CN112043693B - 含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开一种含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用，本身请发明人做了相关实验研究，实验证明，本发明提供的含酯基芳香丙酰胺类化合物能增加去势家兔的泪液分泌量，降低角膜荧光染色评分值，增加泪膜破裂时间，对实验性干眼症有明显的改善作用。

Description

含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用。

背景技术

干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称，可造成角结膜病变，并会影响视力。近年来随着电脑、智能手机的广泛使用，人们的用眼时间不断增长，加之不良用眼习惯的影响，导致干眼症发病率明显上升。干眼症已成为全球流行性疾病，我国干眼症的发病率逐渐升高并有年轻化的趋势。研究表明，眼表组织的炎症反应是干眼症中泪液分泌减少的主要诱因，目前干眼症的治疗主要以人工泪液、皮质类固醇激素以及环孢霉素A等免疫抑制剂为主。其中，人工泪液仅是一种泪液替代品，其本身无治疗作用；皮质类固醇激素及环孢霉素A等药物长期使用对眼表均有一定的毒副作用。因此，临床上亟需一种效果好且长期使用无明显局部及全身毒副作用的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中的应用。

优选地，所述干眼症为性激素失衡引起的干眼症。

优选地，所述含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗干眼症药物中与医药学上可接受的辅料联合使用。

优选地，所述含酯基芳香丙酰胺类化合物与医药学上可接受的辅料制备成涂膏形式。

优选地，所述医药学上可接受的辅料为矿物油和凡士林。

优选地，所述含酯基芳香丙酰胺类化合物为C₂₂H₁₉F₃N₄O₄或C₂₂H₁₈F4N₄O₄，其中C₂₂H₁₉F₃N₄O₄或C₂₂H₁₈F4N₄O₄的制备方法及结构式均参考申请号为2014103602169的专利文件记载的内容。

优选地，所述C₂₅H₁₇F₃N₄O₄的有效剂量为0.5-6.75mg/kg。

本发明具有的优点是：本发明提供的含酯基芳香丙酰胺类化合物是一类新的选择性非甾体类雄激素受体调节剂，具有调节雄激素受体的作用，因此可以用于治疗因为雄激素失衡导致的干眼症，且动物实验表明其能增加去势家兔的泪液分泌量，降低角膜荧光染色评分值，增加泪膜破裂时间，对实验性干眼症有明显的改善作用。

附图说明

图1：各组哈氏腺病理切片检查结果示意图。

图2：各组睑板腺病理切片检查结果示意图。

图3：雄性食蟹猴造模动物泪膜破裂时间的影响的曲线图。

图4：雄性食蟹猴造模动物泪膜破裂时间的影响的柱状图。

图5：雄性食蟹猴实验中双眼角膜荧光染色结果示意图。

图6：雄性食蟹猴实验中造模动物泪液分泌量的影响的曲线图。

图7：雄性食蟹猴实验中造模动物泪液分泌量的影响的柱状图。

图8：雄性新西兰大白兔各组的动物体重变化示意图。

图9：雄性新西兰大白兔各组对泪膜破裂时间的影响。

图10：雄性新西兰大白兔各组荧光染色结果示意图。

图11：雄性新西兰大白兔各组对泪液分泌量的影响示意图。

具体实施方式

采用如下实验证实本发明含酯基芳香丙酰胺类化合物治疗干眼症的作用。文中所提到的EG类化合物均为含酯基芳香丙酰胺类化合物，且EG-12、EG-312、EG-17、EG-317分别为C₂₂H₁₉F₃N₄O₄、C₂₂H₁₈F4N₄O₄、C₂₅H₁₇F₃N₄O₄和C₂₅H₁₆F₄N₄O₄，其具体制备方法和结构式参考申请号为2014103602169的专利文件记载的内容。

1 实验名称及实验目的

1.1 实验名称

EG类化合物对雄兔去势所致干眼症的改善作用

1.2 实验目的

观察受试物EG-12、EG-312、EG-17、EG-317对雄兔去势所致干眼症的改善作用

2 实验起止日期：2014年8月5日—2014年10月27日

3 受试物的名称、稳定性及其他特性

3.1 受试物名称：EG-12(C₂₂H₁₉F₃N₄O₄)、EG-312(C₂₂H₁₈F4N₄O₄)、EG-17(C₂₅H₁₇F₃N₄O₄)、EG-317(C₂₅H₁₆F4N₄O₄)

受试物保存条件：密闭，室温、阴凉处保存

3.2 受试物配制

受试物溶媒的选择：矿物油加凡士林

受试物配制方法：研磨后加入矿物油及凡士林溶成糊状

受试物配制频率：一次配供三天使用

4 实验动物的种、数量、性别、体重范围、来源、动物合格证号及签发单位和饲养条件

4.1 种属日本大耳白兔

等级普通级

预定购入动物数量和性别：45只，雄性

预定使用动物数量和性别：45只，雄性

体重：实验开始时体重均数2.4～2.8Kg

来源：郑州康达生物公司。

实验动物生产许可证号：SCXK(豫)2011-0001

动物合格证号：41001900000233

4.2 饲养条件

饲养室：普通环境

温度：20～24℃，日温差：0～4℃

相对湿度：40～66％

5 动物饲料、饮水和垫料的种类、来源、批号和质量情况

5.1 饲料

名称：家兔饲料

生产厂家：河南省实验动物中心提供

地址：郑州市大学路40号

许可证：SCXK(豫)2005-0001

灭菌方法：Co⁶⁰照射

给料方法：足量供给，自由采食

参考标准：GB14924.3-2001

饲料检测：符合营养和卫生标准，农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)、河南省疾病预防控制中心、河南省实验动物质量监督检测站提供检测报告。

5.2 饮水

种类：无菌水

灭菌方法：自动对反渗透系统冲洗和在线循环消毒

使用LAWS-40T实验动物饮用水处理器供水

供水方法：装入饮水瓶中，自由摄取。

水质检测：符合卫生标准，国家城市供水水质监测网郑州监测站提供检测报告。

5.3 笼具及管理

笼具：RS-12型不锈钢冲洗式实验兔笼(2000×650×1720mm³)。

每笼动物数：1只/笼。

6 动物检疫

检疫7天，检疫期内每天进行一般状况观察。检疫期首日和末日测定体重。

7 实验动物的分组和识别方法

7.1 动物识别方法

7.1.1 检疫期 单笼饲养，笼具挂牌，不标记动物。

7.1.2 给药观察期用饱和苦味酸溶液体染标记，每组5只家兔依次以头、背、尾、头背、白标示。

7.2 实验动物分组检疫期结束，将家兔按体重随机挑选出5只作为正常对照组，剩余家兔为造模组。经检测造模成功后，将造模家兔按体重随机分成8组，分别为模型组、溶剂对照组、阳性1药(卡波姆滴眼液)组、阳性2药(丙酸睾酮注射液)组及各受试物组。

8 对照品及阳性药来源

8.1 0.9％生理盐水(厂家：河南太龙药业股份有限公司，批号：13062552)；卡波姆滴眼液(厂家：Dr.GerhardMann,Chem.-Pharm.Fabrik GmbH，批号：9113)；丙酸睾酮注射液(厂家：上海通用药业股份有限公司，批号：130403)；矿物油(厂家：Sigma批号：M5904)；凡士林(厂家：南昌白云药业有限公司，批号：140501)；戊巴比妥钠(厂家：Sigma，批号：P3761)；荧光素钠(广州白云山明兴制药有限公司，批号：130926)。

9 受试物和对照品的给药途径、剂量和频率

9.1 给药方法：各组均为为眼局部给药。

9.2 检疫期：2014.8.5-2014.8.11

9.3 分组日期：2014.8.12；2014.9.15

9.4 造模日期：2014.8.12

9.5 给药时间：2014.9.15

9.6 动物处置时间：2014.10.27

9.2 用药期限：2014年9月15日～2014年9月28日，连续给药2周。

9.3 给药频率：阳性1组(卡波姆滴眼液)为每天给药两次，上下午各一次，其余各组均每天给药一次，上午定时给药。

9.4 给药剂量

正常对照组：0.9％生理盐水，每次每眼滴2滴。

模型对照组：0.9％生理盐水，每次每眼滴2滴。

溶剂对照组：(1mL矿物油+0.5g凡士林)为三天的给药量，约为0.05g/眼，0.1g/只。

阳性1药组(卡波姆滴眼液)：卡波姆滴眼液，每次每眼滴1滴。

阳性2药组(丙酸睾酮注射液)：丙酸睾酮注射液，规格为25mg/lmL，按1mL20滴计算，1.25mg/滴，每次每眼滴2滴，5.0mg/只，2.5mg/眼。

受试物组(EG-N)：(150mg+1mL矿物油+0.5g凡士林)为三天的给药量，5只家兔×3天＝15次，即10mg/只，5mg/眼。

每周称1次体重。

10 所使用的仪器电子天平(上海精密科学仪器，JA1003N)；秤(上海友声衡器有限公司，ASC-A)；裂隙灯显微镜(江西枫林光学仪器有限公司，LYL-1)。

11 实验方法及检测指标

11.1 造模方法：将待手术家兔分别用戊巴比妥钠(50mg·kg^-1)耳缘静脉注射全身麻醉，常规消毒，铺无菌巾，先后将双侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，勿使其滑动，用消毒刀片将阴囊切一小口，且力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊预防感染。

11.2 给药方法：术后第35天按拟定剂量开始给药，连续14天。

11.3 检测指标：每组分别于造模前、给药第0、7、14天行表面麻醉后检测基础泪液分泌量(SchirmerI实验)、角膜荧光染色(PI)、泪膜破裂时间(BUT)。

11.3.1 基础泪液分泌量(SchirmerI实验)：定性滤纸(35mm×6mm)，前段5mm反折置于下眼睑颞侧结膜囊内，检测记录5min后试纸泪液浸润的长度(包括反折段)。

11.3.2 角膜荧光染色(PI)评分标准：家兔双眼滴1％荧光素钠，不冲洗，用裂隙灯显微镜进行观察。角膜上皮无染色，0分；染色面积小于25％，1分；染色面积为25％-50％，2分；染色面积为50％-75％，3分；染色面积大于75％，4分。

11.3.3 泪膜破裂时间(BUT)：用玻璃棒蘸荧光素滴于兔下眼结膜囊内，瞬目后于裂隙灯下记录从最后1次瞬目后睁眼至角膜第1个黑斑出现的时间。

11.4 组织病理学检查取左侧哈氏腺及眼睑标本，10％甲醛溶液固定，乙醇脱水、石蜡包埋、切片、常规HE染色后，置于光学显微镜下检查哈氏腺及睑板腺。

12 数据统计处理方法

数据使用

表示，数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA法检验)，组间用LSD法两两比较，检验水准α＝0.05。

13 实验结果

13.1 各组家兔一般状态及体重情况在造模后的5天内，造模组家兔运动次数减少、毛色较差、粪便较稀；在给药期间，各组家兔的外观、行动、被毛、粪便等一般状况良好，未见明显与药物相关的毒性症状。由于去势手术的影响，各组家兔在给药前体重均低于正常对照组，但随着实验进行，各组家兔体重均呈上升的趋势。结果如表1所示。

表1：各组家兔体重变化情况(

Kg)

^*P<0.05，与正常对照组相比

13.2 与正常对照组比较，模型对照组家兔的泪液分泌量明显减少、差异有统计学意义(P＜0.05)；角膜荧光染色评分值显著增高、差异有统计学意义(P＜0.05)泪膜破裂时间均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；说明造模成功。(2)与模型组及溶剂组比较，阳性1药(卡波姆滴眼液)组、阳性2药(丙酸睾酮注射液)组、EG-12组、EG-312组的泪液分泌量明显增加、差异有统计学意义(P＜0.05)；结果如表2所示。

表2：各组不同时间泪液分泌量的比较(

mm)

^*P<0.05，与正常对照组相比；^△P<0.05，与模型对照组相比；^▲P<0.05，与溶剂对照组相比13.3各组不同时间角膜荧光染色评分的比较术后第35天进行家兔角结膜染色检测显示：造模组较正常对照组显著增加，P＜0.05，表明造模成功；给药第7天时，两个阳性组及EG-12、EG-312组较模型组与溶剂对照组家兔角结膜染色有减少趋势，但差异无显著性，EG-17、EG-317组较模型组与溶剂对照组家兔角结膜染色无差异；给药第14天时，两个阳性组及EG-12、EG-312组较模型组与溶剂对照组家兔角结膜染色评分值显著减少，差异有统计学意义，EG-17、EG-317组较模型组与溶剂对照组家兔角膜染色无显著差异；停药后第28天，各给药组的家兔结膜染色评分值均增高，与正常对照组均有显著性差异，P＜0.05，结果如表3所示。

表3各组不同时间角膜染色评分结果比较

P<0.05，与正常对照组相比；^△P<0.05，与模型对照组相比；^▲P<0.05，与溶剂对照组相比

13.4 组织病理学检查，结果如图1-图2所示

对照组：哈氏腺及睑板腺组织排列整齐，未见细胞变性坏死、纤维组织增生及炎性细胞浸润。

模型组及溶剂组：哈氏腺：组织排列紊乱，可见大量腺泡细胞变性坏死，坏死灶纤维组织增生，局部见炎性细胞浸润。睑板腺：导管管壁变薄，管腔扩大，结缔纤维增多呈纤维化。部分腺泡失去正常腺泡结构，表现为组织结构排列紊乱，细胞体积变小，细胞质明显减少，细胞核密集拥挤在一起，腺泡呈萎缩状态。

阳性药和治疗药：EG-12组和阳性2组(丙酸睾酮)组较模型组明显改善。哈氏腺上皮排列整齐，部分腺泡上皮细胞轻度变性及纤维结缔组织轻度增生，未见明显炎性细胞浸润。睑板腺腺上皮萎缩显著减轻，细胞体积趋于正常，核质比例适中，纤维结缔组织增生不明显。其余组哈氏腺和睑板腺较模型组均有不同程度的好转，腺泡组织细胞排列较模型组整齐，细胞变性、坏死数量减少，局部炎细性胞浸润和纤维组织增生不同程度减轻。睑板腺上皮细胞萎缩程度明显减轻，腺泡及导管周围结缔组织中度增生。

结论，EG-12与EG-312能增加去势家兔的泪液分泌量，降低角膜荧光染色评分值，增加泪膜破裂时间，对实验性干眼症有明显的改善作用。EG-17与EG-317对实验性干眼症并无明显作用。

以下进一步研究特测化合物EG017在雄性食蟹猴去势所致干眼病症中的药效学，以表明其作用。

实验材料

实验药品和试剂

EG017:批号，Q18-045；提供单位，药源药物化学(上海)有限公司；物理性质，类白色粉末；储存条件，密闭、室温保存。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na):批号，C1814029:厂家，阿拉丁；物理性质，类白色粉末；储存条件，干燥、室温保存。

荧光素钠：批号，BCBQ5572V:厂家，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司：物理性质，橙红色粉末；储存条件，干燥、密闭保存。

舒泰50(Virbac-50)；批号，6VUL:厂家，法国维克有限公司Virbac S.A.；储存条件，密闭、室温。

实验动物

雄性食蟹猴(苏州西山中科实验动物有限公司)42只，普通级，体重4.0-9.0kg,动物合

格证号：201817192,所有食蟹猴在12小时光暗循环并且温控的恒温(22+4℃),湿度40％至70％环境下饲养，饲养间内每小时空气更换10至20次，正常饲料喂养，每周记录一次体重，

实验方法

实验周期

体内实验开始日期：2018-08-27；体内实验结束日期：2018-12-11

实验流程

分组：所有动物按体重和造模前基础泪液分泌量及泪膜破裂时间，随机分为6组：非模型溶剂对照组(sham),模型组(Model),EG017低剂量0.5mg/kg组，EGO17中剂量1.5mg/kg组、EGO17高剂量(H)4.5mg/kg组，每组7只。

去势手术造模：动物经过一周适应期/基线数据采集后，进行双侧去势手术，猴子过夜禁食后用舒泰50(5mg/kg)肌肉注射全身麻醉，常规消毒，铺无菌巾，然后将双侧案丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，用消毒刀片将阴囊切一小口，用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除双侧睾丸及附率，缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊，术后抗生素注射1周，防止感染。

终点急性冷风刺激造模：考虑到食蟹猴手术去势造模，动物成模时间较长，为了扩大模型效果，在末次检测各组动物(Sham组除外)指标前固定动物上下眼睑，暴露眼球，用大功率电吹风(冷风模式)距离动物双眼10cm处，对动物双眼连续吹风刺激3分钟。

给药：动物按照表4在相应时间给予相应治疗药物。非模型溶剂对照(Sham)组和模型(Model)组灌胃给予0.5％CMC-Na溶剂，低、中、高测试药物组灌胃给予EG017溶液(0.5、1.5、4.5mg/kg)。所有组别连续给药14周，给药体积为5ml/kg,每天一次。每周称量一次动物体重并每天进行两次临床观察。

表4：分组给药表

眼科检查：动物禁食后肌肉注射舒泰50(5mg/kg)诱导全身麻醉后做以下眼科检测。

检测项依次为泪膜破裂时间、角膜荧光染色、基础泪液分泌量。

a.泪膜破裂时间(BUT)；在造模/给药前进行一次泪膜破裂时间的检测，给药后每2周进行一次测量，左右眼各测一次，每次检测3次，取平均值。

测量方法：猴每眼滴50ul0.25％荧光素钠，不冲洗，瞬目2-3次后，用裂隙灯在钻蓝滤光片下观察从最后1次瞬目后睁眼至角膜出现第1个黑斑的时间。

b,角膜荧光染色评分：在造模/给药前进行一次角膜荧光染色评分的检测，给药后每2周进行一次评估，左右眼各一次。

评估方法：泪膜破裂时间测量完成后，紧接着使用生理盐水冲洗去除过多的荧光素溶液，用裂隙灯在钴蓝滤光片下观察。

荧光素染色评分采用12分法：将角膜分为4个象限，每个象限0-3分；无染色为0分，1-30个点状着色为1分，大于30个点状着色且染色未融合为2分，出现角膜点状着色融合、丝状物和溃疡等为3分。

c.泪液分泌量(Schirmer I实验)：在造模/给药前进行一次泪液分泌量的检测，给药后每两周进行一次测量，左右眼各测一次。

测量方法：在角膜荧光染色评分测量完成后，轻轻沾拭多余的生理盐水冲洗液(不接触到眼球)，并间隔一段时间(约5分钟)，消除角膜荧光染色对泪液分泌的影响：使用商品化泪液检测试纸，前段反折置于下眼险顾侧结膜囊内，检测记录3min后试纸泪液浸润的长度。

制剂配制

0.25％荧光素钠：精密称取荧光素钠粉末溶解于0.9％氯化钠注射液。配置成0.25％的荧光素钠溶液。

0.5％CMC-Na溶媒配制：称取足量CMC-Na粉末溶解于双蒸馏中配制成终浓度为0.5％的CMC-Na澄清溶液待用。

EGO17溶液配制：根据各组动物体重，给药前一天分别称取适量的EG017粉末，置于研钵中；加入少量溶媒并充分研磨；研磨好的药液转移到刻度器皿中，并用适量溶媒反复冲洗研体，真至研体内无药物粉末粘附；向含有药液的刻度器皿中，添加适量溶媒直至到达给药浓度；用磁力搅拌器持续搅拌直至药液完全混匀成混悬液：2-8'℃过夜保存，次日早上给药；至少提前30分钟将药液移到室温，用磁力搅拌器持续搅拌直至给药完成。

数据处理

所有的数据以Mean士SEM的方式表示。实验数据采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)加t-test双尾检验将各组数据进行分析比较。

实验结果

在本实验中，根据实验进展及实验数据，对原实验方案进行了多次调整修订，包括(1)延长6周治疗期，延长期内实验操作及操作频率与前面保持一致；(2)在末次眼科检测前，对去势造模动物进行急性冷风刺激造模，加快成模及利于观察药物治疗效果：(3)对整个实验数据进行分析后，决定取消血清性激素检测、泪液脂质分析及泪腺和险板腺组织病理学检查。

动物的体重及一般情况

动物体重变化Sham组动物在整个实验期间体重较稳定，没有明显变化，Model组动物体重在整个实验周期内都呈极显著性的持续下降，说明动物去势操作会很明显地降低动物体重。EG017低剂量、EG017中剂量、EG017高剂量、组动物在去势造模后的给药期间体重呈上升趋势，说明各组药物均有效阻止了动物去势造成的体重下降情况。

EG017对造模动物泪膜破裂时间的影响

如图3及图4所示，sham组动物在整个实验期间，泪膜破裂时间较稳定，没有明显变化，除了2周时有一过性的减少(P《0.05).Model、EG017低剂量、EG017中剂量、EG017高剂量组动物在造模后12周内泪膜破裂时间均无明显变化，在14周急性冷风刺激造模后该5组动物的泪膜破裂时间有非常明显的下降表现，提示干眼症急性模型成功。EG017有改善动物泪膜破裂时间作用，且有剂量依赖性；EG017对双眼角膜荧光染色评分的影响

如图5所示，所有组别动物在造模前及造模后12周双眼角膜荧光染色评分无明显变化，14周检测时增加急性冷风刺激后Model、EG017低剂量、EG017中剂量、EG017高剂量组动物都有不同程度的评分增加，提示急性造模成功。Model组的双眼角膜荧光染色评分高于EG017测试组，表明EG017有效抑制去势造模和急性冷风刺激造模所产生的角膜损伤。

EG017对造模动物泪液分泌量的影响

如图6及图7所示，所有组别动物在造模/给药前泪液分泌量的值比较接近没有明显的差别，在造模/给药后Sham组动物整个给药期的泪液分泌量较为平稳且有上升。趋势，说明整个实验给药期动物无其他因素影响和干扰。Model组动物在造模后直至14周实验终点泪液分泌量指标呈持续下降趋势且与其他组别有显著性差异，说明去势造模显著影响动物的泪液分泌量指标。EG017治疗组有不同程度地改善了动物泪液分泌量的减少，且有剂量相关性；

结论

在本实验条件下，雄性食蟹猴完全去势后，体重有显著性性持续性下降，EG017有很好的抑制体重下降作用，甚至轻微增加体重。去势12周后，各组动物泪膜破裂时间、角膜染色及泪液分泌量均无明显变化，除了Model组泪液分泌量从10周开始有明显下降(P《0.05),可见单纯去势，对干眼成模作用较小且周期较长。

为了加强干眼成模效果并很好的观察治疗效果，在14周检测前，给所有动物(除了Sham组)双眼进行连续吹冷风刺激3分钟，造成急性干眼模型，急性造模后，Model组动物泪膜破裂时间和泪液分泌量均有显著性减少、角膜染色评分有显著性增加，提示急性造模成功：各组EG017，泪膜破裂时间、泪液分泌量及角膜染色均有很好的改善，且有剂量相关性。

综上所述，EG017对食蟹猴干眼病均有很好的改善作用。

以下研究熙健医药科技待测化合物EG017在雄性新西兰大白免去势法构建的干眼病模型中的药效,以表明其作用。

实验材料

实验药品和试剂

EG017:批号，Q18-045；供应商，药源药物化学(上海)有限公司；物理性质：类白色粉末；储存条件，密闭、室温保存。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)；批号，C1814029；供应商，阿拉丁；储存条件，密闭干燥、室温保存。

盐酸赛拉嗪注射液(陆眠宁)：批号，170413；供应商，吉林省华牧动物保健品有限公司；储存条件，密闭干燥、室温保存。

0.9％氯化钠注射液：批号，1809271374；供应商，辰欣药业股份有限公司；存储条件，密闭、室温保存，

荧光素钠：批号，BCBQ5572V；供应商，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司：物理性质，橙红色粉末；储存条件，干燥、密闭保存。

氟尼辛葡甲胺注射液；批号，20180510:供应商，江西博莱大药厂有限公司。

拜有利注射液；批号，1332；厂家，拜耳(中国)有限公司：存储条件，2.8℃保存。

泪液检测试纸条：批号，20180503 13；供应商，天津晶明新技术开发有限公司：存储条件，密闭、室温。

主要仪器：

实验动物

雄性新西兰大白兔(青岛康大生物科技有限公司提供)36只，普通级，体重3～4.5kg.动物合格证号：37003900001046。

所有新西兰大白兔在12小时光暗循环并且温控的恒温(22±4℃)、湿度为40％-70％的环境下正常饲料喂养，饲养间内每小时空气更换10至20次，每周记录一次体重，实验过程中对于动物的处置符合动物伦理学要求。

实验方法

实验操作分组及给药

分组：36只动物根据造模前泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光染色评分、泪液分泌量(SchirmerI)随机分为6组：假手术溶媒对照组(Sham)、模型溶媒对照组(Model)、EG0170.75mg/kg低剂量组(L)、EG017 2.25mg/kg中剂量组(M)、EG017 6.75mg/kg高剂量组(H),每组6只。

给药：动物按照下表分别给予待测药物。假手术溶媒对照组(Sham)和模型(Model)组灌胃给予0.5％CMC-Na溶剂，EG017低、中、高剂量组灌胃给予EG017溶液(0.75、2.25、6.75mg/kg)。所有组别分别连续给药14周，给药体积为5ml/kg,每天一次。

每周称量一次动物体重并进行两次临床观察。

表7、分组给药表

动物模型的建立

实验组动物行去势造模。主要步骤如下：肌肉注射陆眠宁(2.5mg/kg,IM)进行全身麻醉，常规消毒，铺无菌巾。先后将双侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，勿使其滑动，用消毒刀片将阴囊切一小口，挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，并切除睾丸及附睾，缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊。术后注射抗生素和镇痛剂1周进行护理。

冷风刺激急性造模：由于去势手术造模时间较长，为了扩大模型效果，在末次检测各组动物(Sham组除外)指标前固定动物上下眼脸并暴露眼球，用大功率吹风筒距离动物双眼10cm连续吹冷风刺激眼睛3分钟。

泪膜破裂时间(BUT)测定

泪膜破裂时间在造模前/给药前测量一次，给药后每2周测量一次，左右眼各测一次。

测量方法：肌肉注射陆眠宁(2.5mg/kg,IM)全身麻醉后，每眼滴大约100u10.5％荧光素钠，不冲洗，瞬目2-3次后，用裂隙灯在钴蓝滤光片下观察从最后1次瞬目后睁眼至角膜出现第1个黑斑的时间。

角膜荧光染色评分

在造模前/给药前进行一次角膜荧光染色评分，给药后每2周进行一次评分，左右眼各一次。

评估方法：泪膜破裂时间测量完成后，紧接着使用生理盐水冲洗去除过多的荧光素溶液，用裂隙灯在钴蓝滤光片下观察。荧光素染色评分采用12分法：将角膜分为4个象限，每个象限0-3分；无染色为0分，1-30个点状着色为1分，大于30个点状着色且染色未融合为2分，出现角膜点状着色融合、丝状物和溃疡等为3分。

泪液分泌量测定

角膜荧光染色完成后次日在动物清醒状况下进行泪液分泌量测定，造模前/给药前检测一次，给药后每2周检测一次，左右眼各一次。将商品化泪液检测试纸条反折置于眼睑颞侧结膜囊内，闭合动物双眼，检测记录5min后泪液试纸浸润的长度。

制剂配制及给药

0.5％荧光素钠：精密称取荧光素钠粉末溶解于0.9％氯化钠注射液。配置成0.5％的荧光素钠溶液。

0.5％CMC-Na溶媒配制：称取CMC-Na粉末溶解于蒸馏水中配制成终浓度为0.5％的CMC-Na澄清溶液待用。

EG017溶液配制：动物给药剂量分别为0.75mg/kg、2.25mg/kg和6.75mg/kg,给药体积均为5ml/kg.根据动物体重，根据各组动物体重，给药前一天分别称取适量的EG017粉末，置于研钵中；加入少量溶媒并充分研磨；研磨好的药液转移到刻度器皿中，并用适量溶媒反复冲洗研钵，直至研钵内无药物粉末粘附；向含有药液的刻度器皿中，添加适量溶媒直至到达给药浓度；用磁力搅拌器持续搅拌直至药液完全混匀成混悬液：2-8℃过夜保存，次日早上给药；至少提前30分钟将药液移到室温，用磁力搅拌器持续搅拌直至给药完成。

EG017溶液于实验前一天配制，配制好后储藏于4℃冰箱过夜。在实验动物给药前恢复至室温，给药期间用磁力搅拌仪搅拌，使混悬液一直处于搅拌状态，药物充分混悬。

数据处理

将所有数据以Mean±SEM方式表示。实验数据采用软件GraphPad Prism 5双因素方差分析和T-test对各组数据进行组间和组内前后的分析比较。统计分析结果P《0.05认为差异有统计学意义，P<0.01为显著性差异，P《0.001有极显著性差异。

实验结果

动物体重及总体情况

动物体重变化情况如图8所示。各组动物体重在整个实验期间都有显著升高，但相对于sham组其它组体重升高更为明显，说明去势会造成兔子体重增加更为明显。

EG017对泪膜破裂时间的影响

泪膜破裂时间值如图9所示，sham组动物在整个实验期间，泪膜破裂时间较稳定，没有明显变化。Model、EG017低剂量、EG017中剂量、EG017高剂量组动物在造模后12周内泪膜破裂时间均无明显变化，在14周急性冷风刺激造模后该5组动物的泪膜破裂时间有非常明显的下降表现，提示干眼症急性模型成功。EG017有改善动物泪膜破裂时间作用，且有剂量依赖性。

EG017对角膜荧光染色评分的影响

角膜荧光染色评分如图10所示，所有组别动物在造模前及造模后12周双眼角膜荧光染色评分无明显变化，14周检测时增加急性冷风刺激后Model、EG017低剂量、EG017中剂量、EG017高剂量组动物都有不同程度的评分增加，提示急性造模成功。Model组的双眼角膜荧光染色评分高于EG017测试组，表明EG017有效抑制去势造模和急性冷风刺激造模所产生的角膜损伤。

EG017对泪液分泌量的影响

泪液分泌量结果如图11所示，所有组别动物在造模给药前泪液分泌量的值比较接近没有明显的差别，在造模/给药后Sham组动物整个给药期的泪液分泌量较为平稳(左眼第8周有波动上升)。第14周急性造模后，Model组和EG017组泪液分泌量均有所下降。相对Model组，EG017治疗组有不同程度地改善了动物泪液分泌量的减少，且有剂量相关性；

结论与讨论

本项目意在研究熙健化合物EG017对新西兰雄兔去势干眼病模型的药效学研究，去势造模后第二天所有动物开始灌胃给药，去势3周后去势组动物较Sham组体重升高更为明显；去势12周后，各组动物泪膜破裂时间、角膜染色及泪液分泌量均无明显变化，可见单纯去势，对干眼成模作用较小且周期较长。

为了加强干眼成模效果并很好的观察治疗效果，在14周检测前，给所有动物(除了Sham组)双眼进行连续吹冷风刺激3分钟，造成急性干眼模型。急性造模后，Model组动物泪膜破裂时间和泪液分泌量均有显著性减少、角膜染色评分有显著性增加，提示急性造模成功；

各组EG017组，泪膜破裂时间、泪液分泌量及角膜染色均有很好的改善，且有剂量相关性。

综上所述，EG017对去势及冷风吹兔子干眼病模型有明显改善作用。

Claims (5)

1.含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗急性冷风刺激引起的角膜损伤药物中的应用，其特征在于：所述含酯基芳香丙酰胺类化合物为EG-17，其分子式为C₂₅H₁₇F₃N₄O₄，化学名称为(S)-1-(4-氰基-3-(三氟甲基) 苯胺基)-3-(4-氰基苯氧基)-2-甲基-1-氧丙烷基-2-尼可丁酸酯。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含酯基芳香丙酰胺类化合物在制备治疗急性冷风刺激引起的角膜损伤药物中与医药学上可接受的辅料联合使用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含酯基芳香丙酰胺类化合物与医药学上可接受的辅料制备成涂膏形式。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述医药学上可接受的辅料为矿物油和凡士林。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述EG-17的有效剂量为0.5-6.75mg/kg。

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