CN112022846B - 一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，所述吲哚啉衍生物的结构如下所示：
Figure DDA0002696905640000011
该吲哚啉衍生物能够抑制Caspase11诱导的巨噬细胞焦亡，能够抑制促炎细胞因子IL‑1α和IL‑1β、TNF‑α和IL‑6的释放，以及通过抑制OMV介导的LPS入胞的药物和/或抑制网格蛋白介导的内吞从而抑制LPS入胞进而抑制细胞凋亡。因此证明该吲哚啉衍生物对脓毒症具有一定的治疗作用，为临床治疗脓毒症提供了新的治疗方法和治疗药物。

Description

一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用。
背景技术
脓毒症(sepsis，又称为败血症)是感染诱发的以多脏器衰竭为特征的危急重症，具有起病急和病情重的特点，死亡率高达40％。其常见的临床症状包括发烧、呼吸频率和心跳加速，以及意识不清，严重的脓毒症会导致供应组织的血流不足甚至引起器官衰竭以及感染性休克，严重威胁患者的生命安全。目前，早期液体复苏、早期使用抗生素及器官功能支持等治疗在一定程度上降低了脓毒症的死亡率，但脓毒症仍然是重症病监护室(ICU)患者死亡的首要原因。
脓毒症的发病机制十分复杂，近年来，在一些研究中揭示了新的脓毒症发病机制：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-11(cysteinyl aspartate specific proteinase-11，Caspase-11)介导的炎性小体活化诱导细胞焦亡(Pyroptosis)在脓毒症中扮演重要的角色[1-7]。这些研究发现Caspase-11是细菌内毒素(Lipopolysaccharides，LPS)的细胞内受体[1-4]，LPS进入细胞浆后，能直接结合Caspase-11并使之活化；活化的Caspase-11将其下游Gasdermin D(GSDMD)蛋白剪切成具有破膜功能的肽段，后者在细胞膜上聚集，形成细胞膜孔道，进而引起细胞肿胀、裂解；该过程伴有大量促炎细胞因子如白介素-1α(IL-1α)和白介素-1β(IL-1β)等的释放[5-7]。敲除IL-1α或IL-1β基因对内毒素血症模型小鼠的生存率无影响；但敲除Caspase-11或GSDMD基因能显著提高小鼠在脓毒症和内毒素血症中的生存率[1-7]。上述研究表明：Caspase-11介导的细胞焦亡在脓毒症和内毒素血症的致死环节上发挥极其重要作用。相关机制研究发现：Caspase-11主要表达于单核巨噬细胞和血管内皮细胞。脓毒症中单核巨噬细胞Caspase-11活化诱导细胞焦亡后产生大量的花生四烯酸，导致全身血管通透性增加和大量血管内液外渗[1-7]；血管内皮细胞Caspase-11活化诱导的细胞焦亡导致微循环障碍[8]；最终造成机体低容量性休克、多脏器功能衰竭甚至死亡。
外膜囊泡(Outer membrane vesicle，OMV)是由多种细菌释放出来的膜包裹的实体，富含微生物成分、毒素和毒性因子。OMV可以将脂多糖(LPS)注入宿主细胞胞浆，激活caspase-11介导脓毒症的发生发展[9]。
吲哚啉最主要用途是医药和农药合成的中间体，以三乙基苄基氯化铵为催化剂与芳醛反应可合成一系列(E)-3-亚苄基-2，3-二氢吲哚-2-酮衍生物，还可以合成溴芬酸钠，是非甾体消炎药，具有强力镇痛作用。吲哚啉类染料用作准固态染料敏化太阳能电池的敏剂，具有良好的光电转化性能。
目前治疗脓毒症的药物主要以糖皮质激素等非特异性治疗以防治器官功能衰竭和休克等对症治疗为主。虽然控制感染的治疗方法能缓解脓毒症症状，延长患者生命，但治标不治本。因此，开发新的脓毒症治疗的药物以应用于临床治疗具有重要的意义。目前也没有关于吲哚啉衍生物应用于脓毒症治疗的报道。
参考文献：
1.Kayagaki N,Warming S,Lamkanfi M,Vande Walle L,Louie S,Dong J,NewtonK,Qu Y,Liu J,Heldens S,Zhang J,Lee WP,Roose-Girma M,Dixit VM.Non-canonicalinflammasome activation targets caspase-11.Nature.2011,479(7371):117-121.
2.Hagar JA,Powell DA,Aachoui Y,Ernst RK,Miao EA.Cytoplasmic LPSactivates caspase-11:implications in TLR4-independent endotoxicshock.Science.2013,341(6151):1250-1253.
3.Kayagaki N,Wong MT,Stowe IB,Ramani SR,Gonzalez LC,Akashi-TakamuraS,Miyake K,Zhang J,Lee WP,Muszynski A,Forsberg LS,Carlson RW,DixitVM.Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent ofTLR4.Science.2013,341(6151):1246-1249.
4.Shi J,Zhao Y,Wang Y,Gao W,Ding J,Li P,Hu L,Shao F.Inflammatorycaspases are innate immune receptors for intracellular LPS.Nature.2014,514(7521):187-192.
5.Kayagaki N,Stowe IB,Lee BL,O'Rourke K,Anderson K,Warming S,CuellarT,Haley B,Roose-Girma M,Phung QT,Liu PS,Lill JR,Li H,Wu J,Kummerfeld S,ZhangJ,Lee WP,Snipas SJ,Salvesen GS,Morris LX,Fitzgerald L,Zhang Y,Bertram EM,Goodnow CC,Dixit VM.Caspase-11cleaves gasdermin D for non-canonicalinflammasome signalling.Nature.2015,526(7575):666-671.
6.Shi J,Zhao Y,Wang K,Shi X,Wang Y,Huang H,Zhuang Y,Cai T,Wang F,ShaoF.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic celldeath.Nature.2015,526(7575):660-665.
7.Liu X,Zhang Z,Ruan J,Pan Y,Magupalli VG,Wu H,LiebermanJ.Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membranepores.Nature.2016Jul 7；535(7610):153-8.
8.Cheng KT,Xiong S,Ye Z,Hong Z,Di A,Tsang KM,Gao X,An S,Mittal M,Vogel SM,Miao EA,Rehman J,Malik AB.Caspase-11-mediated endothelial pyroptosisunderlies endotoxemia-induced lung injury.J Clin Invest.2017Nov 1；127(11):4124-4135.
9.Jan,A.T.Outer Membrane Vesicles(OMVs)of Gram-negative Bacteria:APerspective Update.Front Microbiol,2017,8,1053.
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，所述药物对脓毒症有良好治疗作用。
本发明还提出上述吲哚啉衍生物的在制备脓毒症相关药理途径中抑制剂的应用。
根据本发明的第一方面实施例的吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，所述吲哚啉衍生物的结构式如下所示：
Figure BDA0002696905620000031
根据本发明实施例的吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，至少具有如下有益效果：所述吲哚啉衍生物用于制备治疗脓毒症药物，证明其能够抑制细胞焦亡，抑制促炎细胞因子IL-1α、IL-1β等的产生，对脓毒症具有潜在的治疗效果。
在本发明中，脓毒症还包括脓毒症相关疾病，如内毒素血症(endotoxemia)、严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒性休克(septic shock)等。都属于由革兰氏阴性菌导致全身性感染，进而引发的全身多脏器功能障碍等症状，其致病原因和治疗方法具有相似性。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内细胞焦亡的药物。
细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡的特征为依赖于炎性半胱天冬酶(主要是Caspase-1，4，5，11)，并伴有大量促炎细胞因子的释放。OMV可以将脂多糖(LPS)注入宿主细胞胞浆，激活caspase-11诱导细胞焦亡。
进一步地，抑制细胞焦亡为抑制Caspase11依赖的细胞焦亡。
进一步地，抑制细胞焦亡为抑制OMV活化Caspase11诱导的细胞焦亡。
进一步地，所述细胞为巨噬细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内促炎细胞因子分泌的药物。
进一步地，所述促炎细胞因子包括IL-1α、IL-1β。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内LPS入胞的药物。
进一步地，抑制LPS入胞能够抑制Caspase11依赖的细胞焦亡。
进一步地，抑制LPS入胞的细胞为巨噬细胞。
进一步地，所述能够抑制感染脓毒症动物体内LPS入胞的药物为能够抑制OMV介导的LPS入胞的药物。即该吲哚啉衍生物是抑制OMV介导的LPS入胞。
进一步地，所述能够抑制感染脓毒症动物体内LPS入胞的药物为抑制网格蛋白介导的内吞的药物。即该吲哚啉衍生物是抑制网格蛋白介导的内吞进而抑制LPS入胞。
根据本发明的一些实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
根据本发明的一些实施方式，所述药物根据需要被制成任何一种药学上可接受的制剂，例如制备成口服给药制剂：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、口服剂等；制备成直肠给药制剂：栓剂、灌肠剂；制备成注射给药制剂：肌肉注射制剂、静脉注射制剂等。
根据本发明第二方面实施例吲哚啉衍生物的在制备脓毒症相关药理途径中抑制剂的应用，用，所述吲哚啉衍生物的结构式如下所示：
Figure BDA0002696905620000051
还提出了所述吲哚啉衍生物在制备细胞焦亡抑制剂中的应用；或
所述吲哚啉衍生物在制备促炎细胞因子抑制剂中的应用。
根据本发明的一些实施例，所述促炎细胞因子包括IL-1α、IL-1β。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物的LDH检测实验结果；
图2为本发明实施例1中化合物的细胞因子的ELISA检测实验结果，其中(a)为IL-1α的含量测试图，(b)为IL-1β的含量测试图；
图3为本发明实施例2中化合物与OMV电转细胞的LDH检测实验的对照结果；
图4为本发明实施例2中鲎试验检测胞浆内LPS含量结果图；
图5为本发明实施例3中AP2a1的相对表达量图；
图6为本发明实施例3中AP2a2的相对表达量图；
图7为本发明实施例3中AP2b1的相对表达量图；
图8为本发明实施例3中AP2m1的相对表达量图；
图9为本发明实施例3中化合物对AP2磷酸化影响的凝胶电泳图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
若无特殊说明，以下实施例中的实验试剂和材料均为商业购得。以下实施例中使用的化合物为吲哚啉衍生物：
Figure BDA0002696905620000061
购买自selleck公司。
实施例1：化合物抑制OMV活化Caspase11诱导的原代巨噬细胞焦亡
1、实验步骤：提取野生型(WT)小鼠腹腔原代巨噬细胞，通过细胞计数板计数,用RPMI-1640完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×106个/ml，1ml/well种12孔板。细胞贴壁过夜后DPBS洗涤细胞2次，化合物5μM，10μM预处理巨噬细胞1h后加入细菌外膜囊泡(OMV)10μg/ml终浓度刺激，16h后收集细胞上清用于乳酸脱氢酶LDH检测(细胞毒性试验)和ELISA检测(检测促炎细胞因子IL-1α、IL-1β含量)。
具体实验操作如下：
1)提取小鼠原代腹腔巨噬细胞：腹腔注射3％巯基乙酸盐培养基(3ml/只)，3-4天后，小鼠腹腔注射10mlRPMI1640培养基，轻揉小鼠腹部后用注射器回抽腹腔灌洗液，重复1次，收集于离心管中，800rpm离心5分钟弃上清。以5～10ml RPMI1640完全培养基重悬细胞，显微镜下细胞计数后调整细胞浓度至1×106个/ml，100μl/well种96孔板，贴壁过夜。
2)加药刺激：使用DPBS洗涤细胞2次以去除未贴壁悬浮细胞，换成1640无血清培养基，化合物10μM/孔终浓度预处理1h后，再加入OMV 10μg/ml(室温预孵育20min)刺激细胞过夜(实验还包括对照组：不加OMV；只加OMV不加化合物)；
3)收细胞上清检测乳酸脱氢酶(LDH)、细胞因子IL-1α、IL-1β含量。
a.细胞死亡率实验(乳酸脱氢酶LDH检测)：
实验步骤：向对照组中加入100μl LDH释放试剂，再加入RPMI-1640培基补齐至原体积混匀，室温孵育1h。将上清收集到1.5ml EP管，置于4度离心机中，以500rpm离心5min，然后将上清转移到新的EP管中。再配置LDH检测工作液即：乳酸溶液，碘硝基氯化四氮唑(INT)溶液(1X)，酶溶液按1:1:1混合。取96孔板，首先向各孔加入80μl RPMI-1640培基，再加入各待测样品60μl，然后向各孔分别加入60μl LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。
数据处理：按下述公式进行计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)：
细胞死亡率(％)＝(处理样品吸光度﹣样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度﹣样品对照孔吸光度)×100。
b.ELISA检测(细胞因子检测)：通过ELISA检测试剂盒分别检测上清样品中IL-1α、IL-1β的含量。分别用IL-1α、IL-1β包被抗体包被酶标板，4度过夜。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。1×Assay buffer室温封闭1h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次，加入相应的待测样本及细胞因子标准品，摇床上室温孵育2h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。加入相应的检测抗体室温摇床孵育1h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。最后加入HRP摇床室温孵育30min。0.05％PBST清洗5次后TMB显色，2M硫酸终止显色。450nm处测定吸光度。
2、实验结果：本实施例的细胞毒性实验的实验结果如图1所示(图中，CON为对照组，OMV为只加OMV，OMV+5μM为加5μM化合物的实验组，OMV+10μM为加10μM化合物的实验组，10μM为加10μM化合物的对照组)，从图1可以看出，细胞上清中乳酸脱氢酶含量(LDH检测)随化合物的加入大幅降低，当化合物的浓度为5μM时即有很好的作用效果，说明化合物的加入能使得降低细胞死亡率，抑制Caspase11诱导的巨噬细胞焦亡。本实施例的ELISA检测由图2所示，图2中的(a)为IL-1α的含量测试图，(b)为IL-1β的含量测试图，从图中看出，当化合物加入后，促炎细胞因子IL-1α、IL-1β的含量均显著降低，说明化合物抑制了促炎细胞因子的释放。
LPS进入细胞浆后，能直接结合Caspase-11并使之活化，活化后的Caspase-11会引发后续级联反应导致细胞焦亡从而产生大量促炎细胞因子，其介导的细胞焦亡在脓毒症和内毒素血症的致死环节上发挥极其重要作用。本实验证明了加入化合物的试验组中的促炎细胞因子IL-1α、IL-1β的含量均有降低，说明化合物抑制了活化Caspase11诱导的原代巨噬细胞焦亡。同时，脓毒症的主要发病原因也包括大量促炎细胞因子的产生和释放导致机体内免疫紊乱，因此，证实化合物能够降低细胞毒性，降低细胞死亡率，以及进一步抑制促炎细胞因子的释放则说明该化合物对于脓毒症具有一定的治疗效果。
实施例2：化合物抑制OMV介导的LPS入胞从而抑制细胞焦亡
1、实验步骤：提取WT小鼠原代腹腔巨噬细胞，通过细胞计数板计数,用RPMI-1640完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×10^6个/ml，2ml/well种6孔板。贴壁过夜后DBPS洗涤细胞2次换成无血清1640。化合物10μM终浓度加入细胞预孵育1h，再加入OMV10μg/ml刺激细胞2h，DPBS洗涤细胞3次后，0.25％胰酶300μl/孔消化细胞，400μl/孔1640完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞转至1.5ml无菌无酶EP管，DPBS洗涤细胞3次后，加入0.005％毛地黄皂苷(digitonin)200μl/EP管冰上裂解10～15min，13000rpm，4℃离心20min后取上清做鲎试验检测胞浆内LPS含量。
2、实验结果：图3为化合物与OMV电转细胞的LDH检测实验的对照结果图，从图3结果可以看出，与单独电转LPS组相比，同时电转LPS+抑制剂组并未降低细胞死亡，侧面反映化合物是通过抑制入胞从而抑制细胞焦亡。图4为鲎试验检测胞浆内LPS含量结果图，鲎试验检测胞浆内LPS含量的结果显示，化合物组的胞内LPS含量明显降低。由此说明化合物是通过抑制LPS入胞从而抑制Caspase11依赖的细胞焦亡。
由于Caspase-11是位于细胞浆内的蛋白，而LPS不能穿越细胞膜至细胞浆，因此，将LPS转运至细胞浆内是活化Caspase-11的关键，抑制LPS入胞过程是抑制Caspase-11活化、抑制细胞焦亡、进而治疗脓毒症的一个有效手段。上述实验结果说明，当加入化合物后鲎试验检测胞内LPS含量显著降低，同时，化合物与LPS同时电转入细胞内并未降低细胞死亡，说明化合物通过抑制OMV介导的LPS入胞从而抑制细胞焦亡，因此，证明化合物对脓毒症等相关疾病具有一定的治疗效果。
实施例3：化合物抑制网格蛋白介导的内吞抑制LPS入胞
1、QPCR检测化合物对AP2不同亚基相对表达量的影响：
实验步骤：QPCR检测化合物对AP2不同亚基(AP2a1、AP2a2、AP2b1和AP2m1)相对表达量的影响：提取WT小鼠腹腔原代巨噬细胞，通过细胞计数板计数,用RPMI-1640完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×10^6个/ml，2ml/well种6孔板。贴壁过夜后用D-PBS清洗细胞3次，换无血清1640,分别用化合物2.5μM，5μM处理巨噬细胞1h，然后加入OMV10μg/ml处理巨噬细胞，4-6h之后收集细胞RNA。通过逆转录试剂盒将收集的RNA逆转录得到cDNA，最后通过Real-time PCR的方法分别检测AP2a1、AP2a2、AP2b1和AP2m1的表达情况，图5～图8表示化合物对AP2基因相对表达量基本无影响。
2、检测AP2磷酸化水平影响：
实验步骤：Westernblot检测AP2磷酸化水平：提取小鼠腹腔原代巨噬细胞，通过细胞计数板计数，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×10^6个/ml，1ml/well种12孔板。次日弃去旧的培养基，用D-PBS清洗细胞3次，换无血清1640，分别用化合物5μM，10μM处理巨噬细胞，1h，之后加入OMV 10μg/ml处理巨噬细胞，16h之后收集细胞总蛋白即通过蛋白裂解液(裂解液中按比例加入cocktail蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂)在冰上裂解细胞蛋白45min。冰盒置于摇床上以确保裂解液与细胞充分接触。然后用预冷的细胞刮将细胞收集到EP管中，4度，13000g离心15min，收集上清为裂解得到的细胞蛋白，进行Westernblot检测AP2磷酸化水平检测，图9为化合物对AP2磷酸化影响的凝胶电泳图。从图9可以看出，化合物通过抑制网格蛋白配体AP2磷酸化水平，从而抑制网格蛋白介导的OMV入胞。
2、实验结果分析：化合物对AP2 mRNA相对表达无影响，而对AP2磷酸化水平有影响说明可能通过影响网格蛋白配体AP2功能从而影响网格蛋白介导的内吞。革兰氏阴性菌细菌外囊泡OMV是通过网格蛋白介导的内吞作用从而将LPS带入细胞内，网格蛋白不直接与内吞“货物”发生相互作用而是通过网格蛋白配体AP2的招募启动包被液泡形成进而完成内吞作用。说明化合物抑制网格蛋白配体AP2磷酸化水平从而抑制网格蛋白介导的LPS入胞。
综上所述，本发明提供的吲哚啉衍生物能够抑制Caspase11诱导的巨噬细胞焦亡，能够抑制促炎细胞因子IL-1α和IL-1β的释放，以及通过抑制OMV介导的LPS入胞的药物和/或抑制网格蛋白介导的内吞从而抑制LPS入胞进而抑制细胞凋亡。因此证明该吲哚啉衍生物对脓毒症具有一定的治疗作用，为临床治疗脓毒症提供了新的治疗方法和治疗药物。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种吲哚啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述吲哚啉衍生物的结构如下所示：
Figure FDA0003089014910000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内细胞焦亡的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内促炎细胞因子分泌的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子包括IL-1α和IL-1β。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内LPS入胞的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述能够抑制感染脓毒症动物体内LPS入胞的药物为能够抑制OMV介导的LPS入胞的药物和/或抑制网格蛋白介导的内吞的药物。
7.根据权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
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