油中的花生油香精,回归方程为:Y=338.992X‑453.751,线性相关系数(r 2 )为0.997,测定低限为26.507μg/L。测定低限、本底值、5000μg/L三水平的精密度分别为8.650%、2.134%、1.328%,加标回收率范围分别为82.141%~101.814%、92.602%~97.048%、93.095%~96.451%,为花生油的原料采购、企业生产、质量控制和市场监管提供一定的应用价值和技术支持,更为其他类的植物油的香精类掺伪问题提供可行的参考。
Description
技术领域
本发明属于食品检验检测领域,具体涉及一种测定花生油中花生油香精的方法。
背景技术
花生油风味独特,营养价值丰富,是中国百姓理想的烹饪用植物油。花生油在我国的消费量居世界第一,是第四大植物油。由于花生原料价格较高,导致花生油价格普遍偏高。近年来,不法商贩利用花生油掺伪来谋取暴利的行为屡见不鲜,其中,使用香精类的花生油掺伪行为尤为多见。主要形式有以下两种:一种是将品质不好的花生油加入花生油香精达到增香的目的,进而提高花生油的感官品质,以次充好;还有一种是将价格低廉气味不显著的大豆油加入花生油香精,混合或不混合花生油,伪装成纯品花生油进入市场销售来谋取利益,以假乱真。其中,尤以第二种掺伪方式获利较高。目前,还未有相关的检测技术,由此可见,建立一个判断花生油是否进行了花生油香精的掺伪的测定方法是解决问题的关键,也是形势所驱。
发明内容
研究表明,花生油的独特味道主要来自其特有的挥发性成分,而花生油香精也正是通过模拟花生油的这种特有的挥发性味道配制而成。也就是说,解决问题的关键就是找出花生油香精中挥发性成分有别于花生油和大豆油的标记化合物。顶空气相色谱-质谱正是分析挥发性成分的常用技术手段之一。本发明采用顶空气相色谱-飞行时间质谱结合化学计量学分析的组学分析方法对花生油中是否存在使用花生油香精进行掺伪的问题进行分析研究,确定出测定最为稳定的标记化合物,并通过大量样本计算其本底值,进而建立花生油中该标记化合物的测定方法并进行方法学技术要求确认,为花生油中是否存在使用花生油香精进行掺伪的判断提供一种可行的测定方法,也为花生油的原料采购、企业生产、质量控制和市场监管提供一定的应用价值和技术支持。为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种测定花生油中花生油香精的方法,以2,3,5-三甲基吡嗪作为花生油中花生油香精掺伪的定量标记化合物,2-乙酰噻唑、乙酰吡嗪和2-乙酰基吡啶作为定性标记化合物参考使用。测定低限为26.507μg/L,本底值为618μg/L。
进一步测定方法具体为:
顶空进样条件:样品质量:5 g,样品加热温度:60 ℃,进样加热箱温度:80 ℃,样品加热时的搅拌器转速:250 r/min,样品加热平衡时间:30 min,采集时间:24 min,进样量:1.5 mL。
色谱条件:气相色谱柱:DB-WAX 122-7032柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm,美国安捷伦科技有限公司),升温程序:初始温度50 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升温至240 ℃,保持2 min,进样口温度250 ℃,进样模式:脉冲分流,脉冲压力35.342 psi,分流比:10:1,持续时间:0.5 min,载气:高纯氦气,恒流流速:1 mL/min。
质谱条件:辅助传输线温度:250 ℃,电离模式:EI源,扫描模式:TOF 扫描和目标MS/MS 扫描,质量扫描范围:m/z 40~800,溶剂延迟时间:0 min,采集速率:3.00 spectra/s。2,3,5-三甲基吡嗪特征离子122.0841。
用大豆油稀释2,3,5-三甲基吡嗪标准物质,制作浓度梯度分别为10、30、100、500、1000、5000、10000、20000、50000μg/L的标准曲线并使用合适的条件检测,得出标准曲线的回归方程为:Y=338.992X-453.751,线性相关系数(r 2 )为0.997。平行测定20次大豆油的2,3,5-三甲基吡嗪空白值,根据GB/T 27404-2008计算得出测定低限为26.507μg/L。变异系数<8.6%,回收率范围60-120%。
有益效果
本发明采用顶空气相色谱-飞行时间质谱对花生油、大豆油和使用花生油香精进行掺伪的大豆油的挥发性成分进行采集,结合化学计量学分析的组学分析方法对数据进行逐步过滤和分析研究,确定出响应强度高、线性关系好、定量准确性高、检测相对最为稳定的差异化合物2,3,5-三甲基吡嗪作为花生油中花生油香精掺伪的定量标记化合物,2-乙酰噻唑、乙酰吡嗪和2-乙酰基吡啶作为定性标记化合物参考使用。
确定了本底值,用于判断植物油中是否掺有花生油香精。
本发明确定的测定花生油中花生油香精的方法具有操作简单方便、快速、准确、无需化学试剂、绿色环保、省时省力等优点,且所需仪器设备少、成本低、效率高,为香精类的花生油掺伪判断提供一种可行的检测方法,也为花生油的原料采购、企业生产、质量控制和市场监管提供一定的应用价值和技术支持,更为其他类的植物油香精类掺伪提供可行方案的参考。
附图说明
图1.花生油、大豆油、添加花生油香精的植物油特征标记物轮廓图。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的详细说明。
实验部分
1.1 仪器和材料
Agilent 7890B-7250型气相色谱-飞行时间串联质谱仪(Q-TOF GC/MS)、AgilentCombiPAL RSI 85型全自动三位一体进样器、Agilent MassHunter Qualitative AnalysisNavigator软件、Agilent MassHunter Profinder定性分析软件、Agilent Mass ProfilerProfessional(MPP)化学计量学组学差异化分析软件(美国安捷伦科技有限公司);METTLERTOLEDO AL204型电子天平(瑞士梅特勒托利多仪器有限公司);美国国家标准与技术研究院(NIST)谱库。
20mL顶空螺口进样瓶(美国安捷伦科技有限公司);50mL离心管(广州洁特生物过滤股份有限公司)。
2,3,5-三甲基吡嗪纯度标准物质(标准值99.7%,国家标准物质中心)。
1个大豆油(Soybean oil)和26个花生油(Peanut oil)购于厂家,6个花生油(Peanut oil)实际样品购于市场,6 个花生油香精(Peanut oil flavor)购于网络。
样品前处理
每个样品取5g,置于20mL顶空螺口进样瓶中,用Q-TOF GC/MS进行分析。
掺伪花生油样品制备:考不同种类的花生油香精最佳使用浓度范围,制定合适的浓度梯度,用大豆油稀释花生油香精到适合的浓度,在50 mL离心管中混和均匀,备用。选取10位评鉴员,独立进行嗅觉检验法的感官实验,评选出最适应普遍嗅觉系统的浓度值,也就是最接近日常销售花生油嗅觉的浓度值。
检测条件
1.3.1 顶空进样条件
样品质量:5 g,样品加热温度:60 ℃,进样加热箱温度:80 ℃,样品加热时的搅拌器转速:250 r/min,样品加热平衡时间:30 min,采集时间:24 min,进样量:1.5 mL。
色谱条件
气相色谱柱:DB-WAX 122-7032柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm,美国安捷伦科技有限公司),升温程序:初始温度50 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升温至240 ℃,保持2 min,进样口温度250 ℃,进样模式:脉冲分流,脉冲压力35.342 psi,分流比:10:1,持续时间:0.5min,载气:高纯氦气,恒流流速:1 mL/min。
质谱条件
辅助传输线温度:250 ℃,电离模式:EI源,扫描模式:TOF 扫描和目标MS/MS 扫描,质量扫描范围:m/z 40~800,溶剂延迟时间:0 min,采集速率:3.00 spectra/s。
标记化合物确立的工作流程
使用Q-TOF GC/MS在TOF扫描模式下按上述1.3节的测定条件采集样品原始数据,使用Agilent MassHunter Profinder 定性分析软件中分子特征峰查找算法(MFE)对采集到的数据进行提取,进行找峰解析,得到挥发性成分的解析结果,包括谱库含有的成分和谱库不包含的成分,并导出为cef 文件。将这个cef 文件导入到Agilent Mass ProfilerProfessional(MPP)化学计量学组学差异化分析软件中,对样品进行分组,再进行数据过滤、方差分析、主成分分析(PCA),以查找3组样品中具有显著变化的化合物。根据数据稳定性的条件筛查结果,最后选定一个具有显著变化的化合物为标记化合物,利用NIST 谱库鉴定标记化合物。对标记化合物的检测条件进行优化,再进行方法学技术要求确认,确定出该方法的标准曲线回归方程、相关系数(r 2 )值、检出限、定量限、精密度、加标回收率和本底值。由此建立一个使用顶空气相色谱-飞行时间质谱测定花生油中使用花生油香精情况的方法。
结果与讨论
2.1 掺伪花生油中香精浓度的优化
6种花生油香精标签上的最佳使用浓度范围和制定的合适的浓度梯度参见表1,10位参与食品感官品评独立对不同浓度的花生油香精进行感官实验的评判,选择最接近日常销售的花生油嗅觉的浓度,得票最高的浓度值就是感官实验最终确定的该花生油香精的最佳使用浓度值。由表1可知,6种花生油香精的最佳使用浓度值分别为0.3%、0.5%、1%、1%、0.3%、0.3%。
表1 花生油香精的感官实验表
2.2 确立标记化合物
植物油的挥发性成分是影响植物油感官的重要因素。挥发性成分中含有数千种化合物,因而需要合适的分离条件来提高实验的灵敏度和分离度,只有尽可能准确的分离出这些化合物才能保证寻找到理想的标记化合物。将大豆油、花生油和配置好的含有特定浓度的花生油香精的掺伪大豆油样品按1.3节方法随机检测。使用Q-TOF GC/MS在TOF扫描模式下采集原始数据,对数据进行重现性检查,发现保留时间(RT)和质荷比(m/z)的相对偏差分别低于0.5%和10ppm,说明这些原始数据用于后续的分析是可行的。3种植物油在色谱峰数量、保留时间、峰面积大小上都有所不同,这为后续进一步分析的可能性提供依据。
将这些数据导入Agilent MassHunter Profinder 定性分析软件,进行MFE提取,设置峰高≥300,报告使用化合物峰数≥1,对齐的保留时间偏差0.1 min,MFE得分≥70,高分辨质荷比偏差50。以上总共从植物油的挥发性成分中提取到4000多个化合物。将cef文件导入MPP化学计量学组学差异化分析软件中,设置最小绝对丰度为5000计数,所需离子数≥1,保留时间偏差0.05 min,匹配因子0.3,质荷比偏差0.005。通过分组后的比对,得到植物油挥发性成分的2317个条目。
此后依次进行出现频率过滤(至少一个组≥80%)、方差分析过滤(ANOVA,P≤0.01)、倍数变化过滤(FC≥2)。在含有花生油香精的掺伪大豆油与花生油比较上调的条目中,得到23个在3个样品组之间具有显著性差异的条目,再进行样品变异性过滤(至少两个组<10%),最终保留了15个在使用花生油香精进行掺伪的大豆油中与花生油和大豆油具有显著性差异的条目。
PCA得分图可用于查看复杂数据结构的数学算法,能直观的反应出样品之间的相似性和差异性。经过以上过滤,其最高三个维度即三个主成分的总协方差和为85.51%,掺伪油与花生油和大豆油在X轴上得到明确区分,这表明15个差异条目可用作标记化合物来区分掺伪油与花生油和大豆油。
需要说明的是,掺伪油的极限情况是不含有花生油,仅含有大豆油和花生油香精,针对大豆油中丰度较高的条目为背景,在过滤中需要扣除。最终的15个条目需要满足以下条件:一是在掺伪油中的丰度与花生油和大豆油具有显著性差异,二是花生油中的丰度与掺伪油和大豆油具有显著差异的不在寻找范围内,因为掺伪还存在掺入一定量花生油的情况。最终的15个条目并不是仅存在于掺伪油中即花生油香精中的,而是掺伪油中的丰度与花生油和大豆油具有显著性差异的。
表2是过滤后15个目标条目中得分超过65分的10个比对NIST谱库得到的目标化合物检索信息,表中条目的得分越高说明与NIST谱库中的化合物越接近。按照得分高低,前四位分别是2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙酰噻唑、乙酰吡嗪和2-乙酰基吡啶(又名1-(2-吡啶基)乙酮)。
表2 得分超过65分的10个比对NIST谱库得到的目标化合物检索信息
目标化合物比对NIST谱库后的得分高低、箱线图分散性大小,并不能完全成为确立目标化合物的仅有数据,化合物在对齐期间还存在条目标注错误以及统计分析期间结果假阳性的可能,此时需要提取采集的原始数据信息来验证所选的目标化合物是真实存在的化合物。由图1可知2,3,5-三甲基吡嗪的提取色谱图在3种植物油的峰面积上差异较为明显,虽在花生油中存在,但在6种花生油香精掺伪的植物油中均存在,且差异较大。通过以上分析,将目标化合物2,3,5-三甲基吡嗪确立为最终的定量标记化合物。
目标化合物的方法学验证
用大豆油稀释2,3,5-三甲基吡嗪标准物质,制作浓度梯度分别为10、30、100、500、1000、5000、10000、20000、50000μg/L的标准曲线并使用合适的条件检测(参照1.3节),得出标准曲线的回归方程为:Y=338.992X-453.751,线性相关系数(r 2 )为0.997。平行测定20次大豆油的2,3,5-三甲基吡嗪空白值,根据GB/T 27404-2008计算得出测定低限为26.507μg/L。
由于2,3,5-三甲基吡嗪在花生油中也是广泛存在的,测定花生油中2,3,5-三甲基吡嗪的本底值就是检测方法建立的关键一环。测定26个花生油的2,3,5-三甲基吡嗪的响应值,带入标准曲线得出浓度值的平均值为253.948μg/L,计算26个数据的3倍标准偏差与斜率(3*SD/k)的比值为363.940μg/L,用两者之和表征花生油的2,3,5-三甲基吡嗪拟定本底值,本底值为618μg/L。对拟定本底值和花生油中2,3,5-三甲基吡嗪的含量进行t检验分析,结果显示t=13.42>2.09(t0.025/19),P<0.05,说明在95%置信水平下,拟定本底值和26个花生油中2,3,5-三甲基吡嗪的含量差异显著,也就是说,拟定的本底值具有代表性。测定6个含有花生油香精的掺伪植物油中2,3,5-三甲基吡嗪的浓度值,计算所得平均值为5458.601μg/L,标准偏差为3465.126μg/L,平均值约为花生油平均值的21.5倍,约为拟定本底值的8.8倍。
根据GB/T 27404-2008,选取测定低限、本底值、5000μg/L三个水平进行重复6次的2,3,5-三甲基吡嗪浓度值测定,计算得出变异系数参见表3,以上精密度的数据均符合GB/T27404-2008的方法学要求。对以上三个水平的数据计算加标回收率,回收率范围参见表3,均符合GB/T 27404-2008的方法学要求。
表3 2,3,5-三甲基吡嗪的精密度和加标回收率
水平 | 精密度 /% | 精密度标准要求 /% | 回收率 /% | 回收率标准要求 /% |
检出限 | 8.650 | 15 | 82.141~101.814 | 60~120 |
本底值 | 2.134 | 11 | 92.602~97.048 | 80~110 |
5000μg/L | 1.328 | 7.5 | 93.095~96.451 | 90~110 |
3.结论
本发明采用顶空气相色谱-飞行时间质谱对花生油、大豆油和使用花生油香精进行掺伪的大豆油的挥发性成分进行采集,结合化学计量学分析的组学分析方法对数据进行逐步过滤和分析研究,确定出响应强度高、线性关系好、定量准确性高、检测相对最为稳定的差异化合物2,3,5-三甲基吡嗪作为花生油中花生油香精掺伪的定量标记化合物,2-乙酰噻唑、乙酰吡嗪和2-乙酰基吡啶作为定性标记化合物参考使用。2,3,5-三甲基吡嗪在花生油中也有一定含量的存在,通过大量花生油样本计算出2,3,5-三甲基吡嗪在花生油中的本底值,进而建立一个通过检测花生油中2,3,5-三甲基吡嗪含量来判断花生油是否进行以2,3,5-三甲基吡嗪为主要增香成分的香精类掺伪的可行的检测方法,并进行方法学技术要求确认。以上检测方法具有可操作性强、试剂使用少、便捷快速、准确性高、应用范围广的优点,为香精类的花生油掺伪判断提供一种可行的检测方法,也为花生油的原料采购、企业生产、质量控制和市场监管提供一定的应用价值和技术支持,更为其他类的植物油香精类掺伪提供可行方案的参考。
Claims (1)
1.一种测定花生油中花生油香精的方法,其特征在于,使用顶空气相色谱-飞行时间质谱测定花生油中的花生油香精,以2,3,5-三甲基吡嗪作为花生油中花生油香精掺伪的定量标记化合物,本底值设定为618μg/L,测定方法具体为:
顶空进样条件:样品质量:5 g,样品加热温度:60 ℃,进样加热箱温度:80 ℃,样品加热时的搅拌器转速:250 r/min,样品加热平衡时间:30 min,采集时间:24 min,进样量:1.5mL;
色谱条件:气相色谱柱:DB-WAX 122-7032柱,升温程序:初始温度50 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升温至240 ℃,保持2 min,进样口温度250 ℃,进样模式:脉冲分流,脉冲压力35.342 psi,分流比:10:1,持续时间:0.5 min,载气:高纯氦气,恒流流速:1 mL/min;
质谱条件:辅助传输线温度:250 ℃,电离模式:EI源,扫描模式:TOF 扫描和目标MS/MS扫描,质量扫描范围:m/z 40~800,溶剂延迟时间:0 min,采集速率:3.00 spectra/s,2,3,5-三甲基吡嗪特征离子:m/z 122.0841;
用大豆油稀释2,3,5-三甲基吡嗪标准物质,制作浓度梯度分别为10、30、100、500、1000、5000、10000、20000、50000μg/L的标准曲线,得出标准曲线的回归方程为:Y=338.992X-453.751,线性相关系数为0.997。
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