CN112057466B - 一种促成骨的地黄多糖混合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种促成骨的地黄多糖混合物及其应用，属于生物医药技术领域。一种促成骨的地黄多糖混合物，由30‑70％重量百分含量的生地黄多糖和30‑70％重量百分含量的熟地黄多糖混合制成。本发明将生地黄多糖和熟地黄多糖按照一定配比混合，得到的地黄多糖混合物具优异的促成骨效果；另外，本发明的制备工艺，操作简单、易于控制、有利于实现规模化工业生产。

Description

一种促成骨的地黄多糖混合物及其应用

技术领域

本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种促成骨的地黄多糖混合物及其应用。

背景技术

骨质疏松是一种常见的全身性骨骼障碍，导致骨的脆性增加，骨折风险升高。据世界卫生组织最新报道，骨质疏松性骨折严重影响个体生活质量，防治骨质疏松症是全球性的重要健康课题。据近期统计，骨质疏松影响了我国超过1/3的50岁以上人群。在防治方面，西医仍缺少药效明确且显著、副作用小的特效药，这已成为亟待解决的难题。中药防治骨质疏松症已有千年的用药经验，效果显著且副作用小，从中深入挖掘具有促成骨作用的抗骨质疏松药效活性物质将有助于解决上述难题。

2015版《中国药典》记载，地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，熟地黄为生地黄的炮制加工品，补血滋明，益精填髓。地黄多糖(Rehmanniaglutinosapolysaccharides)是中药地黄的主要活性组分之一。中医在运用地黄降糖和促成骨方面均积累了丰富的临床经验，如六味地黄丸，由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，具有滋阴补肾功效，对于骨痿或消渴病骨痿有良好的治疗效果；滋肾降糖丸，由黄芪、生地黄、熟地黄、五味子、淫羊藿等组成，具有滋肾养阴、填精生髓的功效，对于1型糖尿病骨质疏松症均具有良好的临床防治效果。

这些经方和临床验方的君药或主要组成均为地黄，而其主要活性成分之一为地黄多糖。与熟地黄比较，生地黄中的地黄多糖总量更高，但是生地黄粗多糖的提取率不及熟地黄，熟地黄加工过程中会发生美拉德反应，可能影响多糖成分，生、熟地黄多糖成分是否有差异尚不十分清楚，据最新报道，生地黄的3个主要寡糖成分，蔗糖受热生成果糖与葡萄糖，棉籽糖受热生成蜜二糖、蔗糖和果糖，水苏糖受热主要生成甘露三糖。单糖和寡糖类成分间的比例变化指标，可作为熟地黄炮制质量量化的判定标准。生地黄在加工炮制成熟地黄时，随着炮制程度加深，糖类物质分解成低聚糖甚至是单糖，这些变化可能是地黄炮制前后药效变化的主要药效物质。生、熟地黄多糖在饮片中均发挥一定的药效。

在促成骨研究方面，补充益生菌鼠李糖乳杆菌或其代谢物丁酸可使幼龄雌性正常小鼠骨髓Treg细胞增多，骨髓中的Treg细胞可介导上调CD8+T细胞中的Wnt10b，进而活化骨髓基质细胞和成骨细胞的Wnt信号通路而促成骨。目前，益生菌鼠李糖乳杆菌和Treg细胞能够通过调节下游Wnt通路而发挥促成骨作用，已成为国际新共识。

补益类中药多糖组分如白术多糖、大豆多糖、党参多糖、黄芪多糖等对益生菌的生长有一定的促进作用。研究表明黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌具有一定的促生长作用，可以提高其在胃肠道中转运时的耐受性；另外，党参多糖也能够促使鼠李糖乳杆菌明显地增殖。

本发明根据上述文献报道，提取生、熟地黄中地黄多糖制备成一种新的地黄多糖混合物，并对其促成骨作用进行研究。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种促成骨的地黄多糖混合物及其应用，该混合物由生地黄多糖和熟地黄多糖按照一定配比混合而成，具有优异的促成骨效果。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种促成骨的地黄多糖混合物，由30-70％重量百分含量的生地黄多糖和30-70％重量百分含量的熟地黄多糖混合制成。

在一个优选的实施例中，所述生地黄多糖的制备方法包括以下步骤：

取生地黄，粉碎，过60-100目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖。

所述熟地黄多糖的制备方法包括以下步骤：

取生地黄，蒸至黑润，60-80℃烘干，粉碎，过60-100目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖。

根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供上述的地黄多糖混合物在制备防治骨质疏松症材料中的应用。

本发明实施例具有如下优点：

本发明将生地黄多糖和熟地黄多糖按照一定配比混合，得到的地黄多糖混合物具优异的促成骨效果；另外，本发明的制备工艺，操作简单、易于控制、有利于实现规模化工业生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明的促进鼠李糖乳杆菌增殖(n＝2)；

图2为本发明的促进鼠李糖乳杆菌的多糖利用率(n＝2)；

图3为本发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠血清骨钙素含量(n＝10)；

图4为本发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠骨髓Treg细胞数量(n＝10)；

图5为本发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠成骨细胞数量(免疫荧光染色)；

图6为本发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠成骨细胞数量(CCK-8法，n＝4)；

图7为发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠股骨最大折断负荷(n＝10)；

图8为发明的增加1型糖尿病骨质疏松小鼠股骨刚度(n＝10)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的促成骨的地黄多糖混合物的制备方法包括：

1)制备生地黄多糖

取生地黄，粉碎，过80目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：30加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖。

2)制备熟地黄多糖

取生地黄，蒸至黑润，60℃烘干，粉碎，过80目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：30加入蒸馏水加热，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到70％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖。

3)上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比2:3混合即可。

实施例2

本实施例的促成骨的地黄多糖混合物的制备方法包括：

1)制备生地黄多糖

取生地黄，粉碎，过100目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：40加入蒸馏水，加热回流提取2次，每次4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至最终乙醇浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖。

2)制备熟地黄多糖

取生地黄，蒸至黑润，70℃烘干，粉碎，过100目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：20加入蒸馏水，加热回流提取2次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖。

3)上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比1:1混合即可。

实施例3

本实施例的促成骨的地黄多糖混合物的制备方法包括：

1)制备生地黄多糖

取生地黄，粉碎，过80目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：20加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至最终乙醇浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖。

2)制备熟地黄多糖

取生地黄，蒸至黑润，60℃烘干，粉碎，过60目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：40加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到70％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖。

3)上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比3:2混合即可。

对比例1

本对比例的促成骨的地黄多糖混合物仅包含生地黄多糖，生地黄多糖的制备方法同实施例1。

对比例2

本对比例的促成骨的地黄多糖混合物仅包含熟地黄多糖，熟地黄多糖的制备方法同实施例1。

对比例3

本对比例的促成骨的地黄多糖混合物与实施例1的不同之处仅在于配比不同。本对比例的促成骨的地黄多糖混合物由生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比1:4混合制成。

对比例4

本对比例的促成骨的地黄多糖混合物与实施例1的不同之处仅在于配比不同。本对比例的促成骨的地黄多糖混合物由生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比9:1混合制成。

测试例1

本测试例考察实施例1-3和对比例1-4的地黄多糖混合物对鼠李糖乳杆菌体外增殖的影响。

配制地黄多糖混合物终浓度为3％的乳酸细菌培养基：称取实施例1-3和对比例1-4的地黄多糖混合物各6g，分别加入200ml的乳酸细菌培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)，调整pH7.0-7.5，121℃灭菌20min，即得终浓度为3％的乳酸细菌培养基。

选择年龄为18-35岁的女性1型糖尿病骨质疏松患者3名，体重指数均在正常范围内，无高血压、结肠炎等其他慢性疾病，无吸烟、饮酒等不良生活习惯，近三个月未服用抗生素以及含地黄的相关药品。

取上述患者晨起新鲜粪便，分别加入灭菌PBS液配成20％(w/v)的悬液，充分混匀，滤过大块物质，制得均匀菌液，采用牛津杯双层平板定量扩散法进行筛选，根据分离菌的形态、染色及生化特性，分离筛选出鼠李糖乳杆菌，然后在乳酸杆菌液体培养基中，37℃培养48h，用酸度计测定乳酸菌培养物的酸碱度等进行验证，并进行后续体外培养，37℃培养18h，连续传代3次备用。以上述配制的地黄多糖混合物终浓度为3％的乳酸细菌培养基分别作为干预处理，以不添加样品的处理作为空白对照，再培养细菌24h。

活菌计数采用稀释平板计数法：分别取1μL上述各组发酵液，对样品进行10倍系列梯度稀释至合适浓度，加入乳酸细菌琼脂培养基中培养48h后计数，测定鼠李糖乳杆菌活菌含量，并换算成菌落形成单位(CFU/ml)。

采用苯酚硫酸法测定总糖含量；采用DNS法测定还原糖含量；多糖浓度的测定：多糖浓度＝发酵液中总糖浓度含量-还原糖浓度含量。

各组活菌数与相应的培养时间作图，得到的生长曲线见图1。结果显示，与培养基中未添加地黄多糖的空白对照以及添加对比例1-4的地黄多糖混合物分别比较，12h后，本发明实施例1-3的地黄多糖混合物均能显著促进鼠李糖乳杆菌增殖，活菌数均值最多为3.75×10⁹CFU/ml。

通过比较发酵前后的糖量变化，对各组的多糖利用率进行计算，结果见图2。结果显示，与空白对照及对比例1-4相比较，4h后，本发明实施例1-3的地黄多糖混合物均能显著提高鼠李糖乳杆菌的多糖利用率，均值最高为73％。

上述结果表明本发明的地黄多糖混合物中生地黄多糖和熟地黄多糖协同增效，两者按照一定的配比混合，能够显著促进鼠李糖乳杆菌利用多糖并加速增殖。

测试例2

本测试例考察实施例1-3和对比例1-4的地黄多糖混合物对1型糖尿病骨质疏松小鼠血清骨钙素的影响。

动物模型建立方法：选取10周龄雄性BALB/C小鼠，连续5天腹腔注射50mg/kg链脲佐菌素STZ(美国Sigma公司)，每次注射前禁食4h，注射完成1周后，尾部取血，使用血糖仪测定空腹血糖，当空腹血糖高于9mmol/L时表明造模成功。

将造模成功的1型糖尿病骨质疏松小鼠随机分为治疗组1-3、对照组1-4和模型组，10只/组，治疗组1-3小鼠分别灌胃实施例1-3的地黄多糖混合物，对照组1-4小鼠分别灌胃对比例1-4的地黄多糖混合物，灌胃量均为80mg/kg，模型组给予等量生理盐水灌胃，持续4周，同时正常小鼠10只作为正常组。于末次给药后1h，水合氯醛麻醉小鼠，腹主动脉取血。采用ELISA法检测各组的血清骨钙素含量。结果见图3。

结果显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清骨钙素显著减少(n＝10)，从血清骨钙素角度说明造模成功；与对照组1-4分别比较，在进行治疗后，本发明治疗组1-3小鼠的血清骨钙素量显著增多，说明本发明实施例的地黄多糖混合物能够促进血清骨钙素的分泌。骨钙素主要是由成熟的成骨细胞分泌的特异性的非胶原蛋白，骨钙素能够反映体内成骨细胞状态，进而说明本发明实施例的地黄多糖混合物具有较好的体内促成骨作用。

采用流式细胞术对上述各组骨髓中Treg进行分选和数量分析，细胞表面CD4染色，细胞内Foxp3染色，按照试剂盒操作流程进行检测。结果见图4。

结果显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠骨髓Treg数量显著减少(n＝10)，从Treg角度说明造模成功；与对照组1-4分别比较，治疗组1-3小鼠骨髓Treg细胞数量显著增加，说明本发明实施例的地黄多糖混合物具有体内促进Treg细胞增殖的促成骨作用。骨髓Treg细胞数量变化趋势与上述血清骨钙素水平的变化趋势一致，说明本发明实施例的地黄多糖混合物对于1型糖尿病骨质疏松小鼠的促成骨作用与增加骨髓Treg细胞数量有关。

我们从上述各组小鼠头盖骨中分离出成骨细胞并原代培养，采用免疫荧光染色法和CCK-8法检测细胞增殖。①采用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞染色试剂盒染色活细胞(黄绿色)和死细胞(红色)，激发波长490nm，倒置荧光显微镜观察细胞数量和状态。②采用CCK-8法检测细胞增殖，每孔加入10μl的CCK-8染色液，4小时后在酶标仪450nm波长下检测。

结果显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠成骨细胞数量显著减少(n＝4)(图6)，从成骨细胞角度说明造模成功；与对照组1-4分别比较，本发明治疗组1-3的小鼠的成骨细胞数量显著增加，说明本发明实施例的地黄多糖混合物具有体内促进成骨细胞增殖的促成骨作用(图5和图6)。这一实验结果既直接观察了本发明实施例的地黄多糖混合物的体内促成骨作用，又进一步验证了本发明实施例的地黄多糖可能通过骨髓中Treg介导Wnt10b/Wnt信号途径发挥促成骨的作用。

最后，我们剥离上述各组小鼠的股骨进行三点弯曲力测试，检测骨生物力学。取各组小鼠的右股骨，使用三点弯曲力测试法，在骨力学测定仪上固定股骨的两端，相距5mm，将力的负荷作用在骨干中点处。检测股骨干刚度及其最大折断负荷。

结果显示，与对照组1-4分别比较，本发明治疗组1-3小鼠的股骨最大折断负荷和刚度显著增加(图7和图8)，从骨生物力学角度验证了本发明实施例地黄多糖混合物的体内促成骨作用效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种促成骨的地黄多糖混合物，其特征在于，由30-70%重量百分含量的生地黄多糖和30-70%重量百分含量的熟地黄多糖混合制成；

所述生地黄多糖与熟地黄多糖的比例为2：3-3：2；

所述生地黄多糖的制备方法包括以下步骤：

取生地黄，粉碎，过60-100目筛，得生地黄粉，按料液比（g/ml）1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4 h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90%，静置12 h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12 h，即得生地黄多糖；

所述熟地黄多糖的制备方法包括以下步骤：

取生地黄，蒸至黑润，60-80℃烘干，粉碎，过60-100目筛，得熟地黄粉，按料液比（g/ml）1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4 h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90%，静置12 h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖。

2.权利要求1所述的地黄多糖混合物在制备防治骨质疏松症材料中的应用。

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