CN112043689B - 一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物及其应用 - Google Patents

一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗炎药物技术领域，提供了一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物及其应用，所述药物组合物包括姜黄素和布洛芬；所述姜黄素和布洛芬的摩尔比为(0.5～1)：(2～4)。本发明将姜黄素与布洛芬联合使用，对脂多糖诱导巨噬细胞(RAW264.7)建立的炎症模型有良好的抑制效果，显著优于单独用药的效果；而且该组合物在炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而降低了单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害，该组合物使用的组分价格相对便宜。

Description

一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物及其 应用
技术领域
本发明属于抗炎药物技术领域，更具体地，涉及一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物及其应用。
背景技术
炎症是一种由感染、组织损伤、组织压力或功能失常引起的人体的自动防御反应，基本临床症状包括发热，水肿，疼痛和发红。炎症是多种病理过程的基础，正常情况下对机体是有益的，其主要作用是消除有害刺激，防止进一步损伤，启动愈合过程并恢复受伤组织的正常功能。但是，当炎症过度或失去控制时，正常的组织稳态就会被破坏，严重时甚至会导致死亡(如过度炎症引起的炎症因子风暴导致多器官衰竭)。
根据炎症持续时间的不同，可分为急性和慢性。由感染或组织损伤引起的急性炎症反应过程中，涉及到血液流速增快、血管通透性增加和血液中的白细胞(以粒细胞为主)向炎症部位的血管外组织聚集。当组织驻留巨噬细胞和其他驻留组织细胞(例如肥大细胞，树突状细胞和基质细胞)识别到外来刺激因素或异物入侵时，会分泌大量炎症介质，促使炎性白细胞(典型的是中性粒细胞)以及单核细胞大量涌入，作为炎性巨噬细胞的来源。激活的中性粒细胞通过吞噬或释放杀菌颗粒来消除入侵物，但同时也会损伤宿主组织。对于大多数急性炎症，后期随着入侵物的消除，机体会进入炎症消退和启动组织修复阶段。若急性炎症未能消除入侵物，则炎症反应将持续并转入另一个阶段：中性粒细胞浸润被巨噬细胞或T细胞替代。如果这些细胞的综合作用仍不足，则出现慢性炎症状态。当然，慢性炎症不仅仅是从急性炎症转化而来，也可能由自身免疫缺陷或长期在体内无法降解的有毒物质引起。
研究发现，很多疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、类风湿性关节炎、骨关节炎、肿瘤等都在一定程度上存在慢性炎症状态，如促炎细胞因子的升高、依附因子表达的增加等。这种持续低度的慢性炎症促进此类疾病的病理反应以及二者之间的相互作用，从而导致疾病的加重或者并发症的产生。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞外壁的一种成份，具有很强的致炎作用，被广泛用于诱导免疫反应，但对神经元没有直接毒性作用。其目前已经广泛用于各种炎症反应和氧化应激模型的建立，包括巨噬细胞体外炎症模型。
现有技术针对炎症相关疾病的药物治疗方法存在着用药量大、毒副作用大以及价格昂贵的缺陷。因此，急需开发出抗炎效果好且用药量较低、毒副作用较小、价格相对便宜的抗炎药物。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的用药量大、毒副作用大以及价格昂贵的缺点，本发明首要目的在于提供一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物。该组合物将姜黄素(Curcumin)和布洛芬(Ibuprofen)联合使用，对抑制脂多糖诱导巨噬细胞(RAW264.7)炎症因子的抗炎效果好，药效明显优于单独用药，且用药量低、有效减少单独药物的毒副作用、价格相对便宜。
本发明的另一目的在于提供上述药物组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物，所述药物组合物包括姜黄素和布洛芬；所述姜黄素和布洛芬的摩尔比为(0.5～1)：(2～4)。
优选地，所述姜黄素和布洛芬的摩尔比为(0.75～0.9)：(2.5～3.5)。
更为优选地，所述姜黄素和布洛芬的摩尔比为1：2。
进一步地，还包括药学上可接受的辅料。
所述的药物组合物在制备抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症因子的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的药物组合物包括姜黄素和布洛芬，将姜黄素和布洛芬联合使用，对LPS(脂多糖)诱导巨噬细胞建立的炎症模型有良好的抑制效果，药效明显优于单独用药；而且姜黄素和布洛芬的毒性作用较小，该药物组合物在抑制巨噬细胞炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而降低了单独药物的毒副作用，减少了对人体的伤害。
2.本发明使用的姜黄素和布洛芬原料价格相对便宜，能够有效减轻患者的经济负担。
附图说明
图1为MTT实验的姜黄素的测试数据图。
图2为MTT实验的布洛芬的测试数据图。
图3为Griess实验的姜黄素和布洛芬单独用药的测试数据图。
图4为Griess实验的姜黄素和布洛芬联合用药的测试数据图。
图5为Compusyn 2.0软件分析姜黄素和布洛芬联合剂量效应的Fa-Does曲线图。
图6为Compusyn 2.0软件分析姜黄素和布洛芬联合剂量效应的CI-Fa曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例中使用的一氧化氮检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，该试剂盒包含GriessReagentⅠ试剂和50μLGriessReagentⅡ试剂。
实施例1
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为1：4。将姜黄素和布洛芬分别溶解在二甲基亚砜中配制对细胞没有毒性的浓度测试其性能，姜黄素的浓度为6.25μmol/L，所述布洛芬的浓度为25μmol/L。
实施例2
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.5：2。将姜黄素和布洛芬分别溶解在二甲基亚砜中配制对细胞没有毒性的浓度测试其性能，姜黄素的浓度为3.125μmol/L，所述布洛芬的浓度为12.5μmol/L。
实施例3
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.5：8。将姜黄素和布洛芬分别溶解在二甲基亚砜中配制对细胞没有毒性的浓度测试其性能，姜黄素的浓度为3.125μmol/L，所述布洛芬的浓度为25μmol/L。
实施例4
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为1：2。将姜黄素和布洛芬分别溶解在二甲基亚砜中配制对细胞没有毒性的浓度测试其性能，姜黄素的浓度为6.25μmol/L，所述布洛芬的浓度为12.5μmol/L。
实施例5
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.75：3.5。
实施例6
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.9：3.5。
实施例7
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.9：2.5。
实施例8
一种药物组合物包括姜黄素和布洛芬，姜黄素和布洛芬的摩尔比为0.75：2.5。
测试例1MTT实验
用MTT实验测定不同浓度的姜黄素和布洛芬以及两者联用对RAW264.7巨噬细胞的生长影响，具体实施方案如下：
1.取生长状态良好的RAW264.7细胞，吹打下来后用细胞计数板计数，调整细胞终浓度为5×104个/ml。在96孔板中每孔加入100μl细胞混悬液，置于37℃和5％CO2培养箱中培养24h后，弃去旧培养基；
2.设置姜黄素浓度为25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L和布洛芬的浓度为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L，每个浓度设置4个复孔，同时设置调零孔。5％CO2，37℃培养24h，然后弃去上清液，每孔加入100μl浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，弃上清液，每孔加入150μl分析纯DMSO溶液，在摇床上低速震荡10min使结晶完全溶解。将96孔板置于酶标仪上于570nm处测量各孔的吸光值。
图1为MTT实验的姜黄素的实验结果数据图。从图1中可以看出，姜黄素对RAW264.7细胞的生长影响较小，姜黄素最高浓度为25μmol/L时，其对RAW264.7细胞的抑制率均小于10％。说明姜黄素对RAW264.7细胞的毒性不大。图2为MTT实验的布洛芬的实验结果数据图。从图2中可以看出，布洛芬在浓度为0-100μmol/L范围内，随着药物浓度增加，RAW264.7细胞存活率略有下降，可见布洛芬具有一定的毒性，故选取50μmol/L作为抗炎实验最大浓度。
测试例2Griess实验
基于LPS(脂多糖)诱导姜黄素6.25μmol/L、3.125μmol/L和布洛芬25μmol/L、12.5μmol/L进行单独以及姜黄素和布洛芬联合用药对RAW 264.7细胞产生NO含量的影响。通过Griess实验，具体实施方案如下：
RAW264.7细胞从培养瓶吹打下来后，用完全培养基调整细胞终浓度为5×105个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞混悬液，培养24h后，倒掉上清液，空白组加入100μLDMEM基础培养基，LPS(脂多糖)组加入100μL含100ng/mlLPS的基础DMEM，实验组姜黄素6.25μmol/L，3.125μmol/L，布洛芬25μmol/L、12.5μmol/L，实施例1中姜黄素6.25μmol/L+布洛芬25μmol/L，实施例2中姜黄素3.125μmol/L+布洛芬12.5μmol/L，实施例3中姜黄素3.125μmol/L+布洛芬25μmol/L，实施例4中姜黄素6.25μmol/L+布洛芬12.5μmol/L，使用含100ng/mlLPS的基础DMEM稀释药物浓度，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔。然后置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，每孔取50μL上清液加入另一个96孔培养板中，再往每孔加入一氧化氮检测试剂盒(50μLGriessReagentⅠ试剂和50μLGriessReagentⅡ试剂)，轻轻摇动培养板混匀，用酶标光度计检测540nm波长处的吸光光度值，依据NaNO2标准曲线进行计算一氧化氮(NO)的浓度。
NO是细胞在受到外界病理性刺激时，细胞中会产生诱导型一氧化氮合酶，从而生成高水平的NO，对细胞产生毒害作用，测定NO含量可以判断药物是否产生抗炎效果。细胞中NO通常以亚硝酸盐和硝酸盐的形式存在，本实验利用硝酸盐还原酶把硝酸还原为亚硝酸，再利用Griess法检测亚硝酸含量，从而测出NO浓度。
图3为Griess实验的姜黄素和布洛芬单独用药的实验数据图。图4为Griess实验的姜黄素和布洛芬联合用药的实验数据图。从图3和4中可以看出，随着姜黄素和布洛芬浓度的升高，姜黄素和布洛芬单独用药对LPS诱导的RAW264.7产生NO的抑制效果越明显；而当姜黄素和布洛芬以摩尔比为(0.5～1)：(2～4)进行组合用药时，对LPS诱导的RAW264.7产生NO的抑制效果明显优于单独用药，特别是在姜黄素：布洛芬摩尔比为1：2时，两者联合具有显著的协同作用。同时，结合测试例1的MTT实验结果，可知其实施例4对RAW264.7的毒性作用很小。
测试例3采用Compusyn 2.0软件分析姜黄素和布洛芬联合效应
采用Compusyn 2.0软件分析姜黄素和布洛芬的联合效应，将NO实验测定结果导入Compusyn 2.0，生成Fa-Does曲线图和CI-Fa曲线图。图5为Compusyn2.0软件分析姜黄素和布洛芬联合剂量效应的Fa-Does曲线图。图6为Compusyn2.0软件分析姜黄素和布洛芬联合剂量效应的CI-Fa曲线图。其中，Cur为姜黄素(curcumin)的缩写，Ibu为布洛芬(Ibuprofen)的缩写，Com代表姜黄素和布洛芬联合使用。采用联合作用指数(Combination Index，CI)判断药物组合物的协同性Chou-Talalay药物联合方法基于中效方程，为定量测定药物相互作用的联合指数(CI)等线图方程提供了理论基础，其中CI<1表示协同作用，CI＝1表示加性作用，CI>1表示拮抗作用。
从图5和图6中可以看出，实施例1-4中药物组合物均具有表示出协同作用。其中，特别是实施例4中的姜黄素6.25μmol/L+布洛芬12.50μmol/L的联合用药具有显著的抗炎活性。表1为实施例1-4中药物组合物的CI值。CI值小于1代表有协同作用，同时CI值越小协同作用越好。从表1中可看出，实施例1-4中的药物组合物的联合作用指数CI均小于1，其中实施例4的药物组合物的协同作用最好，结果说明该药物组合物对于LPS诱导的巨噬细胞炎症均具有协同治疗作用。
表1实施例1-4中药物组合物的CI值
姜黄素/μmol/L 布洛芬/μmol/L 联合作用指数CI
实施例1 6.25 25 0.11
实施例2 3.125 12.5 0.14
实施例3 3.125 25 0.047
实施例4 6.25 12.5 0.06
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由姜黄素和布洛芬组成；所述姜黄素和布洛芬的摩尔比为（0.75~0.9）：（2.5~3.5）。
2.根据权利要求1所述的用于抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。
3.权利要求1或2所述的药物组合物在制备抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞炎症因子的药物中的应用。
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