CN112021461A - 一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，该方法以酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α‑factor蛋白菌液作为抑制剂，进行断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制。对于抑制剂——重组质粒pYES2/PR1/α‑factor蛋白菌液，是通过构建克隆到酿酒酵母中的PR1蛋白，引导质粒重组蛋白进入分泌途经，使之从胞内表达变成分泌表达，以实现黄曲霉毒素的生长有效抑制。

Description

一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法
技术领域
本发明公开涉及饲料的技术领域，尤其涉及一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法。
背景技术
在仔猪断奶的特殊生长期，猪的营养来源从主要依靠母乳转变到自取觅食的饲料供应，需要适应母乳到饲料的变化。因此，断奶仔猪饲料将以“高能量，精营养，易消化”为特点，日粮中通常添加口服合成精氨酸、植物提取物、熟化谷物及优化肠道环境的酸化剂等深加工营养源，以避免环境变化可能引起断奶仔猪应激反应，而导致仔猪的采食量下降，抑制仔猪的生长。
黄曲霉毒素，是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，断奶仔猪如果在断奶的特殊生长期食用了含有黄曲霉毒素的饲料不仅会影响仔猪的生长，而且甚至会导致仔猪生病，因此，对于断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制至关重要。
由于断奶仔猪饲料考虑了断奶仔猪所处的特殊时期，增加了各种营养成分，导致断奶仔猪饲料成为了黄曲霉毒素易于生长和繁殖的环境，因此，如何对断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素进行有效的抑制，同时还不改变断奶仔猪饲料的营养成分，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，以实现黄曲霉毒素的有效抑制。
本发明提供的技术方案，具体为，一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，该方法以酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液作为抑制剂，添加到所述断奶仔猪饲料中，抑制所述黄曲霉毒素的生成。
优选，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度大于等于900μL。
进一步优选，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度大于等于1500μL。
进一步优选，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度为1500μL。
进一步优选，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液是将PR1蛋白的PCR回收产物和重组质粒pYES2/α-factor用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，进行重组质粒pYES2/PR1/α-factor的酵母菌转化，并在酿酒酵母表达中诱导表达获得。
进一步优选，所述重组质粒pYES2/α-factor是将α-factor片段和质粒pYES2用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切获得。
本发明提供的断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，以酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液作为抑制剂，进行断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制。对于抑制剂——重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液，是通过构建克隆到酿酒酵母中的PR1蛋白，引导质粒重组蛋白进入分泌途经，使之从胞内表达变成分泌表达，以实现黄曲霉毒素的生长有效抑制。
重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液是通过PCR技术扩增出了带有酶切位点的信号肽α-factor以及带有His-tag和酶切位点的PR1基因。将两个基因连接到质粒pYES2中，构建了重组质粒pYES2/PR1/α-factor。用醋酸锂转化法将其转化进酿酒酵母表达INVScI中，半乳糖诱导表达后，收集菌液，制得抑制剂-酿酒酵母表达PR1蛋白。并完成了SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白。进一步，针对植物病原所具有的生物抗性，酿酒酵母表达的重组质粒PR1蛋白菌液的防霉性，阻断黄曲霉对饲料营养成分的利用，因此，将活性蛋白开发成为一种理想新型的生物抑菌剂，研发能够分泌活性蛋白的pYES2/PR1/α-factor重组活菌。实现基因干预抑制目标基因的表达。且完成了酿酒酵母表达的重组PR-1蛋白的防霉抑菌功能的显著性检测，首次将酿酒酵母表达的重组PR-1蛋白在饲料储藏中得以验证，获取了在不同领域的应用前景。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度对抑制黄曲霉毒素的抑制曲线；
图2为培养温度对酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液抑制黄曲霉毒素的影响曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的解释说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。
为了验证酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液对于黄曲霉毒素具有抑制作用，分别以酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度、黄曲霉毒素的培养温度为实验对象，其他条件不变，分别设置不同的水平，测定重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液对黄曲霉毒素的抑制率。
实施例1
黄曲霉毒素的提取
黄曲霉毒素的提取在通风橱中进行，根据AOAC标准测定的方法。将样品(每份称取1g)在液氮中磨碎，每份样品加入3倍体积的丙酮，震荡30min后，加入等体积的氯仿，继续震荡30min。用Whatman No.4定性滤纸过滤，于玻璃瓶中收集滤液。在36℃的氮气下将收集的滤液蒸发晾干。再将玻璃瓶中的黄曲霉毒素样品重悬于500μL乙腈中，悬液置于0.45μm过滤离心柱中，8000r/min离心1min。
实施例2
高效液相色谱法(HPLC)检测黄曲霉毒素
色谱条件：色谱柱Nova-Pak C18反相色谱柱(有保护柱，温度可以维持在38℃)；流动相，水：甲醇：正丁醇(1400:720:15，V/V/V)；流速控制0.8mL/min；进样量为10μL；荧光检测器激发波长为365nm，发射波长435nm；运行时间22min。标准品为黄曲霉B1含量50ng/mL，通过一系列的稀释标准品构建AFB1的高线性(R2＝0.9934)标准曲线。AFB1的LOQ值为2ng/kg。最后的测定结果为三个平行的平均值。
实施例3
采用表观评估法评估黄曲霉生长实验
黄曲霉菌感染颗粒饲料后，根据传统的分级标准评估籽粒染菌程度和HPLC测定方法有很高的一致性，本研究不用精确毒素含量，因此，选用表观评估法对黄曲霉菌感染颗粒饲料情况进行评定。根据黄曲霉对饲料籽粒的感染指数划分，R(抗)：感染指数<5.0；MR(中抗)：感染指数5.1-10.0；MS(中感)：感染指数10.1-30.0；S(感)：感染指数30.1-50.0；HS(高感)：感染指数>50.1。
实施例4
酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度对抑制黄曲霉毒素的影响
利用自制的脉冲强光杀菌装置，闪照次数40-50次、处理电压3kV、3-5粒颗粒/cm2对颗粒饲料进行了杀菌。将无菌处理颗粒饲料分为7等份，每份1公斤，其中5份为供试组(T)，1份为空白组，1份为阳性对照组(C)。进一步，将酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度设置5个梯度，分别为900μL、1200μL、1500μL、1800μL、2100μL。以此作为供试组的抑菌剂工艺参数；经过4×106CFU/mL的黄曲霉孢子悬液处理的最后1份颗粒饲料为空白对照组；将加入0.4ng/μL的丁基羟基甲苯(BHT)的颗粒饲料作为阳性对照组。用不加任何抑制剂处理的无菌颗粒饲料为阴性对照组。自制5套密闭卧式混合搅拌装置，每套内设喷洒头。首先，采用边搅拌边喷淋，完成一定浓度的菌液侵染。实现抑菌剂酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度均匀分布在供试组颗粒饲料表面。然后将供试组颗粒平展于表面灭菌的不锈钢托盘中。待表面的液体干了之后，分别置于100mL的无菌锥形瓶中，接种浓度为4×106CFU/mL的黄曲霉孢子悬液2mL，轻轻摇动锥形瓶使颗粒饲料均匀沾满孢子。将处理好的样品置于恒温培养箱中32℃培养8d。观察抑菌剂PR1蛋白表达菌液对黄曲霉毒素产生的抑制情况，具体见表1。
表1：酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度对抑制黄曲霉毒素的影响
Figure BDA0002685358950000041
注：a:-T或-C代表是供试组或对照组；b：(1-T/C)即酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液对黄曲霉毒素B1的抑制率，可以反映酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的抑制效果，数值越大抑制效果越好，完全没有抑制效果时数值为0。
其中，图1为酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度对抑制黄曲霉毒素的抑制曲线。
由表1和图1可知，随着酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液浓度的增加，酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液对黄曲霉毒素抑制率也随之增加。在PR1蛋白表达菌液浓度达到1500μL时，抑制率增加较明显。当PR1蛋白表达菌液浓度大于1500μL，抑制率虽然增加，但增幅较小。
实施例5
培养温度对酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液抑制黄曲霉毒素的影响
对无菌处理的颗粒饲料加入浓度为1500μg/mL酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液。将其均匀的喷洒在无菌颗粒饲料的表面，待表面的液体干了之后，分别置于500mL的无菌锥形瓶中，加入0.1％氯化汞水溶液浸泡3min，无菌水漂洗3次，供试品颗粒饲料接种黄曲霉孢子悬液8mL，轻轻摇动锥形瓶使颗粒饲料均匀沾满孢子。接种浓度为4×106CFU/mL黄曲霉孢子悬液1mL。真菌最适宜的繁殖温度范围一般为25-35℃，分别将处理好的颗粒饲料放入温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃的恒温培养箱中，作为供试组。在每个温度下分别用0.4ng/μL的丁基羟基甲苯(BHT)处理的颗粒饲料作为阳性对照组，用4×106CFU/mL的黄曲霉孢子悬液处理的颗粒饲料为空白对照组。黑暗培养8d，观察该抑菌剂对黄曲霉毒素产生的抑制率，具体结果见表2。
表2：培养温度对黄曲霉毒素抑制的影响
Figure BDA0002685358950000051
注：a:C--T，C为对照组，T为供试组；b:P≤0.05，所有数据均为三次三组的平均结果。
图2为培养温度对酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液抑制黄曲霉毒素的影响曲线。
由表2和图2可知，随着培养温度的增加，抑制率也逐渐增加。当培养温度达到32℃时，抑制率最大。培养温度继续增加，抑制率反而下降，是因为高温能够抑制黄曲霉自身的生长。故选择培养温度32℃较合适。
实施例6
黄曲霉对酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液干预下颗粒饲料中粗脂肪、粗蛋白和总糖类的利用情况。用索氏提取法测定颗粒饲料中粗脂肪的含量、用凯氏定氮法测定颗粒饲料中粗蛋白的变化、用直接滴定法测定颗粒饲料中总糖的变化，具体见表3、表4、表5。
表3：颗粒饲料中粗脂肪含量的变化
Figure BDA0002685358950000061
注：P≤0.05，所有数据均为三次三组的平均结果。
表4：颗粒饲料中粗蛋白含量的变化
Figure BDA0002685358950000062
Figure BDA0002685358950000071
注：P≤0.05，所有数据均为三次三组的平均结果。
表5：颗粒饲料中总糖的变化
Figure BDA0002685358950000072
注：P≤0.05，所有数据均为三次三组的平均结果。
由表3、表4、表5均可知，当PR1蛋白表达浓度大于1500μL时颗粒饲料中粗脂肪、粗蛋白和总糖三种营养成分被感染的变化量差距明显减少。证明其抑制黄曲霉毒素的效果显著性大幅降低。因此，PR1蛋白表达浓度为1500μL时，抑制颗粒饲料感染黄曲霉最佳，防霉作用最具实际价值。
以下内容对于试验中酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的制备进行了详细的解释说明。
1、试验材料
1.1、试验菌种和质粒
大肠杆菌DH5α：该菌种由美国农业部南方研究中心提供；
酵母菌INVScI：该菌种由美国农业部南方研究中心提供；
质粒pYES2：该质粒由美国农业部南方研究中心提供；
质粒pET28a：该质粒由美国农业部南方研究中心提供；
质粒pPIC9：该质粒由美国农业部南方研究中心提供。
1.2、试验主要化学试剂
LB干粉培养基：Fisher Scientific公司；
YPD干粉培养基：Sigma公司；
不含氨基酸的YNB干粉培养基：Fisher Scientific公司；
营养缺陷混合物(-Ura Do Suplement)：Fisher Scientific公司；
琼脂糖凝胶：AMRESCO公司；
氨苄霉素：SIGMA公司；
半乳糖：SIGMA公司；
各种限制性内切酶：NEB公司；
T4 DNA连接酶：NEB公司；
质粒提取试剂盒：QIAGEN公司；
胶回收试剂盒：QIAGEN公司；
PCR试剂盒：NEB公司；
PCR纯化试剂盒：QIAGEN公司；
His标签蛋白纯化镍磁珠：Millipore公司；
一级抗体：SIGMA公司；
二级抗体：BIO-RAD公司。
1.3、仪器与设备
分析天平：METTLER TOLEDO公司；
PCR仪：MyCycler公司；
核酸蛋白分析仪：NanoDrop公司；
分光光度仪：BioSpec-mini公司；
凝胶电泳槽：Labnet公司；
Western-Blot Thermo：Scientific公司；
离心机：Eppendorf公司；
涡旋震荡器：Scientific Industries公司。
3、试验方法
3.1、大肠杆菌的培养
固体培养基活化
①培养基的配制
准确称取LB干粉培养基25g、琼脂6.5g和蒸馏水1000mL，搅拌溶解，121℃高压灭菌30min，倒入40个一次性平皿，每个平皿中培养基约为25mL。
②操作步骤
用紫外灯将超净工作台灭菌30min。在无菌操作条件下，将E.coliDH5α菌种划线接种于LB琼脂平板培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养16h后，置于4℃的冰箱中冷藏保存。
液体培养基活化
①液体培养基的配制
准确称量LB干粉培养基25g，蒸馏水1000L，搅拌溶解，121℃高压灭菌30min。
②操作步骤
在无菌操作条件下从已培养好的固体平皿培养基上挑取E.coliDH5α菌落接种于LB液体培养基中，于37℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养16h后，置于4℃的冰箱中冷藏备用。
③甘油菌种的制备
按严格的无菌操作用移液枪从已培养好的E.coliDH5α菌液中吸取750μL置于1.5mL EP管中，再加入250μL无菌甘油，制成甘油菌种，于-80℃的冰箱中冷冻保存。
3.2、酵母菌的培养
固体培养基活化
①培养基的配制
完全培养基：准确称取50gYPD干粉培养基和15g琼脂，蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解，121℃高压灭菌30min。
诱导培养基：准确称量不含有氨基酸的YNB干粉培养基3.4g、营养缺陷混合物(-Ura Do Suplement)0.385g和琼脂7.5g，蒸馏水定容至450mL。121℃高压灭菌30min。准确称量10g半乳糖，50mL蒸馏水溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。加入已灭菌好的450mL培养基中。倒入20个一次性平皿，每个平皿中培养基体积约为25mL。
②操作步骤
用紫外灯将超净工作台灭菌30min。在无菌操作条件下，将酿酒酵母表达INVScI菌种划线接种于YPD琼脂平板培养基上，30℃恒温培养箱中倒置培养2d后，置于4℃的冰箱中冷藏保存。
液体培养基活化
①液体培养基的配制
完全培养基：准确称取50gYPD干粉培养基，蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解，121℃高压灭菌30min。
生长培养基：准确称量不含有氨基酸的YNB干粉培养基3.4g、营养缺陷混合物(-Ura Do Suplement)0.385g和葡萄糖10g，蒸馏水定容至500mL。121℃高压灭菌30min。
诱导培养基：准确称量不含有氨基酸的YNB干粉培养基3.4g和营养缺陷混合物(-Ura Do Suplement)0.385g，蒸馏水定容至450mL。121℃高压灭菌30min。准确称量10g半乳糖，50mL蒸馏水溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。加入已灭菌好的450mL培养基中。
②操作步骤
在无菌操作条件下从已培养好的固体平皿培养基上挑取酿酒酵母表达INVScI菌落接种于液体培养基中，于30℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养16h后，置于4℃的冰箱中冷藏备用。
③甘油菌种的制备
按严格的无菌操作用移液枪从已培养好的酿酒酵母表达INVScI菌液中吸取750μL置于1.5mL EP管中，再加入250μL无菌甘油，制成甘油菌种，于-80℃的冰箱中冷冻保存。
3.3、氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备
在无菌操作条件下，从已培养好的平板培养基上挑取E.coliDH5α单菌落接种于5mL LB液体培养基中。在37℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养16h。吸取菌液0.5mL，按照1:100的比例接种于新的50mL LB培养基中。在37℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养2h，至菌液的OD值为0.35-0.5。将菌液转移到无菌冰冷的50mL离心管中冰浴30min。冰浴后于4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，将离心管倒置1min，干燥沉淀。加入2mL冰冷的0.1M CaCl2重悬浮沉淀，4℃，5000r/min，离心10min，用移液管温和加入30mL冰冷的CaCl2，冰浴10min。弃上清液，加入2mL冰冷的CaCl2溶解沉淀，分装，每次反应用200μL CaCl2感受态细胞。
3.4、质粒提取
碱性裂解法提取质粒
①溶液的配制
碱性裂解溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(PH 8.0)，EDTA(PH 8.0)。准确称量葡萄糖0.473g，吸取1M Tris-HCl储存液1.25mL、0.5M EDTA储存液1mL，加蒸馏水至50mL。高压灭菌15min，4℃的冰箱中冷藏保存。
碱性裂解溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1％SDS。准确吸取1M NaOH储存液2mL，称取0.1gSDS，加蒸馏水至10mL。使用前配制。
碱性裂解溶液Ⅲ：醋酸钾缓冲液，PH4.8。准确量取5M醋酸钾30mL，醋酸5.75mL，加蒸馏水至50mL，于4℃的冰箱中保存备用。
10×TE：100mM Tris-HCl(PH 8.0)，10mM EDTA(PH 8.0)。吸取1M Tris-HCl储存液5mL、0.5M EDTA储存液1mL，加蒸馏水至50mL。高压灭菌15min，4℃的冰箱中冷藏保存。
STE：10mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，0.1M NaCl。吸取1M Tris-HCl储存液0.5mL、0.5M EDTA储存液0.1mL，1M NaCl储存液5mL。高压灭菌15min，4℃的冰箱中冷藏保存。
②操作步骤
将5mL带有重组pET28a质粒的E.coliDH5α新鲜菌液于4℃，13000r/min，离心30s，弃上清，加入1mL无菌水重悬浮沉淀并移至1.5mL EP管中，再次4℃，13000r/min，离心30s，倒弃上清液。加入冰浴的STE溶液0.375mL重悬浮沉淀4℃，13000r/min，离心30s，倒弃上清液。加入100μL冰浴的碱性裂解溶液Ⅰ剧烈震荡EP管重悬浮沉淀，再加入200μL碱性裂解溶液Ⅱ快速颠倒EP管数次，加入150μL冰浴的碱性裂解溶液Ⅲ快速颠倒EP管数次，冰浴5min。4℃，13000r/min，离心5min，上层水相转移到新的EP管中。加入2体积无水乙醇，颠倒混匀，室温下放置2min。4℃，13000r/min，离心5min，弃上清液。加入1mL 70％乙醇，快速颠倒EP管数次，4℃，13000r/min，离心2min，弃上清液。将带有DNA沉淀的EP管打开管盖，置于无菌操作台静立15min，至酒精全部挥发并没有液体残留。加入100μL带有20μg/mL RNaseA的TE(PH8.0)溶解沉淀。用100μL带有20μg/mL RNaseA的TE做为空白，测量DNA的浓度。将样品于-20℃的冰箱中冷冻保存。
试剂盒法提取质粒
采用QIAGEN公司质粒提取试剂盒，按照说明书进行操作。同样将样品于-20℃的冰箱中冷冻保存。
①PCR引物设计
根据Genebank中报道的PR1和α-factor基因编码序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计2对引物。分别在α-factor正向引物加入限制性内切酶酶切位点HindⅢ和反向引物5`端加入限制性内切酶酶切位点BamHⅠ。在PR1正向引物加入限制性内切酶酶切位点BamHⅠ和反向引物5`端加入His-tag和限制性内切酶酶切位点EcoRⅠ。以下引物均由IDT公司合成。带下划线的基因序列为限制性酶切位点碱基序列。
α-factor正向引物：
5`-GCAAGCTTATGAGATTTCCTTCAATT-3`
α-factor反向引物：
5`CGCGGATCCAGATACCCCTTCTTCTT-3`
PR1正向引物：
5`-CTCGGATCCGCACCAAGTAGTTCAT-3`
PR1反向引物：
5`-CGGAATTCTTACATGGTGATGGTGATGATGCTCGAGATAGGGT-3`
②PCR技术扩增目的片段
目的片段的扩增
分别以pPIC9质粒DNA和pET28a质粒DNA做为α-factor和PR1的模板，用TaqDNA聚合酶进行PCR反应。25μL反应体系如下：
表6：PCR反应体系
Figure BDA0002685358950000121
PCR反应程序：
Figure BDA0002685358950000122
55℃退火1min
72℃延伸45s
72℃最后延伸5min
③琼脂糖凝胶电泳
TAE电泳缓冲液(50×贮存液)：242gTris碱、37.2g Na2EDTA·2H2O、57.1mL冰乙酸，加蒸馏水定容至1000ml。
将电泳级琼脂糖加入1×TAE缓冲液中液配制成1％的琼脂糖凝胶。微波加热3min，至所有琼脂糖颗粒完全融化，冷却至室温后，倒入已插入梳子的胶板槽中，自然冷却凝固。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。确定目的条带，用QIAGEN公司胶回收试剂盒回收目的条带。回收产物于-20℃冰箱中冷冻保存。
3.5、重组质粒pYES2/α-factor的构建
将目的片段α-factor和质粒pYES2用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切2h。酶切体系为：
表7：双酶切体系
总计 20μL
目的片段 11μL
pYES2 1μL
反应缓冲液 2μL
BamH I 1.5μL
HindⅢ/EcoRⅠ 1.5μL
灭菌蒸馏水 Up to 20μL
反应条件，37℃双酶切2h。取酶切产物8μL，加2μL连接反应缓冲液和0.75μL T4DNA连接酶，连接3h。
3.6、热激法将重组质粒转化到大肠杆菌
将重组质粒pYES2/α-factor加入已分装好的200μLCaCl2感受态细胞中，混匀冰浴30min，每5min震荡混匀。将重组质粒DNA和感受态细胞液置于42℃水浴锅，热激45s，随后冰浴2min，加入800μL无抗生素LB液体培养基，37℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养1h。复苏后，4000r/min，离心3min，吸弃上清液800μL，剩余200μL菌液重悬浮。
3.7、阳性菌落的选取
在无菌操作条件下分别取50μL、100μL带有重组质粒pYES2/α-factor的E.coliDH5α感受态细胞菌液用涂布法涂在带有浓度为100μg/mL氨苄霉素的LB平板培养基上。37℃恒温培养箱中倒置培养16h。挑取阳性菌落，提取质粒，用HindⅢ和BamH I双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.8、pYES2/PR1/α-factor的构建
将PR1的PCR回收产物和重组质粒pYES2/α-factor用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切2h。酶切体系同表7。37℃双酶切2h后。取酶切产物8μL，加2μL连接反应缓冲液和0.75μL T4 DNA连接酶，连接3h。连接产物用热激法转化到E.coliDH5α感受态细胞中，选取阳性菌落，提取质粒，BamH I和EcoRI双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定，送样测序。
3.9、酿酒酵母表达菌感受态细胞的制备
从已培养好的酿酒酵母表达INVScI中挑取单菌落培养于YPD液体培养基中，30℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养16h。吸取菌液2mL，13000r/min，离心1min，用20mL新鲜的YPD重悬浮细胞沉淀30℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养3h。13000r/min，离心10min。加入1mL 1×TE溶液重悬浮细胞，13000r/min，离心15s。加入0.5mL 1×LiAc/0.5×TE溶液重悬浮细胞，13000r/min，离心15s。加入0.5mL 1×LiAc/0.5×TE溶液重悬浮细胞，即为酿酒酵母表达菌感受态细胞。
3.10、重组质粒pYES2/PR1/α-factor的酵母菌转化
转化体系为：pYES2/PR1/α-factor质粒DNA 1μL、Carrier DNA 5μL、酿酒酵母表达感受态细胞50μL于EP管中。再分别加入350μL 1×LiAc/40％PEG/1×TE，30℃、恒温震荡培养箱中培养30min。加入二甲亚砜(DMSO)44μL。42℃热激7min，13000r/min，离心15s，弃上清。用200μL 1×TE重悬浮细胞。吸取细胞液涂布在酿酒酵母表达生长培养基中，30℃、恒温震荡培养箱中培养2d，利用尿嘧啶缺陷培养基筛选阳性菌落。
3.11、重组质粒pYES2/PR1/α-factor在酿酒酵母表达中的诱导表达
将酿酒酵母表达阳性克隆接种到液体生长培养基中，30℃、200r/min恒温震荡培养箱中培养16h。培养物于4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液。加入无菌蒸馏水重悬浮沉淀，洗去培养基中残留的葡萄糖，4℃，12000r/min，离心15s。加入50mL含有半乳糖的诱导培养基重悬浮细胞沉淀，30℃、200r/min恒温震荡培养箱中振荡培养，诱导8h后收集菌液，4℃，12000r/min，离心10min，将上清液移至新的EP管中，4℃冰箱中冷藏保存。
3.12、SDS-PAGE凝胶电泳
溶液的配制
分离胶(12％)：30％丙烯酰胺4.0mL，2.5M Tris-HCl(PH8.8)1.3mL，H2O 3.3mL，10％SDS100μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL。
浓缩胶：30％丙烯酰胺0.83mL，1.0M Tris-HCl(PH6.8)0.63mL，H2O 3.4mL，10％SDS50μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL。
5×电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，蒸馏水定容至1000mL。
镍磁珠纯化样品
按Millipore的PureProteomeTM镍磁珠实验操作指导，进行磁珠的准备、吸附、洗脱和纯化。将200μL镍磁珠悬浮于1.5mL的EP管中。将EP管放到磁性支架以收集镍磁珠，吸弃存储缓冲液。加入500μL裂解平衡缓冲液重悬镍磁珠，室温下轻柔振荡孵育1min，吸弃缓冲液。加入1mL带有重组质粒pYES2/PR1/α-factor的酿酒酵母表达上清液到镍磁珠中，室温孵育30min。将EP管置于磁性支架，让镍磁珠迁移到磁体，吸弃裂解液。加入500μL的洗涤缓冲液在室温下洗涤磁珠1min。将管放回磁性支架，再次让镍磁珠迁移到磁体，去除洗涤缓冲液。洗涤3次后。加入100μL的洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，室温下洗脱2min。将管放回磁性支架，让珠粒迁移到磁体。用移液枪将洗脱液转移到一个干净的EP管中。最后加入等体积1×Loading Buffer，100℃水浴5min。
上样与电泳
按比例配制分离胶，并灌制于玻璃板间，加入一层乙醇压平胶面，约30min后，分离胶凝固，弃乙醇。灌制浓缩胶，并插入样品梳，约30min后，浓缩胶凝固。装好电泳系统，加入1×电泳缓冲液。上样10μL。恒压90V，3h。
Western-Blot蛋白质印迹法
溶液的配制
转移缓冲液：准确称取25mM Tris 3.025g、190mM甘氨酸14.25g和20％甲醇200mL，蒸馏水定容至1000mL。
漂洗液TBST：吸取10×TBS，双蒸水定容至1000mL，加入1mL Tween-20。
封闭液5％(脱脂牛奶)：准确称量10g脱脂奶粉，加入200mL的TBST溶解。
操作步骤
将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳和硝酸纤维膜浸泡在转移缓冲液中15min。拿出后，将硝酸纤维膜放置在凝胶上方，硝酸纤维膜上部和凝胶下方分别加3张3mm滤纸(应预先浸泡在转移缓冲液中)，保持滤纸、凝胶和硝酸纤维膜湿润且没有气泡。将上述装置放置在Bio-Rad标准湿式转膜装置中，设定转膜电流48mA，电压小于15V，转膜时间90min。
转膜完毕后，立即将转有蛋白的硝酸纤维膜放在封闭液中，室温振荡封闭15min。倒弃封闭液，加入一级抗体4℃摇床振荡孵育过夜，回收一抗。用TBST漂洗液漂洗5次，每次5min。加入二级抗体室温摇床振荡孵育3h，回收二抗。用TBST漂洗液漂洗5次，每次5min。最后加入TBS漂洗5min。加入显色试剂，显色15min。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (6)

1.一种断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，以酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液作为抑制剂，添加到所述断奶仔猪饲料中，抑制所述黄曲霉毒素的生成。
2.根据权利要求1所述断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度大于等于900μL。
3.根据权利要求1所述断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度大于等于1500μL。
4.根据权利要求1所述断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液的浓度为1500μL。
5.根据权利要求1-3任意一种所述断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，所述酿酒酵母表达的重组质粒pYES2/PR1/α-factor蛋白菌液是将PR1蛋白的PCR回收产物和重组质粒pYES2/α-factor用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，进行重组质粒pYES2/PR1/α-factor的酵母菌转化，并在酿酒酵母表达中诱导表达获得。
6.根据权利要求5所述断奶仔猪饲料中黄曲霉毒素的抑制方法，其特征在于，所述重组质粒pYES2/α-factor是将α-factor片段和质粒pYES2用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切获得。
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