CN112048540B - 胰岛内源胰岛素分泌的检测方法及应用 - Google Patents

胰岛内源胰岛素分泌的检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，包括将胰岛贴壁培养后加入锌离子荧光染料共孵育并置于显微镜下，然后刺激贴壁的胰岛细胞分泌胰岛素，观察胰岛内源胰岛素的分泌。通过贴壁培养胰岛，并利用锌离子与胰岛素形成晶体结构并共释放的特性，加入锌离子荧光染料共孵育后进行镜下观察，实现了在胰岛上实时观察胰岛素囊泡的分泌个数。通过实时监测，能够大量缩短检测的时间，有效提高检测效率。

Description

胰岛内源胰岛素分泌的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法及应用。
背景技术
目前常用的检测胰岛素分泌的技术主要包括酶联免疫吸附(ELISA)、放射性免疫(RIA)、全内反射荧光成像(Total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM)、膜电容检测(Pacth clamp)、SRB双光子成像等。
酶联免疫吸附和放射性免疫技术利用抗原-抗体免疫反应，特异性检测溶液中的胰岛素，能精确地检测到pg级的胰岛素分泌，但检测费用昂贵，检测流程耗时长。
利用SRB(Sulforhodamine B，SRB)染料非选择性标记囊泡的Ω结构，可实现胰岛胰岛素囊泡分泌观察，但所观察到的分泌一定程度上包含了胞吞囊泡，以及Alpha细胞和Delta细胞的分泌囊泡。且只能检测到少量的分泌囊泡(几十至200个)。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法在筛选促进或抑制胰岛素分泌的药物中的应用。
本发明提供了一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，所述方法包括：将胰岛贴壁培养后加入锌离子荧光染料共孵育并置于显微镜下，然后刺激贴壁的胰岛β细胞分泌胰岛素，观察胰岛内源胰岛素的分泌。
进一步的，所述显微镜包括高速转盘共聚焦显微镜、双光子显微镜或高内涵成像系统。
进一步的，所述锌离子荧光染料包括不透膜锌离子荧光染料，优选包括FluoZin-1或RhodZin-3染料。
进一步的，将胰岛置于玻璃底的培养容器中进行贴壁培养，促进胰岛贴壁。
进一步的，贴壁培养所用的贴壁培养基包括含有葡萄糖、FBS和双抗的RMPI1640培养基；
优选地，所述贴壁培养基包括含有5～8mM葡萄糖、10％～15％(v/v)FBS和100U双抗的RPMI1640培养基。
进一步的，所述贴壁培养的时间为18-36小时，所述贴壁培养的温度为35-37℃。
进一步的，将贴壁的胰岛清洗后再加入锌离子荧光染料共孵育；
优选地，使用缓冲液对贴壁的胰岛进行清洗；
优选地，所述缓冲液包括含有0～3mM葡萄糖的KRBB缓冲液，更优选为预热后的缓冲液；
优选地，使用含有锌离子荧光染料的缓冲液进行共孵育；
优选地，所述含有锌离子荧光染料的缓冲液包括KRBB缓冲液；
优选地，所述锌离子荧光染料包括不透膜锌离子荧光染料，优选包括FluoZin-1或RhodZin-3染料；
优选地，所述锌离子荧光染料的含量为5～15μM；
优选地，所述共孵育的时间为15-25min。
进一步的，通过加入刺激液刺激贴壁的胰岛β细胞分泌胰岛素；
优选地，所述刺激液包括高糖缓冲液，优选糖浓度为7～30mM的高糖培养液；
进一步的，观察的温度为35-37℃。
另外，本发明还提供了上述的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法在筛选促进或抑制胰岛素分泌的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，通过贴壁培养胰岛，并利用锌离子与胰岛素形成晶体结构并共释放的特性，加入锌离子荧光染料共孵育后进行镜下观察，能够检测到大量的分泌囊泡(1000～2000个)，实现了在胰岛上实时观察胰岛素囊泡的分泌个数。通过实时监测，能够大量缩短检测的时间，有效提高检测效率。
同时，基于本发明提供的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法的有益效果，可将其用于在胰岛上筛选促进或者抑制胰岛素分泌的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的使用高速转盘共聚焦显微镜进行检测的原理图；
图2为本发明提供的18.2mM葡萄糖刺激前后胰岛素囊泡释放事件的检测结果图；
图3为本发明实施例1提供的不同Z轴深度的胰岛素分泌检测结果图；
图4为本发明对比例1提供的对未进行贴壁培养的胰岛进行检测的结果图；
图5为本发明实验例提供的应用酶联免疫吸附实验验证胰岛素正常分泌的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的第一个方面，提供了一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，所述方法包括：将胰岛贴壁培养后加入锌离子荧光染料共孵育并置于显微镜下，然后刺激贴壁的胰岛β细胞分泌胰岛素，观察胰岛内源胰岛素的分泌。
本发明提供的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法，通过贴壁培养胰岛，并利用锌离子与胰岛素形成晶体结构并共释放的特性，加入锌离子荧光染料共孵育后进行镜下观察，实现了在胰岛上实时观察胰岛素囊泡的分泌个数。通过实时监测，能够大量缩短检测的时间，有效提高检测效率。
尤其是在本发明中，通过将胰岛细胞贴壁培养18～36小时后，可促进胰岛细胞膜在玻璃片上粘附、展平，从而形成观察胰岛素分泌的区域。发明人猜想是贴壁的过程中，形成了一些特殊结构，使得胰岛素能在该特殊结构的区域分泌。
在一些优选的实施方式中，所述显微镜包括高速转盘共聚焦显微镜。
相比于现有的其他显微镜，如全内反射荧光显微镜，本实施方式使用高速转盘共聚焦显微镜，具有采样速度快，信噪比高的优势(如图1所示)。
在一些优选的实施方式中，所述锌离子荧光染料包括不透膜锌离子荧光染料，由于不透膜锌离子荧光染料不能透膜，只有囊泡膜与细胞膜融合形成融合孔后，染料才能进入囊泡内与锌离子结合，从而看到荧光信号突然增强，即单个胰岛素囊泡释放事件。
优选使用FluoZin-1染料作为本发明所使用的锌离子荧光染料，FluoZin-1在具备不透膜特性的基础上，通过酶联免疫吸附实验验证其对胰岛素的正常分泌没有影响，能够进一步保证检测的准确性。
在本发明中，优选将胰岛置于玻璃底的培养容器中进行贴壁培养，以促进胰岛贴壁。在玻璃底的培养容器中进行贴壁培养，使得贴壁后能够直接移至镜下观察，便于后续操作。
需要说明的是，对促进胰岛贴壁的贴壁培养基不作限定，凡是能够实现相应功能的市售贴壁培养基或实验室配置贴壁培养基均可。
为了实现更好的贴壁效果，本发明优选使用含有5～8mM葡萄糖、10％～15％(v/v)FBS和100U双抗的RPMI1640培养基作为促进胰岛贴壁的贴壁培养基。该贴壁培养基通过特定组分和特定含量的设置，能够更好地实现胰岛细胞的贴壁。
在一些优选的实施方式中，所述培养的时间为18-36小时，例如可以为，但不限于18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时；所述培养的温度为35-37℃，例如可以为，但不限于35℃、36℃或37℃。
在一些优选的实施方式中，将贴壁的胰岛清洗后再加入锌离子荧光染料共孵育。通过对贴壁的胰岛进行清洗去除培养基中的酚红，能够提高荧光成像过程中的信噪比。优选使用缓冲液对贴壁的胰岛细胞进行清洗。
优选地，所述缓冲液包括含有0～3mM葡萄糖的KRBB缓冲液，相比较PBS缓冲液等，KRBB缓冲液有利于维持胰岛细胞功能。
更优选将所述缓冲液预热后再用于胰岛贴壁细胞的清洗，典型但非限制性的预热温度可以为37℃，使用预热后的缓冲液对胰岛进行清洗，能够减少细胞的应激，最大限度的保持细胞的正常生理生化功能，便于后续检测应用。
优选地，使用含有锌离子荧光染料的缓冲液进行共孵育；
优选地，所述含有锌离子荧光染料的缓冲液包括KRBB缓冲液；
通过使用混合有锌离子荧光染料的缓冲液对贴壁的胰岛进行孵育，一方面能够保证染料在孵育体系中的均匀分布，另一方面也便于调整合适的染料用量。优选地，所述锌离子荧光染料的含量为5～15μM。
需要说明的是，在本发明的实施方式中，5～15μM的锌离子荧光染料能够对应检测的胰岛数量为50个以内，在上述锌离子荧光染料用量和胰岛数量的对应关系下，既能够保证检测结果的准确性，又能够避免原料的浪费。
优选地，所述共孵育的时间为15-25min，例如可以为，但不限于15min、18min、20min、22min或25min。
通过对孵育时间进行合理的调整和优化，能够保证检测时成像效果最优：孵育时间过短，染料不能均匀地扩散到胰岛内部，且不利于胰岛细胞恢复至静息状态；孵育时间过长，增加时间成本。
在一些优选的实施方式中，通过加入刺激液刺激贴壁的胰岛β细胞分泌胰岛素。
其中，刺激液的作用为刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，其例如可以为，但不限于高糖缓冲液，优选糖浓度为7-30mM的高糖缓冲液。胰岛素的分泌是随葡萄糖浓度升高而增加的。7mM浓度以上才能形成有效刺激而被检测到，但30mM以上会导致胰岛素分泌过多，无法区分胰岛素是否继续增加，影响检测结果。
在一些优选的实施方式中，观察的温度为35-37℃。在上述条件下进行检测，能够更好的采集刺激状态下的胰岛素分泌。
需要说明的是，本发明实施方式中对观察的时间不做具体的限定，可根据检测需求进行实际调整。
此外，基于本发明提供的胰岛内源胰岛素分泌的检测方法的有益效果，本发明提供了上述方法在筛选促进或抑制胰岛素分泌的药物中的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法：
将成年小鼠采用断颈法处死，通过胆总管向胰腺中灌注2～3ml消化液(含0.5mg/ml P型酶的Hanks液)。然后快速分离胰腺，37℃静止消化17min。终止消化后，手动纯化胰岛。
将纯化后的胰岛放入含8mM葡萄糖、10％FBS以及100U双抗的RPMI1640培养基(Gibco,货号11879020)中，37℃恒温培养箱中培养过夜。然后将过夜培养的胰岛置于玻璃底的共聚焦成像小皿上，37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，促进胰岛贴壁。24小时后，将贴壁的胰岛从培养箱中取出，吸去培养基，用预热的3mM葡萄糖KRBB缓冲液清洗，换上含8μMFluoZin-1染料的150μl 3mM KRBB缓冲液，置于培养箱中孵育20min，使胰岛恢复静息状态。在显微镜下选取贴壁牢固的胰岛作为记录对象，开始图像采集。首先，采集静息状态下的胰岛素分泌。然后，将33.4mM葡萄糖刺激液按照1：1的比例加入小皿中，立即记录15～30min，采集刺激状态下的胰岛素分泌。在距离玻璃皿底部大约1μm处可以观察到最多的分泌事件。整个成像过程保持胰岛处于35～37℃。
检测结果如图2和图3所示。图2为同一个平面，葡萄糖刺激前后的胰岛素分泌图像(其中a为葡萄糖刺激前，b为葡萄糖刺激后)。图3为胰岛不同Z轴深度的胰岛素分泌图像(其中a为1μm处所观察到的图像、b为4μm处所观察到的图像、c为7μm处所观察到的图像、d为10μm处所观察到的图像)，从图中可以看出，FluoZin-1标记的胰岛素囊泡可以在胰岛的不同层面被观察到，表明葡萄糖可以有效扩散到胰岛内部间隙。
对比例1
本对比例提供了一种胰岛内源胰岛素分泌的检测方法：
与实施例1的区别在于，不包括将胰岛进行贴壁培养的步骤。而是将胰岛直接压在微流芯片中，使细胞膜紧贴玻片，来观察胰岛素分泌。
检测结果如图4所示，图4中的a表示10mM葡萄糖缓冲液灌流10min后，没有观察到任何胰岛素分泌。图4中的b表示同一个胰岛切换成20mM葡萄糖缓冲液继续灌流10min，仍然没有观察到任何分泌。
由以上实验结果可以说明，只有通过胰岛的贴壁培养，通过对贴壁后的胰岛细胞进行检测才能够实现在胰岛上实时观察胰岛素囊泡的分泌个数。相比于胰岛细胞的生理性贴壁，仅通过将细胞压紧在培养皿底部是无法实现相应的功能的。
实验例
将来自同一只小鼠的胰岛按照20个胰岛一组分成两组，一组含8μM FluoZin-1，一组作为对照，均置于2ml含3mM葡萄糖的KRBB缓冲液中静止孵育30min，使胰岛恢复至静息状态。然后将胰岛转移至200μl含3mM葡萄糖的KRBB缓冲液中孵育5min，相应的溶液收集起来用于检测0min时的胰岛素分泌量。随后，将胰岛再次转移到200μl含20mM葡萄糖的KRBB缓冲液中刺激胰岛素分泌，此后在2min，5min，10min，20min，30min时分别取50μl溶液用于测量胰岛素分泌量，同时补充50μl含20mM葡萄糖的KRBB溶液维持200μl刺激液。最后，按照ELISA试剂盒(Millipore,EZRMI-13K)说明书进行检测溶液中的胰岛素。
实验结果如图5所示，从上述酶联免疫吸附实验可以证明外源加入的FluoZin-1染料并不影响胰岛素的正常分泌。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法，其特征在于，所述方法包括：将胰岛贴壁培养18～36小时，促使所述胰岛中的胰岛细胞膜在壁上粘附展平，使用含有不透膜锌离子荧光染料的KRBB缓冲液将贴壁的胰岛清洗后，再加入不透膜锌离子荧光染料共孵育并置于显微镜下，然后加入糖浓度为7～30mM的高糖缓冲液刺激贴壁的胰岛β细胞分泌胰岛素，实时观察胰岛内源胰岛素的分泌囊泡的个数；所述不透膜锌离子荧光染料在囊泡膜与细胞膜融合形成融合孔后进入囊泡内与锌离子结合；
贴壁培养所用的贴壁培养基为含有5～8mM葡萄糖、10％～15％(v/v)FBS和100U双抗的RPMI1640培养基；
所述贴壁培养的温度为35-37℃；
KRBB缓冲液中锌离子荧光染料的含量为5～15μM。
2.根据权利要求1所述的胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法，其特征在于，所述显微镜包括高速转盘共聚焦显微镜、双光子显微镜或高内涵成像系统。
3.根据权利要求1所述的实时检测方法，其特征在于，所述不透膜锌离子荧光染料包括FluoZin-1或RhodZin-3染料。
4.根据权利要求1所述的胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法，其特征在于，将胰岛置于玻璃底的培养容器中进行贴壁培养，促进胰岛贴壁。
5.根据权利要求1所述的胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法，其特征在于，所述KRBB缓冲液含有0～3mM葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的实时检测方法，其特征在于，KRBB缓冲液经过预热。
7.根据权利要求1所述的实时检测方法，其特征在于，所述共孵育的时间为15-25min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法，其特征在于，观察的温度为35-37℃。
9.权利要求1-8任一项所述的胰岛内源胰岛素分泌囊泡的实时检测方法在筛选促进或抑制胰岛素分泌的药物中的应用。
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