CN112007040A - 用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物 - Google Patents

用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种联合用药物，所述联合用药物包含药物A和药物B，其中，所述药物A为一种或多种如式(1)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为对由HBV引起的病理状况或疾病具有治疗和/或预防作用的核苷类似物中的一种或多种。本公开提供的联合用药物对HBV DNA的抑制率显著高于同等剂量下的单用药物，并且能够显著抑制表面抗原的表达。

Description

用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物
技术领域
本公开涉及一种用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物，属于医药化学领域。
背景技术
乙型病毒性肝炎(又称乙型肝炎或乙肝)是严重威胁全球、特别是中国的一类传染病，核苷类似物是目前全球公认的疗效较好的抗乙肝病毒药物之一。目前，数种核苷类药物已被用于乙肝治疗，如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、富马酸替诺福韦二吡呋酯(替诺福韦酯)和替诺福韦艾拉酚胺(替诺福韦)等。其作用机制为药物进入细胞内经磷酸化成为活化形式，具有抑制病毒DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用，通过与底物核苷酸竞争参入病毒的DNA链，终止DNA链的延长和合成，从而达到抑制病毒增殖的目的。但是，核苷类似物对表面抗原没有抑制作用，因而无法实现乙肝的功能性治愈。
治愈乙肝的指标为：持久的HBsAg消失(伴有或不伴有血清抗HBs阳性)，血清HBVDNA阴性，cccDNA处于非活动转录状态，停止治疗后疾病没有复发。其关键在于有效地调节人体自身免疫功能，抑制病毒复制、杀灭病毒、恢复肝功能，减少肝脏炎症，促进肝细胞的恢复与再生，减少和防止肝纤维化。因此，抑制或减少HBsAg的表达,是治愈乙肝的前提。
发明内容
在一些实施方式中，本公开提供了一种联合用药物，包含药物A和药物B，其中，所述药物A为一种或多种如式(1)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为对由HBV引起的病理状况或疾病具有治疗和/或预防作用的核苷类似物中的一种或多种：
Figure BDA0002080976530000021
其中，
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为选自2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基以及C1-C10烷氧基；
R3为式A59所示结构的基团：
Figure BDA0002080976530000022
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为抑制HBV基因表达的寡核苷酸；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
Figure BDA0002080976530000031
表示基团共价连接的位点；
M1表示药学上可接受的靶向基团。
在一些实施方式中，本公开提供了一种联合用药物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.0004-200):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的方法，所述方法包括将有效量的本公开的联合用药物给予患有病毒性乙型肝炎的受试者。
在一些实施方式中，本公开提供了一种联合用药物在制备用于治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制肝细胞中HBV基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的联合用药物与感染HBV的肝细胞接触。
在一些实施方式中，本公开提供了一种商品化包装，所述商品化包装含有本公开的联合用药物以及说明其治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的使用说明书。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物在HBV转基因小鼠模型中显示出优异的靶基因抑制活性。在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物与核苷类似物相比，在相同治疗时间内，联合用药物对HBV DNA的抑制效率是单独施用核苷类似物的21.5倍。在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物能够显著抑制表面抗原的表达，其中，当小核酸药物皮下给药一次，且核苷类似物连续日服14天时，对HBsAg的最大抑制率达99.9％；而单独连续施用核苷类似物14天，对HBsAg的表达并无任何抑制作用。
可以看出，本公开提供的联合用药物，在传统的核苷类似物(药物B)每日口服剂量的基础上，只需联合施予少量本公开提供的小核酸药物(药物A)；其结果，所述联合用药物对HBV DNA的抑制率显著高于单独施用药物A或B。本公开提供的联合用药物中，小核酸药物与核苷类似物联合使用，操作简单，达到了对HBV DNA抑制的协同增效作用。可以推断，在相同的HBV DNA抑制率下，联合用药物的使用剂量，明显低于两种药物单独施用的有效剂量。对于不能耐受单药副作用的患者而言，使用本公开提供的联合用药物，将是一种有效的用药选择。另一方面，本公开的联合用药物还能大大降低表面抗原的表达，显示出对于乙肝功能性治愈的优异潜力。
简言之，本公开提供的联合用药物能够显著抑制HBV基因的表达，有效治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病，还显示出对乙肝功能性治愈的可能，具有良好的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
所附的权利要求中详细的阐述了本发明的新颖特征。本发明的特点和优点将通过以下详细描述以及附图得到更好的理解，其中所述详细描述对利用了本发明原理的说明性实施方式进行了阐述，所述附图为：
图1显示联合用药物1在1.28copy模型小鼠中对HBV DNA的抑制效率的时间相关性测试。
图2显示联合用药物1在1.28copy模型小鼠中对血清HBsAg表达量的抑制效率的时间相关性测试。
图3显示联合用药物2在1.28copy模型小鼠中对HBV DNA的抑制效率的时间相关性测试。
图4显示联合用药物2在1.28copy模型小鼠中对血清HBsAg表达量的抑制效率的时间相关性测试。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，而非旨在在任何方面限制本公开。
在本公开中，HBV基因是指DNA序列如Genbank注册号NC_003977.1所示的基因。进一步地，若无其它说明，本公开中所使用的术语“靶基因”是指上述HBV基因，术语“靶mRNA”是指上述HBV基因所转录的mRNA。
定义
除非另有说明，本文所使用的下列术语和短语具有下面的含义：
本公开所使用的术语“联合用药物”，包含不同单位制剂中的用于同时、独立或相继施用的药物A和药物B，药物A和药物B均为治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的化合物或组合物，其中，药物A为一种或多种如式(1)所示的化合物或其药理活性衍生物，药物B为核苷类似物中的一种或多种。
本文中，“小核酸药物”或“药物A”可互相替代使用，表示一种或多种如式(1)所示的寡核苷酸缀合物，其中，所述寡核苷酸指siRNA或反义核酸(antisense，ASO)。“核苷类似物”或“药物B”可互相替代使用，表示一种或多种结构类似核苷(酸)的抑制乙肝病毒复制的药物，包括但不限于拉米夫定(lamivudine，简称LAM，或3TC)、替比夫定(telbivudine，简称LdT)、克来夫定(clevudine，简称L-FMAU)、恩曲他滨(emtricitabine，简称FTC)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，简称ADV)、恩替卡韦(enticavir，简称ETV)、替诺福韦酯(富马酸替诺福韦二吡呋酯，tenofovir disoproxil fumarate，简称TDF)、替诺福韦(替诺福韦艾拉酚胺，tenofovir alafenamide，简称TAF)、泛昔洛韦(famciclovir)或其药理活性衍生物。所述“单药”，是指单独施用药物A或药物B。
术语“药理活性衍生物”是指与药物A或药物B近似或更好药效的药物活性化合物，包括下述任意一种化合物：药用盐、水合物、溶剂化物(solvates/cosolvents)、立体异构体(包括对映异构体、非对映异构体或立体异构富集或外消旋混合物)、以及经患者服用后能够提供(直接或间接)上述化合物或其抗病毒活性代谢物或残余物的任意一种其它化合物。其中，所述药用盐，应该是由药学上可接受的酸或碱衍生得到的，包括但不限于碱金属盐、碱土金属盐、有机羧酸盐、有机磺酸盐、无机酸盐等。具体的，药用盐包括但不限于钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、NX4 -盐(其中，X是C1-C4烷基)、富马酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苹果酸盐、草酸盐、乳二酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、羟乙基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、氨基磺酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。
术语“协同”和“协同作用”是指同时使用药物A和药物B所获得的效果高于单独使用药物A或药物B所获得的效果总和，也就是高于根据单独使用这两种药物所能预期的效果。
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述药物A的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA或反义核酸中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNAphosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的核酸合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。在下文中，有时也将本公开的寡核苷酸缀合物简称为“缀合物”，亦即本公开所提供的联合用药物中的药物A。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至寡核苷酸，最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)用于指示取代基的连接点。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香组碳环，通常具有3至7个环碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤素”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greene and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将本公开的联合用药物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
联合用药物
在一方面，本公开提供了一种联合用药物，包含药物A和药物B，其中，所述药物A为一种或多种如式(1)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为对由HBV引起的病理状况或疾病具有治疗和或预防作用的核苷类似物中的一种或多种：
Figure BDA0002080976530000131
其中，
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为选自2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基以及C1-C10烷氧基；
R3为式A59所示结构的基团：
Figure BDA0002080976530000132
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为抑制HBV基因表达的寡核苷酸；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
Figure BDA0002080976530000141
表示基团共价连接的位点；
M1表示药学上可接受的靶向基团。
如前所述，本公开的联合用药物中包含了式(1)所示的小核酸药物(药物A)和核苷类似物(药物B)，以下分别对其进行说明。
药物A
本公开提供的联合用药物中，药物A是小核酸药物，作用在于：提供一种能够高效稳定靶向HBV基因并抑制HBV基因表达的小核酸药物，并通过与药物B联合使用，获得期望的治疗和/或预防效果。因此，在一些实施方式中，本公开的联合用药物中，药物A具有式(1)所示的结构。
在一些实施方式中，L1可选自于由A1-A26基团或其任意组合所组成的组，其中A1-A26的结构和定义如下所示：
Figure BDA0002080976530000151
Figure BDA0002080976530000161
其中，每个j1独立地为1-20的整数；每个j2独立地为1-20的整数；
每个R'独立地为C1-C10烷基；
每个Ra选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0002080976530000162
Figure BDA0002080976530000171
Rb为C1-C10烷基；
Figure BDA0002080976530000172
表示基团共价连接的位点。
技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L1的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
M1表示药学上可接受的靶向基团，可以是小核酸给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的寡核苷酸递送至靶细胞。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的任意一种配体。在一些实施方式中，每个配体独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，所述配体为糖或糖的衍生物。
在一些实施方式中，至少一个配体是糖。在一些实施方式中，每个配体均是糖。在一些实施方式中，至少一个配体是单糖、多糖、修饰的单糖、修饰的多糖或糖衍生物。在一些实施方式中，至少一个所述配体可以是单糖，双糖或三糖。在一些实施方式中，至少有一个配体是修饰的糖。在一些实施方式中，每一个配体均为修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体均独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖、修饰的单糖、多糖衍生物或单糖衍生物。在一些实施方式中，每一个或至少一个配体选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物，阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。
在一些实施方式中，每个所述配体可独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。所述配体的其它选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
当M1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保证所述缀合物中M1靶向基团的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M1靶向基团的个数至少为3，从而使得M1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1靶向基团的个数大于3个时，M1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，m1、m2和m3独立地选自2-10的整数时，可以使多个M1靶向基团之间的空间位置适合M1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基、以及C1-C10烷氧基中的一种时，不会改变本公开的缀合物的性质。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15均为H。
R3为式A59所示结构的基团，其中，E1为OH、SH或BH2，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E1为OH或SH。
R2的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R10、R11、R12、R13、R14和R15的碳原子与N原子互相连接的链状结构。因此，R2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备式(1)所示化合物的情况下，R2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R3中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方式中，R2中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R3上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键；在一些实施方式中，R2可以是B5、B6、B5'或B6'：
Figure BDA0002080976530000201
其中，
Figure BDA0002080976530000202
表示基团共价键连接的位点。
q2的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q2为1-5的整数。
L1的作用是将M1靶向基团与含氮骨架上的N连接，为式(1)所示化合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L1的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中，L1的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R'为C1-C4烷基，在一些实施方式中，R'为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R'、Ra、Rb进行选择，以实现M1靶向基团与含氮骨架上的N原子连接，并使M1靶向基团之间的空间位置更适合M1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一些实施方式中，药物A具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
Figure BDA0002080976530000211
Figure BDA0002080976530000221
Figure BDA0002080976530000231
Figure BDA0002080976530000241
Figure BDA0002080976530000251
Figure BDA0002080976530000261
Figure BDA0002080976530000271
Figure BDA0002080976530000281
在一些实施方式中，本公开药物A中抑制HBV表达的寡核苷酸是siRNA或反义核酸。本领域技术人员可以理解，这里的siRNA应做广义的理解，是指利用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)原理，通过与靶序列特异性结合，在转录后水平抑制基因表达的各种形式的RNAi剂，即除了WO2002044321A所述的经典的siRNA双链结构外，还包括含有缺刻的siRNA，或含有茎环结构的dsRNA，或单链ssRNAi等。对于单链ssRNAi与缀合分子的连接方式可以按照反义核酸与缀合分子的连接方式来理解，同样地，缀合单链ssRNAi的药物A的制备方法可以按照缀合反义核酸的药物A的制备路径进行。
式A59中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸序列中任意的核苷酸上。当本公开药物A中的寡核苷酸是反义核酸时，在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的末端区域，所述反义核酸的末端区域指所述反义核酸中从其一端起算的前4个核苷酸；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的任意末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的3'末端。
当本公开药物A中的寡核苷酸是siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链时，在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述siRNA中正义链或反义链的末端区域，所述末端区域指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的任意末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述正义链的3'末端。在式A59中的P原子连接至siRNA正义链3'末端的情况下，药物A进入细胞后，在siRNA解旋时，可以释放出单独的反义链，以降解靶mRNA，抑制HBV基因的表达。
在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，A59中的P原子也可以看作是siRNA中含有的磷酸基团中的P原子)，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链中核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。通常siRNA的长度为15-40个核苷酸，在一些实施方式中，siRNA长度约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立是修饰或未修饰的核苷酸。为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中药物A中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2。所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链互补区，所述核苷酸序列2与核苷酸序列A至少部分互补，所述核苷酸序列A为靶HBV mRNA中的一段核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列1，所述反义链仅包含核苷酸序列2。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％HBV基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA指在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述核苷酸序列A长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列A'长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列A'为与所述核苷酸序列A完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述核苷酸序列A不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列A'不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列A'之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列A'之间的核苷酸差异为按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与核苷酸序列B互补，所述核苷酸序列B是指靶HBV mRNA中与所述核苷酸序列A相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。在一些实施方式中，核苷酸序列3和核苷酸序列4完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列3的碱基组成，核苷酸序列4的碱基组成根据沃森-克里克的配对原则也就确定了。这样，在一些实施方式中，所述siRNA长度为19-23个核苷酸对。
在一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端(overhang)；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、或连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与核苷酸序列C互补，所述核苷酸序列C是指靶HBV mRNA中与所述核苷酸序列A相邻、或者与所述核苷酸序列B相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有显著的HBV mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列：
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG-3'(SEQ ID NO:2)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Z'AGAAGAUGAGGCAUAGCA-3'(SEQ ID NO:4)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-UCUGUGCCUUCUCAUCUGZ-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Z'CAGAUGAGAAGGCACAGA-3'(SEQ ID NO:6)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-CGUGUGCACUUCGCUUCAZ-3'(SEQ ID NO:7)；
5'-Z'UGAAGCGAAGUGCACACG-3'(SEQ ID NO:8)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：
5'-GAAAGUAUGUCAACGAAUZ-3'(SEQ ID NO:9)；
5'-Z'AUUCGUUGACAUACUUUC-3'(SEQ ID NO:10)；
其中，所述Z'是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z选自A、U、G或C，并且Z'是与Z互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA为表1中任意一种siRNA。
表1
Figure BDA0002080976530000321
Figure BDA0002080976530000331
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸为未经修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制HBV基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方式中，本公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,andM.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。
在一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
本公开的发明人惊奇地发现，本公开所述的siRNA在动物实验中获得了血浆中稳定性和基因沉默效率的高度平衡。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。相应地，“非氟基团”可以是例如烷氧基、经取代的烷氧基、烷基、经取代的烷基、氨基、经取代的氨基等。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(208)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(209)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(210)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(211)所示：
Figure BDA0002080976530000351
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleicacid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示：
Figure BDA0002080976530000352
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示：
Figure BDA0002080976530000353
上述式(215)和式(216)中，R包括但不限于H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的核苷酸。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示：
Figure BDA0002080976530000361
上述式(217)和式(218)中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R为H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(207)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成的具有如式(208)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：
按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为-氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA为表2中任意一种siRNA。
表2
Figure BDA0002080976530000371
Figure BDA0002080976530000381
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
Figure BDA0002080976530000391
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，所述siRNA为表3中任意一种siRNA。
表3
Figure BDA0002080976530000392
Figure BDA0002080976530000401
Figure BDA0002080976530000411
在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：
Figure BDA0002080976530000412
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolutionof oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
Figure BDA0002080976530000413
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(202)所示的含有5'-磷酸的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(203)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(205)所示。
在一些实施方式中，所述siRNA为表4、表5中任意一种siRNA。
表4
Figure BDA0002080976530000421
Figure BDA0002080976530000431
表5
Figure BDA0002080976530000432
Figure BDA0002080976530000441
本公开的发明人意外发现，本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还保留很高的基因抑制活性。
本公开所述缀合物的siRNA序列中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4 +，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一种实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述药物A可以至少部分以盐的形式存在。在一种实施方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述药物A以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物A还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物A可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物A用于皮下注射给药。
药物A的制备
可以采用任意合理的合成路线制备药物A。
在一些实施方式中，当式(1)中Nu代表的寡核苷酸为双链siRNA时，式(1)所示的化合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照siRNA正义链和反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；分离出siRNA的正义链和反义链，退火，其中，所述siRNA为上述本公开的siRNA；
并且，该方法还包括在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，使式(321)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。下文中，式(321)所示的化合物也称作缀合分子。
Figure BDA0002080976530000461
其中：
R4为能够结合至式(1)所示的化合物中Nu代表的siRNA的基团。在一些实施方式中，R4为能够通过共价键结合至Nu代表的siRNA的基团。在一些实施方式中，R4为能够经反应而通过磷酸二酯键缀合至Nu代表的siRNA的任意官能团的基团；
每个S1独立地是M1中全部活性羟基被YCOO-基团取代而形成的基团，其中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；在一些实施方式中，Y为甲基。
n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、M1各自的定义和可选择的范围如前所述。
R4的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子的连接，并且为合成式(1)所示的化合物提供合适的反应位点。在一些实施方式中，R4中包括R2连接基团或经保护的R2连接基团，以及可通过反应与寡核苷酸形成A59所示结构的官能团。
在一些实施方式中，R4包含可与Nu代表的siRNA或核苷单体上的基团形成亚磷酸酯的第1官能团以及可与羟基或氨基反应形成共价键的第2官能团或者含有由所述共价键连接的固相载体。在一些实施方式中，所述第1官能团为亚磷酰胺、羟基或被保护的羟基。在一些实施方式中，所述第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐。在一些实施方式中，所述第2官能团为经由共价键连接至分子其他部分的固相载体，所述共价键由羟基或氨基形成。在一些实施方式中，所述固相载体经由磷酸酯键、羧酸酯键或酰胺键连接。在一些实施方式中，所述固相载体为树脂。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有羟基、-ORk或式(C3)所示的基团；所述第2官能团含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1')或(C3')所示的结构：
Figure BDA0002080976530000471
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0002080976530000472
表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有亚磷酰胺基团，如式(C3)所示，该亚磷酰胺基团可以与核苷酸上的任意位置的羟基，如2'位羟基或3'位羟基发生偶联反应形成亚磷酸酯，并经氧化或硫化形成式A59所示的磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，将缀合分子缀合至siRNA。此时，即使所述第2官能团并不存在，式(321)化合物也能够缀合至核苷酸，不影响式(1)所示的化合物的获得。在此情况下，在经由亚磷酰胺固相合成等方法获得siRNA的正义链或反义链后，使式(321)化合物与核苷酸序列中末端核苷酸上的羟基反应，并在后续的氧化或硫化过程中形成磷酸二酯键连接或硫代磷酸酯连接，将式(321)化合物缀合至siRNA。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有被保护的羟基。在一些实施方式中，所述第2官能团包含可与固相载体反应的基团，所述反应提供包含固相载体的缀合分子。在一些实施方式中，所述第2官能团含有羧基、羧酸盐或亚磷酰胺，如式(C1)、(C2)或(C3)所示，当所述第2官能团包含羧基或羧酸盐时，式(321)化合物与固相载体，例如树脂上的羟基或氨基进行酯化反应或酰胺化反应，形成经羧酸酯键连接的包含固相载体的缀合分子。当所述第2官能团包含亚磷酰胺官能团时，式(321)化合物与通用固相载体，例如树脂上的羟基发生偶联反应，并经氧化形成经磷酸二酯键连接的包含固相载体的缀合分子。随后，以上述连接固相载体后的产物作为起始，按照亚磷酰胺固相合成方法依次连接核苷单体，获得连接有缀合基团的siRNA的正义链或反义链。在亚磷酰胺固相合成过程中，所述第1官能团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与核苷单体上的亚磷酰胺基团发生偶联。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有羟基或被保护的羟基；所述第2官能团含有经羧酸酯键连接的固相载体或经酰胺键连接的固相载体、或者经磷酸酯键连接的固相载体，如式(C1')或(C3')所示。此时，由式(321)化合物代替固相载体作为起始，按照亚磷酰胺固相合成方法依次连接核苷单体，获得连接有缀合基团的siRNA的正义链或反义链。
在一些实施方式中，羧酸盐可以表示为-COO-M+，其中，M+是阳离子，例如选自金属阳离子，铵阳离子NH4 +，有机铵阳离子中的一种。在一种实施方式中，所述金属离子选自碱金属离子中的一种，如K+或Na+。出于提高溶解性、使反应顺利进行的考虑，在一些实施方式中，有机铵离子为三级胺形成的铵阳离子或季铵阳离子，如，三乙胺形成的铵离子或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。在一些实施方式中，羧酸盐是三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。
在一些实施方式中，R4含有式(B9)、(B10)、(B9')、(B10')、(B11)、(B12)、(B11')或(B12')所示的结构：
Figure BDA0002080976530000491
其中，q1为1-4的整数，q2为1-10的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0002080976530000492
表示基团共价连接的位点。在一些实施方式中，q1为1或2。在一些实施方式中，q2为1-5的整数。在一些实施方式中，R4含有式(B9)或(B10)所示的结构。在一些实施方式中，R4含有式(B11)或(B12)所示的结构。
在一些实施方式中，Rk是Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-双甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4',4'-三甲氧基三苯甲基)中的一种或多种。在一些实施方式中，Rk可以是DMTr，即4,4'-双甲氧基三苯甲基(4,4'-dimethoxytrityl)。
L1的定义如前所述。
在一些实施方式中，L1被用于将M1靶向基团连接至含氮骨架上的N原子，从而为式(1)所示的化合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L1包含A1-A26中的任一个或其组合。
根据上述描述，本领域技术人员容易理解的是，相较于本领域公知的亚磷酰胺固相合成方法而言，可通过上述第1官能团以及任选的第2官能团，获得将缀合分子连接至核苷酸序列的任意可能的位置的式(1)所示的化合物，例如，缀合分子连接至核苷酸序列的端部，缀合分子连接至核苷酸序列的末端。相应地，除非另有说明，以下涉及缀合物和/或缀合分子的制备的描述中，当提及“脱保护”、“偶联”、“盖帽”、“氧化”、“硫化”等反应时，应当理解为本领域公知的亚磷酰胺核酸固相合成方法中所涉及的反应条件和试剂也同样适用于这些反应。示例性的反应条件和试剂将在后文详细描述。
在一些实施方式中，每个S1独立地是M1。在一些实施方式中，每个S1独立地是M1中至少一个活性羟基被羟基保护基团保护而形成的基团。在一些实施方式中，每个S1独立地是M1中任何存在的活性羟基全部被羟基保护基团保护而形成的基团。在一些实施方式中，任何本领域技术人员已知的羟基保护基团均可被用于保护M1中的活性羟基。在一些实施方式中，被保护的羟基可以式YCOO-表示，其中，每个Y独立地选自于由C1-C10烷基和C6-C10芳基所组成的组，所述C1-C10烷基和C6-C10芳基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自于由卤素和C1-C6烷基所组成的组。在一些实施方式中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、单氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤苯基，以及C1-C6烷基苯基。
在一些实施方式中，每个S1各自独立地选自于由式A46-A54所组成的组：
Figure BDA0002080976530000511
在一些实施方式中，S1为式A49或A50。
在一些实施方式中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；在一些实施方式中，Y为甲基。
如前所述，式(1)所示的化合物的制备方法还包括以下步骤：合成siRNA的另一链(例如，当上述步骤合成了连接有缀合分子的siRNA正义链时，还包括按照固相合成方法合成siRNA的反义链，反之亦然)，分离正义链和反义链，以及退火。具体地，在分离步骤中，连接至核苷酸序列和/或缀合分子的固相载体被切割下来，同时必要的保护基团被脱除(此时，式(321)化合物中的各S1基团转化为对应的M1靶向基团)，获得连接有缀合分子的siRNA正义链(或反义链)以及对应的反义链(或正义链)，正义链与反义链退火形成双链RNA结构，获得式(1)所示的化合物。
在一些实施方式中，式(1)所示的化合物的制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与正义链或反义链的3'端的第一个核苷单体接触，使式(321)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，在亚磷酰胺固相合成的条件下，按照期望的正义链或反义链核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成siRNA的正义链或反义链；其中，式(321)化合物为R4中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有被保护的羟基，第2官能团具有如式(C1')或(C3')所示结构的化合物，与第一个核苷单体连接前，式(321)化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合基团的核酸的正义链或反义链；在亚磷酰胺固相合成的条件下，按照反义链或正义链核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成核酸的反义链或正义链；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，式(1)所示的siRNA缀合物的制备方法包含以下步骤：按照该双链siRNA中正义链或反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，将式(321)化合物连接至正义链或反义链，其中，式(321)化合物是R4中含有第1官能团，第1官能团为亚磷酰胺基团的式(321)化合物；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得siRNA的正义链或反义链，退火，其中，所述siRNA的正义链或反义链上连接有缀合基团。
在一些实施方式中，式A59中的P原子连接至siRNA中的正义链的3'末端，式(1)所示的化合物的制备方法包括：
(1)脱除上述式(321)化合物(其中，式(321)化合物为R4中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有被保护的羟基ORk，第2官能团具有如式(C1')或(C3')所示结构的化合物)中的羟基保护基团Rk；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将脱保护得到的产物与核苷单体接触，得到通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得式(1)所示的化合物。
其中，在步骤(1)中，脱除式(321)化合物中的保护基团Rk的方法包括在脱保护条件下，将式(321)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与式(321)化合物的摩尔比为10:1-1000:1，在一些实施方式中为50:1-500:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何适合于上述偶联反应的条件和试剂。在一些实施方式中，可使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃。式(321)化合物与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:2-1:5；式(321)化合物和偶联试剂的摩尔比可以为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:3-1:10，反应时间为200-3000秒，在一些实施方式中为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，在一些实施方式中为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一些实施方式中为无水乙腈。相对于式(321)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成第二种化合物的正义链S。此时，缀合基团连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂种类和用量采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
例如，在一些实施方式中，步骤(2)和(3)中所述固相合成可使用如下条件：
核苷单体脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的的摩尔比可以为2:1-100:1，在一些实施方式中为3:1-50:1。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比可以为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，在一些实施方式中为1:50-1:80，反应时间和偶联试剂的选择与前述相同。
盖帽反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为5-500秒，在一些实施方式中为10-100秒，盖帽试剂的选择与前述相同。盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:100-100:1，在一些实施方式中为1:10-10:1。在盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可为1:1:10-10:10:1，在一些实施方式中为1:1:2-2:2:1。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为1-100秒，在一些实施方式中为5-50秒，氧化试剂在一些实施方式中为碘(在一些实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可以为1:1-100:1，在一些实施方式中为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。硫化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为50-2000秒，在一些实施方式中为100-1000秒，硫化试剂在一些实施方式中为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为10:1-1000:1，在一些实施方式中为10:1-500:1。在一些实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。
在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，A46-A54基团的保护基团YCOO-转化为羟基，S1基团转化为相应的M1基团，生成式(1)所示的缀合物。其中，所述浓氨水可以是25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比可以为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将脱除了固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中的相应核苷酸具有游离的2'-羟基。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比可以为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。这样即可得到式(1)所示的化合物。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
这样得到的式(1)所示的化合物中，核苷酸之间的磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子基本与钠离子结合，式(1)所示的化合物基本以钠盐形式存在。可以采用熟知的离子交换方法，用氢离子和/或其他阳离子取代所述钠离子，得到其他形式的式(1)所示的化合物。所述阳离子如前所述。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，更好地把控合成质量，此类检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱(LC-MS)测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可简单地将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到式(1)所示的化合物。
在获得所述缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的式(1)所示的化合物进行表征，确定所合成的化合物为目标设计的式(1)所示的化合物，且所合成的siRNA的序列为期望的siRNA的序列，例如为表1-表5中所列的序列之一。
当式(1)中Nu代表的寡核苷酸为单链反义核酸或单链ssRNAi时，依照上述方法，无需合成另一链，也无需将另一链与连接有式(321)所示的缀合基团的单链退火，即可得到目标化合物。
式(321)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在酯化反应条件下，以及在碱和酯化催化剂存在下，将式(313)所示化合物与环状酸酐接触，离子交换，分离得到式(321)所示化合物：
Figure BDA0002080976530000561
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述；
R6为提供式(321)中R4的基团；在一些实施方式中，R6具有式(A61)所示的结构：
Figure BDA0002080976530000571
其中，Ri为能够实现与含氮骨架上的N原子连接、与RkO连接并且连接有一个游离羟基的任意基团，Rk为羟基保护基团。此时，所获得的是R4中含有作为羟基保护基团的第1官能团和第2官能团，所述第2官能团含有如式(C1)或(C2)所示结构的式(321)化合物。
所述酯化反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为8-48小时，在一些实施方式中，所述酯化反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为20-30小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂包含环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧类溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于所述式(313)所示化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述环状酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一种，在一些实施方式中为丁二酸酐。所述环状酸酐与所述式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一些实施方式中为2:1-5:1。
所述酯化催化剂可以是任何对该酯化反应起到催化作用的催化剂，例如该催化剂可以是4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一些实施方式中为2:1-5:1。
在一些实施方式中，所述碱可以是任意的无机碱，有机碱或者它们的结合。考虑溶解性和产物稳定性，所述碱可以是例如三级胺。在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一些实施方式中为3:1-10:1。
所述离子交换作用是将式(321)化合物转化为期望的羧酸或羧酸盐的形式，离子交换的方法为本领域技术人员所公知，可以使用合适的离子交换溶液和交换条件，得到具有M+阳离子的缀合分子，在此不做详述。在一些实施方式中，所述离子交换反应使用三乙胺磷酸盐溶液进行，所述三乙胺磷酸盐溶液的浓度为0.2-0.8M，在一些实施方式中，所述三乙胺磷酸盐溶液的浓度为0.4-0.6M，相对于式(313)化合物，所述三乙胺磷酸盐溶液的用量为3-6L/mol，在进一步的实施方式中为4-5L/mol。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(321)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(321)化合物，例如，可使用如下两种色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱；或者(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(321)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(321)化合物的制备方法还进一步包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，在缩合剂、缩合催化剂和三级胺类有机碱的存在下，将上述离子交换反应得到的产物进一步与含有氨基或羟基的固相载体进行接触。此时，所获得的是R4中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团含有如式(C1')所示结构的式(321)化合物。
所述固相载体为固相合成siRNA中所用的载体中的一种，其中的一些为本领域技术人员所公知。例如,所述固相载体可以选自含有活性羟基或氨基官能团的固相载体，在一些实施方式中，所述固相载体为氨基树脂或羟基树脂。在一些实施方式中，所述氨基或羟基树脂具有如下参数：粒径100-400目(mesh)，表面氨基或羟基载量为0.2-0.5mmol/g。所述式(321)所示化合物与固相载体的用量比为10-400μmol化合物/每克固相载体(μmol/g)。在一些实施方式中，所述式(321)所示化合物与固相载体的用量比为50-200μmol/g。
所述有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的溶剂或混合溶剂。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧类溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(321)化合物，所述有机溶剂的用量为20-200L/mol，在一些实施方式中为50-100L/mol。
在一些实施方式中，所述缩合剂可以是苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯/盐(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate，PyBop)、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one，DEPBT)和/或O-苯并三唑-四甲基脲六氟磷酸酯/盐(O-benzotriazol-1-yl-tetramethyluronium hexafluorophosphate)，在一些实施方式中，所述缩合剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯。所述缩合剂与式(321)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在其它实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺和/或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺；所述三级胺与式(321)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一些实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，式(321)化合物的制备方法还可以包括在盖帽反应条件下，在有机溶剂中，将得到的缩合产物与盖帽试剂和酰化催化剂接触，分离得到式(321)所示化合物。所述盖帽反应的作用在于除去任何尚未反应完全的活性反应官能团，以避免在后续反应中产生不必要的副产物。所述盖帽反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应的时间为1-10h，在一些实施方式中为3-6h。盖帽试剂可以使用siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂，siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂为本领域技术人员所公知。
在一些实施方式中，所述盖帽试剂由盖帽试剂1(cap1)和盖帽试剂2(cap2)组成，其中，盖帽试剂1为N-基甲基咪唑，在一些实施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶与乙腈的体积比为1:10-1:1，在一些实施方式中为1:3-1:1，吡啶与乙腈的总体积与N-甲基咪唑的体积比为1:1-10:1，在一些实施方式中为3:1-7:1。所述盖帽试剂2为乙酸酐。在一些实施方式中，所述盖帽试剂2以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的体积为1:1-1:10，在进一步的实施方式中为1:2-1:6。
在一些实施方式中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的体积与式(321)化合物的质量之比为5ml/g-50ml/g，在一些实施方式中为15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的体积与式(321)化合物的质量之比为0.5ml/g-10ml/g，在一些实施方式中为1ml/g-5ml/g。
在一些实施方式中，盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(321)化合物，所述有机溶剂的用量为10-50L/mol，在一些实施方式中为5-30L/mol。
在一些实施方式中，所述酰化催化剂可以选自任何可用于酯化缩合或酰胺化缩合的催化剂，例如碱性杂环化合物。在一些实施方式中，所述酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(321)所示化合物的质量之比为0.001:1-1:1，在一些实施方式中为0.01:1-0.1:1。
在一些实施方式中，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(321)化合物。在一些实施方式中，可通过以有机溶剂充分洗涤，并过滤，去除未反应的反应物、过量的盖帽试剂及其它杂质，得到式(321)化合物，所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷、甲醇，在一些实施方式中为乙腈。
在一些实施方式中，式(321)所示缀合分子的制备方法包括在有机溶剂中，在偶联反应条件下，以及在偶联试剂存在下，将式(313)所示化合物与亚磷酰二胺接触，分离得到式(321)所示化合物。此时，所获得的是R4中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团含有如式(C3)所示结构的式(321)化合物。
在一些实施方式中，偶联反应条件包括温度可以为0-50℃，例如为15-35℃，式(313)化合物与亚磷酰二胺的摩尔比可以为1:1-1:50，例如为1:5-1:15；式(313)化合物和偶联试剂的摩尔比可以为1:1-1:100，例如为1:50-1:80；反应时间可以为200-3000秒，例如为500-1500秒。所述亚磷酰二胺例如可使用双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，其可商购获得或按照本领域中公知的方法合成获得。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，例如为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，例如为无水乙腈。在一些实施方式中，相对于式(313)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。通过进行该偶联反应，式(313)化合物中的羟基与亚磷酰二胺反应形成亚磷酰胺基团。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(321)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(321)化合物的制备方法还进一步包括以下步骤：在偶联反应条件下，在有机溶剂中，以及在偶联试剂存在下，将分离得到的产物进一步与含有羟基的固相载体进行接触。随后，经盖帽反应、氧化反应，分离得到式(321)化合物。此时，所获得的是R4中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团具有如式(C3')所示结构的式(321)化合物。
在一些实施方式中，所述固相载体为本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体，例如，可以是经脱保护反应后的市售的通用固相载体(
Figure BDA0002080976530000611
HLUnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，结构如式B80所示)：
Figure BDA0002080976530000621
脱保护反应为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，脱保护条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃；反应时间为30-300秒，例如为50-150秒。脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中，脱保护试剂为二氯乙酸。脱保护试剂与固定相上的-DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保护基的摩尔比为2:1-100:1，例如为3:1-50:1。通过进行所述脱保护，在所述固相载体表面上获得具有反应活性的游离羟基，便于进行后续的偶联反应。
偶联反应条件以及偶联试剂的选择可如上所述。通过进行该偶联反应，脱保护反应中形成的游离羟基与亚磷酰胺基团反应形成亚磷酸酯连接。
在一些实施方式中，盖帽反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，反应时间为5-500秒，例如为10-100秒，所述盖帽反应在盖帽试剂存在下进行。盖帽试剂的选择和用量可如上所述。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，例如可以为15-35℃，反应时间为1-100秒，例如可以为5-50秒，氧化试剂例如可以为碘(在一些实施方式中，以碘水的形式提供)。在一些实施方式中，氧化试剂与连接至固相载体的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，例如可以为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。
在一些实施方式中，R6为式B7或B8基团中的一种，
Figure BDA0002080976530000622
Figure BDA0002080976530000631
其中q2的定义如前所述，
此时，式(313)所示化合物可以通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在酰胺化反应条件下，以及在酰胺化反应缩合剂和三级胺存在下，将式(314)所示化合物与式(A-1)所示化合物或式(A-2)化合物接触，随后进行分离：
Figure BDA0002080976530000632
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1、q2和Rk各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述酰胺化反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为1-48小时，在一些实施方式中，所述酰胺化反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为2-16小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为醇类溶剂、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述醇类溶剂在一些实施方式中为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种，在一些实施方式中为乙醇。所述环氧类溶剂在一些实施方式中为为二氧六环和/或四氢呋喃。所述醚类溶剂在一些实施方式中为为乙醚和/或甲基叔丁基醚。所述卤代烷类溶剂在一些实施方式中为为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(314)化合物，有机溶剂用量为3-50L/mol，在进一步的实施方式中为3-20L/mol。
在一些实施方式中，所述酰胺化反应缩合剂为苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐/酯、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐/酯，在进一步的实施方式中为3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮。所述酰胺化反应缩合剂与式(314)所示化合物的摩尔比可以为1:1-10:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在进一步的实施方式中为N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺与式(314)所示化合物的摩尔比为3:1-20:1，在一些实施方式中为5:1-10:1。
在一些实施方式中，式(A-1)和式(A-2)化合物可通过任何适当的方式制备。例如，当Rk为DMTr基团时，可通过甘油酸钙与DMTrCl反应制备式(A-1)化合物；类似地，可先将3-氨基-1,2-丙二醇与环状酸酐接触，随后再与DMTrCl反应制备式(A-2)化合物，所述环状酸酐可以是碳原子数为4-13、在一些实施方式中为4-8的环状酸酐。本领域技术人员容易理解的是，所述环状酸酐的选择对应于(A-2)化合物中q2的不同值，例如，当所述环状酸酐为丁二酸酐时，q2＝1，当所述环状酸酐为戊二酸酐时，q2＝2，以此类推。
在一些变型中，也可通过使式(314)所示化合物依次与所述环状酸酐、3-氨基-1,2-丙二醇和DMTrCl反应，制备式(313)化合物。本领域技术人员容易理解的是，这些变型不会影响式(313)化合物的结构与功能，并且这些变型是本领域技术人员在上述方法的基础上容易实现的。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(313)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(313)化合物，例如，可使用如下两种色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(313)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(314)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在酰胺化反应缩合剂和三级胺类有机碱存在下，在缩合反应条件下，将式(320)所示化合物与式(316)所示化合物接触，随后进行分离：
S1-L1-OH
式(316)
Figure BDA0002080976530000651
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15各自的定义和可选择的范围如前所述。
式(316)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(316)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照美国专利US 8,106,022 B2实施例1中所公开的方法制备某些式(316)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
在一些实施方式中，所述缩合反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为0.1-24小时，在一些实施方式中为反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-16小时。
考虑到期望产物式(314)化合物的结构，所述式(316)所示化合物与所述式(320)所示化合物的摩尔比应当基于与式(320)中n1与n3的和而确定。在一些实施方式中，例如，当n1+n3＝3时，为了保证反应完全而不过度，式(316)所示化合物与所述式(320)所示化合物的摩尔比可以为3:1-3.5:1，在一些实施方式中为3.01:1-3.15:1。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种，所述环氧类溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂在一些实施方式中为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂在一些实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(320)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述酰胺化反应缩合剂为苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐/酯、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐/酯、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐或1-羟基苯并三唑中的一种或多种，在进一步的实施方式中为苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐/酯和1-羟基苯并三唑的混合物，其中苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐/酯和1-羟基苯并三唑为等摩尔用量。所述总的酰胺化反应缩合剂与式(316)所示化合物的摩尔比可以为1:1-3:1，在一些实施方式中为1.05:1-1.5:1。
所述三级胺可以为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N-甲基吗啉；所述三级胺与式(316)所示化合物的摩尔比可以为2:1-10:1，在一些实施方式中为2:1-5:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(314)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(314)化合物例如，可使用如下两种色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(314)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
式(320)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。例如，当m1＝m2＝m3＝3，n1＝1，n3＝2，且每个R10、R11、R12、R13、R14、R15均为H时，式(320)化合物可自阿法埃莎公司商购获得。
药物B
本公开提供的联合用药物中，药物B是核苷类似物。作为HBV治疗领域的传统药物，多种核苷类似物已被证明具有抑制病毒复制等多种抗病毒作用，并能够有效降低血浆中的HBV DNA水平。从而，将其与上述靶向HBV基因表达的药物A联合使用，可期望获得有利的治疗和/或预防效果。因此，在一些实施方式中，本公开的联合用药物中，药物B是对由HBV引起的病理状况或疾病具有治疗和/或预防作用的核苷类似物中的一种或多种。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物B选自聚合酶抑制剂或逆转录酶抑制剂中的一种或多种。这些药物进入细胞内经磷酸化成为活化形式，具有抑制病毒DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用，通过与底物核苷酸竞争参入病毒的DNA链，终止DNA链的延长和合成，从而达到抑制病毒增殖的目的。在一些实施方式中，所述联合用药物中的药物B为嘧啶核苷类抗HBV药物，可以为拉米夫定、替比夫定、克来夫定、恩曲他滨等。在一些实施方式中，所述联合用药物中的药物B为嘌呤核苷类抗HBV药物，可以为阿德福韦酯、替诺福韦(酯)、恩替卡韦等。在一些实施方式中，所述联合用药物中的药物B选自于以下药物所组成的组中的任何一种或多种：拉米夫定、替比夫定、克来夫定、恩曲他滨、阿德福韦酯、替诺福韦(酯)、恩替卡韦或其药理活性衍生物。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物B可以选自中国《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年，中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合制订)中的核苷类药物，优选一线用药，例如可以为恩替卡韦和/或替诺福韦酯。
恩替卡韦(Entecavir)为环戊基鸟嘌呤核苷类似物，是一种选择性抗HBV的口服药物，它能够选择性地抑制乙肝病毒在肝脏中的复制，应用于病毒复制活跃、血清转氨酶(ALT)持续升高或有肝脏组织学显示活动性病变的成人慢性乙型肝炎患者。中国专利ZL03135304.5公开了具有优良水溶性的恩替卡韦钠盐、钾盐、钙盐和铵盐及其制备方法。
替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)为非环腺嘌呤核苷类似物，系富马酸替诺福韦二吡呋酯，是阿德福韦的同系物，除了具有抗HIV活性外，还具有抗HBV活性，对病毒逆转录有强烈的抑制作用，且与临床上使用的其它核苷类药物没有交叉耐药性。替诺福韦及其药理活性衍生物的所有对映异构体、非对映异构体、外消旋物、以及富集的立体异构体混合物，可参见美国专利号4808716、5733788、6057305的记载。
在一些实施方式中，药物B的选择和用法还可以参考《亚太地区慢性乙型肝炎治疗共识》(2012年，亚太肝脏研究学会(APASL)发布)、《欧洲乙型肝炎病毒感染临床实践指南》(2017年，欧洲肝脏研究学会(EASL)发布)、《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新：AASLD2018乙型肝炎指南》(2018年，美国肝病学会(AASLD)发布)。在另外的实施方式中，药物B的选择和用法还可以参考王汝龙,王曼丽.核苷类抗乙肝病毒药物选评.临床药物治疗杂志.2006,4(4):3-7。以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。
本领域技术人员可采用任意合理的路线合成所期望的药物B、或通过商购获得。在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物B为商购获得的恩替卡韦和/或替诺福韦酯。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物A为式(403)所示化合物或其药理活性衍生物，药物B为恩替卡韦或替诺福韦(酯)或其药理活性衍生物。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.0004-200):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.001-100):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.1-10mg/kg体重(以寡核苷酸计)。在一些实施方式中，药物B根据临床上推荐的使用剂量，不同种类的核苷类似物单次用药的使用剂量也有所不同。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为恩替卡韦或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(1-100):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为0.05-0.2mg/kg体重；
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为阿德福韦酯或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.05-5):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为1-4mg/kg体重；
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替诺福韦或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.02-2):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为2.5-10mg/kg体重；
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为拉米夫定或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.005-0.5):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为10-40mg/kg体重；
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替诺福韦酯或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.002-0.2):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为30-120mg/kg体重；
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替比夫定或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.001-0.1):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。在一些实施方式中，药物A单次用药的使用剂量为0.25-4mg/kg体重(以寡核苷酸计)，药物B单次用药的使用剂量为60-240mg/kg体重。
在一些实施方式中，本公开提供了一种联合用药物，包含不同单位制剂中的用于同时、独立或相继给药的药物A和药物B，其中，所述的联合用药物中药物A和药物B的剂量低于单用有效剂量。所述的低于单用有效剂量是指联合用药物中药物A或药物B的剂量低于单独给予各药物时通常预期可产生有效治疗应答的量。
联合用药物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了联合用药物在制备用于治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了一种预防和/或治疗由HBV引起的病理状况或疾病的方法，该方法包括将有效量的本公开的联合用药物给予有需要的受试者。
所述由HBV引起的病理状况或疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化、肝增生性疾病中的一种或多种。在一些实施方式中，所述疾病为乙型病毒性肝炎。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的联合用药物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本公开的联合用药物同时、独立或相继地施与受试者。其中，药物A的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多联合用药物递送至特定位点；而全身给药需要将药物A递送至受试者的体循环。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由HBV引起的病理状况或疾病的手段，在一些实施方式中，采用能够将药物A递送至肝脏的给药方式。
对于药物A，可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药方式可以是单次给药，也可以是多次给药。对于多次给药，给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月、每两个月、每三个月、每半年或每年给药一次或多次。对于药物B，通常采取口服的方式给药。
当联合用药物为下述情形时，可以获得协同效应：(1)以单位制剂的形式同时、独立或相继给药；(2)通过某些其他方案进行给药。例如药物A被以容纳在分别的注射器中的不同注射剂的形式单次、间隔多次或连续多次进行给药，药物B被以单独的片剂、药丸或胶囊剂进行连续给药，可以获得协同效应。在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物协同地用于治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病。与单独施用药物A或药物B相比，本公开提供的联合用药物对HBV的表达抑制提供大于加和的作用。
本公开所述的联合用药物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的联合用药物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J小鼠，或对于体重30-150kg的人类，对于药物A，以寡核苷酸的量计，其寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重、0.01-50mg/kg体重、0.05-20mg/kg体重、0.1-15mg/kg体重、0.1-10mg/kg体重、0.25-4mg/kg体重、3mg/kg体重或1mg/kg体重。对于药物B，其使用剂量可以为说明书记载的有效剂量或有效剂量的4/5、3/5、2/5、1/5、3/4、1/4、2/3、1/3或1/2。
在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，其中，药物A单次皮下给药，其寡核苷酸用量可以为0.1-10mg/kg体重、0.25-4mg/kg体重、3mg/kg体重或1mg/kg体重，药物B每日口服，其用量可以为说明书记载的有效剂量或有效剂量的4/5、3/5、2/5、1/5、3/4、1/4、2/3、1/3或1/2。在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，其中，药物A皮下给药，每月一次，连续3-6次，其寡核苷酸用量可以为0.1-10mg/kg体重、0.25-4mg/kg体重、3mg/kg体重或1mg/kg体重，药物B每日口服，其用量可以为说明书记载的有效剂量或有效剂量的4/5、3/5、2/5、1/5、3/4、1/4、2/3、1/3或1/2。在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，其中，药物A皮下给药，每周一次，连续3-6次，其寡核苷酸用量可以为0.1-10mg/kg体重、0.25-4mg/kg体重、3mg/kg体重或1mg/kg体重，药物B每日口服，其用量可以为说明书记载的有效剂量或有效剂量的4/5、3/5、2/5、1/5、3/4、1/4、2/3、1/3或1/2。在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，其中，药物A皮下给药，每日一次，连续3-6次，其寡核苷酸用量可以为0.1-10mg/kg体重、0.25-4mg/kg体重、3mg/kg体重或1mg/kg体重，药物B每日口服，其用量可以为说明书记载的有效剂量或有效剂量的4/5、3/5、2/5、1/5、3/4、1/4、2/3、1/3或1/2。
在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，药物A和药物B组合地使用剂量低于单独施用药物A或药物B的有效剂量。
在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，包括单次皮下注射3mg/kg体重如式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，同时口服恩替卡韦(ETV)0.5mg/日，所述剂量组合地有效治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病。
在一些实施方式中，对有需要的受试者给予本公开的联合用药物，包括单次皮下注射3mg/kg体重如式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，同时口服富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)300mg/日或口服替诺福韦艾拉酚胺(TAF)25mg/日，所述剂量组合地有效治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制肝细胞中HBV表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的联合用药物与感染乙型肝炎病毒的肝细胞进行接触。在一些实施方式中，所述细胞为HepG2.2.15细胞。
采用本公开提供的方法抑制HBV基因在细胞中表达，所提供的联合用药物中药物A的寡核苷酸用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
商品化包装
本公开提供了一种商品化包装，所述商品化包装中含有有效量的本公开的联合用药物以及说明其治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的使用说明书。
在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物A与药物B被置于最终上市包装单元的包装规格中，它们在单独的容器中呈单独给药形式。在一些实施方式中，本公开提供的联合用药物中的药物A与药物B以独立制剂的形式单独包装，其中独立制剂中含有药物A或药物B的量适于按照本公开揭露的联合用药物的配比方案；在这种情况下，药品制造商或进口商将联合用药物与其使用说明一起包装，并提供联合给药的指导信息。由于各种疾病自有其特点和不同的严重程度，医生可以根据具体情况将本公开提供的药物A独立制剂并依据说明书与另一独立制剂药物B联合给药，药物A与药物B可以以同时、独立或相继的形式给予需要的受试者。比如：在第一次使用本公开提供的某种规格的药物A独立制剂的同时，按说明书的指导，使用本公开提供的另一种剂量的药物B独立制剂，第二天继续使用药物B，并根据实际情况联合使用药物A的独立制剂(使用时程视病情而定)。
在一些实施方式中，所述商品化包装中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，所述商品化包装可包含用于将联合用药物中的药物A与药学上可接受的辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。在一些实施方式中，所述联合用药物和/或任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的商品化包装中提供注射用无菌水、注射用生理盐水或注射用葡萄糖。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂均为市售商品，所提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
HBV转基因小鼠C57BL/6N-Tg(1.28HBV)/Vst(基因型A型，GenBank:AF305422.1)，购自北京维通达生物技术有限公司。以下有时也简称为1.28copy模型小鼠。
制备例1化合物1的制备
本制备例合成了化合物1(以下，也称为L10-siHBa1M1SVP缀合物)。前述化合物为L-9缀合分子与编号为siHBa1M1SVP的siRNA缀合后形成的缀合物。该缀合物中所缀合的siRNA的序列参见表7。
(1-1)L-10化合物的合成
按照以下方法，合成了L-10化合物：
Figure BDA0002080976530000751
(1-1-1)缀合末端段GAL-5的合成
Figure BDA0002080976530000761
(1-1-1a)GAL-2的合成
将100.0g GAL-1(N-乙酰-D-半乳糖胺盐酸盐，CAS号：1772-03-8，购自宁波弘翔生化公司，463.8mmol)溶于1000ml无水吡啶，冰水浴下加入540ml乙酸酐(购自Enox公司，5565.6mmol)，室温搅拌反应1.5小时。将反应液倒入10L冰水中，减压抽滤，滤饼用2L冰水洗涤后，加乙腈/甲苯混合溶剂(体积比乙腈:甲苯＝1:1)至完全溶解，蒸干溶剂，得到白色固体产品GAL-2 130.0g。
(1-1-1b)GAL-3的合成
将步骤(1-1-1a)中获得的GAL-2(35.1g，90.0mmol)溶解于213ml无水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮气保护条件下，加入24.0g TMSOTf(CAS号：27607-77-8，购自麦克林公司，108.0mmol)，室温反应过夜。
在反应液中加入400ml二氯甲烷稀释，以硅藻土过滤，再加入1L饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌均匀，分出有机相，水相用二氯乙烷萃取两次，每次300ml，合并有机相，分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到浅黄色粘稠糖稀状产品GAL-3 26.9g。
(1-1-1c)GAL-4的合成
将步骤(1-1-1b)中获得的GAL-3(26.9g，81.7mmol)溶于136ml无水1,2-二氯乙烷中，加入干燥的
Figure BDA0002080976530000771
分子筛粉末30g，再加入9.0g 5-己烯-1-醇(CAS号：821-41-0，购自Adamas-beta公司，89.9mmol)，室温下搅拌30分钟，冰浴和氮气保护下加入9.08g TMSOTf(40.9mmol)，室温下搅拌反应过夜。过滤除去
Figure BDA0002080976530000772
分子筛粉末，滤液中加入300ml二氯甲烷稀释，以硅藻土过滤，再加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液搅拌10分钟洗涤，分出有机相，水相用300ml二氯乙烷萃取一次，合并有机相并分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到黄色糖稀状产品GAL-441.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(1-1-1d)GAL-5的合成
将按照步骤(1-1-1c)中描述的方法得到的GAL-4(14.9g，34.7mmol，)溶于77ml二氯甲烷和77ml乙腈的混合溶剂中，分别加入103ml去离子水和29.7g高碘酸钠(CAS号：7790-28-5，购自阿拉丁公司，138.8mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入三氯化钌(CAS号：14898-67-0，购自安耐吉公司，238mg，1.145mmol)，室温反应过夜。反应液加入300ml水稀释搅拌，加饱和碳酸氢钠调pH约为7.5，分出并弃去有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，弃去有机相。水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到白色泡沫状固体产品GAL-5 6.85g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.01(br,1H),7.83(d,J＝9.2Hz,1H),5.21(d,J＝3.2Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.2Hz,1H),4.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.07–3.95(m,3H),3.92–3.85(m,1H),3.74–3.67(m,1H),3.48–3.39(m,1H),2.20(t,J＝6.8Hz,2H),2.11(s,3H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.77(s,3H),1.55–1.45(m,4H).
(1-1-2)L-8的合成：
Figure BDA0002080976530000781
将J-0(9.886g，52.5mmol，商购自阿法埃沙公司)和步骤(1-1-1)中得到的GAL-5(72.819g，162.75mmol，由多批次产物合并而得)溶于525ml二氯甲烷，加入二异丙基乙胺(DIEA，44.782g，346.50mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP，90.158g，173.25mmol)和羟基苯并三唑(HOBt，23.410g，173.25mmol)，室温下反应4h，加入20ml饱和碳酸氢钠和200ml饱和食盐水进行洗涤，水相用二氯甲烷萃取2次，每次100ml，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。纯化使用200-300目正相硅胶，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，1wt‰三乙胺平衡柱子，以二氯甲烷:甲醇＝100:25-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-8 38.8g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.84(d,J＝9.0Hz,3H),7.27–7.23(m,1H),7.13–7.18(m,1H),5.22(d,J＝3.1Hz,3H),4.97(dd,J＝11.3,3.1Hz,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,3H),4.09–3.98(m,9H),3.88(dd,J＝19.3,9.3Hz,3H),3.75–3.66(m,3H),3.44–3.38(m,3H),3.17–3.30(m,4H),3.10–2.97(m,4H),2.35–2.20(m,6H),2.15–2.08(m,9H),2.07–1.98(m,13H),1.94–1.87(m,9H),1.81–1.74(m,9H),1.65–1.42(m,18H).MS m/z：C85H119N7O30，[M+H]+，理论：1477.59，实测：1477.23。
(1-1-3a)A-1的合成
Figure BDA0002080976530000782
将DMTrCl(4,4'-双甲氧基三苯甲基氯，101.65g，300mmol)溶于1000ml无水吡啶中，加入DL-甘油酸钙水合物(28.63g，100mmol)，在45℃反应20h，将反应液过滤，滤饼用200ml DCM淋洗，滤液减压浓缩至干，剩余物用500ml二氯甲烷重新溶解，0.5M三乙胺磷酸盐(pH＝7-8)洗涤2次，每次200ml，水相以二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，200-300目正相硅胶柱纯化，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.35-1:1:1:0.55梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，600ml二氯甲烷重新溶解，以200ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤1次，水相用200ml二氯甲烷萃取1次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，真空油泵减压下过夜，得到白色固体产品A-1 50.7g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(ddd,J＝6.5,2.3,1.1Hz,1H),7.40–7.28(m,7H),6.89–6.81(m,4H),4.84(d,J＝5.0Hz,1H),4.36–4.24(m,1H),4.29(s,6H),3.92(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.67(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.52(q,J＝6.3Hz,6H),1.03(t,J＝6.3Hz,9H).MS m/z：C24H23O6，[M-H]-，理论：407.15，实测：406.92。
(1-1-3b)L-7的合成：
Figure BDA0002080976530000791
将步骤(1-1-2)中获得的L-8(40g，27.09mmol，由多批次产物合并而得)和步骤(1-1-3a)中获得的A-1(41.418g，81.27mmol)混合，溶于271ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)(24.318g，81.37mmol)，再加入二异丙基乙胺(21.007g，162.54mmol)，25℃下搅拌反应1.5h，用800ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次50ml，以150ml饱和食盐水洗涤有机相，水相以50ml二氯甲烷萃取1次，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜，得到粗品。柱纯化使用2kg 200-300目正相硅胶，以200ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-7 40.4g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.90–7.78(m,4H),7.75–7.64(m,1H),7.38–7.18(m,9H),6.91–6.83(m,4H),5.25–5.10(m,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.2Hz,3H),4.48–4.30(m,4H),4.02(s,9H),3.93–3.84(m,3H),3.76–3.66(m,9H),3.45–3.35(m,3H),3.24–2.98(m,10H),2.30–2.20(m,2H),2.11–1.88(m,31H),1.80–1.40(m,28H).MS m/z：C90H128N7O35，[M-DMTr]+，理论：1564.65，实测：1564.88。
(1-1-4)L-9的合成：
Figure BDA0002080976530000801
将步骤(1-1-3b)中获得的L-7(40g，21.4247mmol)、丁二酸酐(4.288g，42.8494mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，5.235g，42.8494mmol)混合溶于215ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIEA，13.845g，107.1235mmol)，25℃下搅拌24h，800ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用1kg 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-9缀合分子31.0g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.58(d,J＝4.2Hz,1H),7.94–7.82(m,3H),7.41–7.29(m,5H),7.22(d,J＝8.1Hz,5H),6.89(d,J＝8.3Hz,4H),5.49–5.37(m,1H),5.21(d,J＝3.0Hz,3H),4.97(d,J＝11.1Hz,3H),4.49(d,J＝8.2Hz,3H),4.02(s,9H),3.88(dd,J＝19.4,9.4Hz,3H),3.77–3.65(m,9H),3.50–3.39(m,6H),3.11–2.90(m,5H),2.61–2.54(m,4H),2.47–2.41(m,2H),2.26–2.17(m,2H),2.15–1.95(m,22H),1.92–1.84(m,9H),1.80–1.70(m,10H),1.65–1.35(m,17H),1.31–1.19(m,4H),0.96(t,J＝7.1Hz,9H).MS m/z：C94H132N7O38，[M-DMTr]+，理论：1664.72，实测：1665.03。
(1-1-5)L-10化合物的合成：
Figure BDA0002080976530000811
此步骤中，通过将L-9缀合分子连接至固相载体，制备了L-10化合物。
将步骤(1-1-4)中获得的L-9缀合分子(22.751g，11mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯/盐(HBTU，6.257g，16.5mmol)和二异丙基乙胺(DIEA，2.843g，22mmol)混合，溶于900ml乙腈，室温搅拌5分钟，向反应液中加入氨甲基树脂(88g，100-200目，氨基载量400μmol/g，购自南开和成公司)，25℃下进行摇床反应，转速150转/分钟，反应18h后过滤，滤饼以DCM淋洗2次，每次300ml，乙腈淋洗3次，每次300ml，真空油泵干燥18h，随后再按照表6中示出的投料配比加入原料(CapA、CapB、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙腈)进行盖帽反应。25℃下置于摇床上，转速150转/分钟，反应5h，反应液过滤，滤饼用乙腈淋洗3次，每次300ml，减压蒸发溶剂至干，真空油泵减压下干燥过夜，得到L-10化合物(即，连接固相载体的L-9缀合分子)102g，载量90.8μmol/g。
表6盖帽反应投料配比
Figure BDA0002080976530000812
Figure BDA0002080976530000821
其中，CapA和CapB为盖帽试剂溶液，CapA为20体积％N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；CapB为20体积％乙酸酐的乙腈溶液。
(1-2)合成化合物1的正义链
通过固相亚磷酰胺法，利用上述步骤制备的L-10化合物起始循环，按照正义链核苷酸排布顺序自3'-5'方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。其中，两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括保护、偶联、盖帽、硫化四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑(5-(Ethylthio)-1H-tetrazole，ETT)的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，将残余物真空浓缩至干。
纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，实现核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25(SephadexG25)，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度，使用液质联用(LC-MS)分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是3'末端缀合了L-9缀合分子的正义链S。
(1-3)合成化合物1的反义链
通过固相亚磷酰胺法，利用通用固相载体(UnyLinkerTMloaded
Figure BDA0002080976530000831
HLSolid Supports，Kinovate Life Sciences公司)起始循环，合成化合物1的反义链AS。固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件，切割和脱保护，纯化与脱盐条件与合成正义链相同。
检测：纯度采用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测；分子量采用液质联用(LC-MS)进行分析。其结果，实测值与理论值相符，表明所合成的是具有目标序列的反义链AS。
其中，乙烯基磷酸酯修饰的2'-甲氧基修饰尿嘧啶核苷单体(VP-Um)按照以下方法合成：
Figure BDA0002080976530000841
(1-3-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
Figure BDA0002080976530000842
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解后加300ml饱和碳酸氢钠洗涤，水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml，合并有机相，用5％草酸洗涤至水相pH<5，蒸发溶剂至干后获得VP-U-1粗品直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，外加冰浴搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱冷藏好的450ml 2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠淬灭反应，有机相加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至pH＝8。合并水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，再用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论：497.21，实测：497.45。
(1-3-2)VP-U-4的合成：
Figure BDA0002080976530000851
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20h。另取亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120ml THF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10min，再升至室温反应0.5h，然后加入至前述反应液中，约1h加完，冰浴温度下反应1h，再升至室温反应18h。加水淬灭反应，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并有机相，用200ml饱和食盐水水洗一次后蒸发溶剂至干。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论：629.24，实测：629.51。
(1-3-3)VP-U-5的合成：
Figure BDA0002080976530000861
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸(17.96g，111.45mmol)，室温搅拌20h反应完全。直接蒸发溶剂至干，再用二氯甲烷溶解随后蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论：391.13，实测：391.38。
(1-3-4)VP-U-6的合成：
Figure BDA0002080976530000862
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5重量％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论：591.23，实测：591.55。表明VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
(1-4)合成化合物1
对于化合物1，将S链与AS链分别溶于注射用水中，得到40mg/mL的溶液，以等摩尔比混合，50℃加热15min，室温冷却后，使它们通过氢键形成双链结构。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCTPremier)进行分子量检测。其结果，理论值S：7516.37，AS：7061.57，实测值S：7516.6，AS：7060.49。实测值与理论值一致，说明所合成的化合物1是目标设计的带有L-9缀合分子的双链核酸序列。其结构如式(403)所示。
制备例2化合物2(L10-siHBa1M1SP缀合物)及对照化合物(L10-siNC缀合物)的制备
采用与制备例1相同的方法，合成了化合物2和对照化合物，不同的是：1)所述siRNA分别为表7中所示的对应于化合物2和对照化合物的序列；2)当目标序列中在反义链5'-末端第一个核苷酸处具有5'-P时，按照固相亚磷酰胺法制备反义链过程中，在连接反义链最后一个核苷单体后，再经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应将CPR-I单体(苏州吉玛，货号Cat#13-2601-XX)连接至反义链5'末端，形成5'-磷酸酯修饰。
Figure BDA0002080976530000871
该连接中，使用的通用固相载体，脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件，切割和脱保护，纯化与脱盐条件与合成正义链相同。
在合成完成后，使用与制备例1相同的检测方法对所得化合物进行了确认。其中：
化合物2的理论值S：7516.37，AS：7065.58，实测值S：7516.6，AS：7064.5；
对照化合物的理论值S：7483.6，AS：7044.2，实测值S：7484.7，AS：7045.2。对照化合物中的siNC是一条无关序列，是对HBV基因无抑制作用的阴性对照siRNA。
表7化合物
Figure BDA0002080976530000881
Figure BDA0002080976530000891
制备例3化合物3(P10-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
(3-1)P-10化合物的合成
按照以下方法，合成了P-10化合物：
Figure BDA0002080976530000901
(3-1-1)GAL5-C4-1的合成
向40ml N,N-二甲基甲酰胺中加入按照上述(1-1-1)中描述的方法得到的GAL-5(13.43g，30.0mmol)、4-氨基酸叔丁酯盐酸盐(5.87g，30.0mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(13.65g，36.0mmol)和二异丙基乙胺(11.63g，90.0mmol)，溶解均一后室温搅拌反应5小时。向反应液中加入300ml饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次，每次200ml，合并有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂至干得到30.3g油状物粗品GAL5-C4-1，直接进行下一步反应。
(3-1-2)GAL5-C4-2的合成
将步骤(3-1-1)中获得的GAL5-C4-1粗品(30.3g，30mmol)溶于180ml甲酸中，室温搅拌反应16小时。蒸发溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)，收集反应洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物GAL5-C4-2共14.84g。
(3-1-3)P-6的合成：
将按照步骤(1-1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)与将步骤(3-1-2)中获得的GAL5-C4-2(8.24g，15.48mmol，由两批产物合并获得)混合溶于47ml乙腈，再加入N-甲基吗啉(3.13g，30.96mmol)，最后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室温搅拌反应2h。以20ml二氯甲烷稀释反应液，10ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，10ml饱和食盐水洗涤有机相，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品P-6共8.27g。
(3-1-4)P-7的合成：
将按照上述(3-1-3)中得到的P-6(6.82g，3.456mmol)溶于69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室温下反应2h。加入100ml二氯甲烷稀释反应液，再加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤调节pH＝7-8之间，水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。用200-300目正相硅胶纯化，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，以1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到P-7共4.82g。MS m/z：C78H127N10O33，[M+H]+，理论：1732.91，实测：1735.73。
(3-1-5)P-8的合成：
Figure BDA0002080976530000921
将P-7(2.653g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶于16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)(1.375g，4.596mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下搅拌反应2h。用10ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，10ml饱和食盐水洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。柱纯化使用120g 200-300目正相硅胶，以20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品P-8共2.793g。
(3-1-6)P-9的合成：
将P-8(490mg，0.231mmol)、丁二酸酐(69mg，0.693mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，68mg，0.554mmol)混合溶于2.3ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，149mg，1.155mmol)，25℃下搅拌反应21h。50ml二氯甲烷稀释反应液，再加入100ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并有机相，减压蒸干得到粗品。柱纯化使用80g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品P-9缀合分子共200mg。MS m/z：C106H153N10O41，[M-DMTr]+，理论：1921.05，实测：1920.97。
(3-1-7)P-10的合成：
通过与制备例1中步骤(1-1-5)相同的方法，制备P-10。不同的是以P-9缀合分子代替L-9缀合分子，得到连接固相载体的P-9缀合分子。
(3-2)合成P10-siHBa1M1SVP缀合物
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物3，不同的是以P-10化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到P10-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(404)所示。
制备例4化合物4(R5-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
(4-1)R-5化合物的合成
按照以下方法，合成了R-5化合物：
Figure BDA0002080976530000931
(4-1-1)GAL-C7-1的合成
将按照步骤(1-1-1b)中描述的方法得到的GAL-3(26.4g，80.2mmol)溶于134ml无水1,2-二氯乙烷中，加入
Figure BDA0002080976530000941
分子筛粉末60g，再加入7-辛烯-1-醇(11.3g，88.2mmol)，室温下搅拌反应10分钟，冰浴和氮气保护下加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(8.9g，40.1mmol)，室温搅拌反应24小时。过滤除去
Figure BDA0002080976530000942
分子筛粉末，滤液中加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，分出有机相，水相用100ml二氯甲烷萃取一次，合并有机相并用250ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂至干得到黄色糖稀状产品GAL-C7-1 33.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(4-1-2)GAL-C7-2的合成
将按照步骤(4-1-1)中得到的GAL-C7-1(33.3g，72.8mmol)溶于160ml二氯甲烷和160ml乙腈的混合溶剂中，分别加入216ml水和高碘酸钠固体(62.3g，291.2mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入催化剂三氯化钌(498mg，2.4mmol)自然升至室温搅拌反应23小时。反应液加入200ml水稀释搅拌，加饱和碳酸氢钠调节pH值为7.5，分掉有机相，水相再用二氯甲烷萃取三次，弃去有机相，水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)纯化得到白色泡沫状固体产品GAL-C7-2 22.4g。MS m/z：C21H32NO11，[M+H]+，理论：476.50，实测：475.94。
(4-1-3)R-1的合成：
将按照步骤(1-1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)与GAL-C7-2(7.36g，15.48mmol)混合溶于47ml乙腈，再加入N-甲基吗啉(3.13g，30.96mmol)，最后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室温搅拌反应2h。以200ml二氯甲烷稀释反应液，100ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，100ml饱和食盐水洗涤有机相，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品R-1 7.82g。
(4-1-4)R-2的合成：
将R-1(6.23g，3.456mmol)溶于69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室温下反应2h。加入100ml二氯甲烷稀释反应液，再加饱和碳酸氢钠溶液洗涤调节pH＝7-8之间，水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。200-300目正相硅胶，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，以1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品R-24.49g。
(4-1-5)R-3的合成：
将R-2(2.391g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶于16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)(1.375g，4.596mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下搅拌反应2h。用10ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，以10ml饱和食盐水洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。柱纯化使用120g 200-300目正相硅胶，以20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品R-3 2.642g。
(4-1-6)R-4的合成：
将R-3(795mg，0.4074mmol)、丁二酸酐(82mg，0.8148mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，100mg，0.8148mmol)混合溶于4ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，100mg，0.8148mmol)，25℃下搅拌反应18h。5ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用30g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品R-4缀合分子505mg。
(4-1-7)R-5的合成：
通过与制备例1中步骤(1-1-5)相同的方法，制备R-5。不同的是以R-4缀合分子代替L-9缀合分子，得到连接固相载体的R-4缀合分子。
(4-2)合成R5-siHBa1M1SVP缀合物
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)(1-4)相同的方法，制备化合物4，不同的是以R-5化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到R5-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(407)所示。
制备例5化合物5(LA5-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
按照以下工艺路线，预期能够合成LA-5化合物：
Figure BDA0002080976530000971
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物5，不同的是以LA-5化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到LA5-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(412)所示。
制备例6化合物6(LB5-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
(6-1)LB-5化合物的合成
按照以下方法，合成了LB-5化合物：
Figure BDA0002080976530000981
(6-1-1)LB-1的合成：
将按照步骤(1-1-6)中描述的方法得到的L-8(5.0g，3.386mmol)、己二酸酐(870mg，6.772mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，827mg，6.772mmol)混合溶于130ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，2.2g，16.931mmol)，25℃下搅拌反应4h。加入70ml二氯甲烷稀释反应液，以0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷萃取4次，每次10ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用120g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.2-1:1:1:1梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品LB-1 4.267g。
(6-1-2)LB-2的合成：
将按照步骤(6-1-1)中描述的方法得到的LB-1(4.697g，2.753mmol，由两批次产物合并而得)、3-氨基-1,2-丙二醇(313mg，3.442mmol)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，953mg，3.442mmol)和N-甲基吗啉(700mg，6.884mmol)先后加入30ml乙腈和3ml甲醇的混合液中，室温搅拌反应过夜。蒸发溶剂至干，柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝1:0.07-1:0.5梯度洗脱)纯化，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物LB-2 3.27g。
(6-1-3)LB-3的合成：
将LB-2(2.27g，1.353mmol)用14ml无水吡啶溶解。再加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(688mg，2.03mmol)室温下搅拌反应过夜。加150ml甲醇淬灭，蒸发溶剂至干。柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝1:0.05-1:0.2梯度洗脱)纯化，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物LB-3 1.647g。
(6-1-4)LB-4的合成：
将LB-3(822mg，0.415mmol)、丁二酸酐(83g，0.83mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，102mg，0.83mmol)混合溶于4ml二氯甲烷，再加入DIPEA(270mg，2.075mmol)，25℃下搅拌反应过夜。0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液3次，水相以二氯甲烷萃取3次，每次2ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用200-300目正相硅胶，以5wt％三乙胺中和硅胶酸性，以石油醚平衡柱子，用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:20梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品LB-4缀合分子787mg。
(6-1-5)LB-5的合成：
通过与制备例1中步骤(1-1-5)相同的方法，制备LB-5。不同的是以LB-4缀合分子代替L-9缀合分子，得到连接固相载体的LB-4缀合分子。
(6-2)合成LB5-siHBa1M1SVP缀合物
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物6，不同的是以LB-5化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到LB5-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(413)所示。
制备例7化合物7(V8-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
按照以下工艺路线，预期能够合成V-8化合物：
Figure BDA0002080976530001011
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物7，不同的是以V-8化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到V8-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(414)所示。
制备例8化合物8(W8-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
(8-1)W-8化合物的合成
按照以下方法，合成了W-8化合物：
Figure BDA0002080976530001021
(8-1-1)W-1的合成：
将W-0(2.024g，10mmol)溶于25ml乙腈中，再加三乙胺(4.048g，40mmol)，冰水浴冷却至0℃左右，加入三氟乙酸乙酯(5.683g，40mmol)，室温下反应22h。减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥18h，得到5.835g粗品固体W-1。
(8-1-2)W-2的合成：
将W-1粗品(5.835g，10mmol)溶于50ml二氯甲烷，向反应液中加入TrCl(3.345g，12mmol)和三乙胺(1.518g，15mmol)，室温下搅拌反应20h。用20ml饱和碳酸氢钠洗涤反应液2次，用20ml饱和食盐水洗涤1次，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干有机溶剂，真空油泵发泡干燥过夜，得到粗品固体W-2 8.012g。不经处理，进行下一步脱保护反应。
(8-1-3)W-3的合成：
将W-2粗品(8.012g，10mmol)溶于100ml甲醇，再加入100ml甲胺水溶液(40wt％)，在50℃下搅拌反应23h。过滤除去不溶颗粒物，减压蒸干溶剂，加入200ml体积比为1:1的DCM-甲醇混合溶剂，以50ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相再用二氯甲烷萃取3次，每次50ml，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品W-3 3.062g。
(8-1-4)W-4的合成：
将W-3(0.675g，1.517mmol)与GAL-C7-2(2.60g，5.46mmol)混合溶于47ml乙腈，再加二异丙基乙胺(1.57g，12.14mmol)，最后加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，1.816g，6.04mmol)，室温搅拌反应2.5h。以100ml二氯甲烷稀释反应液，80ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，80ml饱和食盐水洗涤有机相，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品W-4 1.610g。
(8-1-5)W-5的合成：
将W-4(1.61g，0.886mmol)溶于125ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(3.5ml，42.43mmol)，室温下反应1h。加入150ml吡啶中和反应液，减压蒸干溶剂得粗品。200-300目正相硅胶，10wt％三乙胺中和硅胶酸性，1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-5 1.26g。
(8-1-6)W-6的合成：
将W-5(1.25g，0.793mmol)和按照步骤(1-1-7a)中描述的方法得到的A-1(1.21g，2.38mmol)混合溶于12ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，0.712g，2.38mmol)，再加入二异丙基乙胺(0.615g，4.76mmol)，25℃下搅拌反应3h。用80ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并有机相并以10ml饱和食盐水洗涤，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。柱纯化使用185g 200-300目正相硅胶，20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.1-1:1:0.7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-6 1.57g。
(8-1-7)W-7的合成：
将W-6(1.238g，0.63mmol)、丁二酸酐(0.189g，1.89mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.231g，1.89mmol)混合溶于7ml二氯甲烷，再加入DIEA(0.407g，3.15mmol)，25℃下搅拌反应24h。以5ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用30g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-7缀合分子1.033g。MS m/z：C101H146N7O38，[M-DMTr]+，理论：1763.92，实测：1763.21。
(8-1-8)W-8的合成：
通过与制备例1中步骤(1-1-5)相同的方法，制备W-8。不同的是以W-7缀合分子代替L-9缀合分子，得到连接固相载体的W-7缀合分子。
(8-2)合成W8-siHBa1M1SVP缀合物
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物8，不同的是以W-8化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到W8-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(415)所示。
制备例9化合物9(X8-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
按照以下工艺路线，预期能够合成X-8化合物：
Figure BDA0002080976530001061
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物9，不同的是以X-8化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到X8-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(421)所示。
制备例10化合物10(Z5-siHBa1M1SVP缀合物)的制备
(10-1)Z-5化合物的合成
按照以下方法，合成了Z-5化合物：
Figure BDA0002080976530001071
(10-1-1)Z-1的合成：
将按照步骤(8-1-3)中描述的方法得到的W-3(1.50g，3.37mmol)与按照步骤(3-1-2)中描述的方法得到的GAL5-C4-2(7.18g，13.48mmol)混合溶于34ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(3.48g，26.96mmol)，最后加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，4.04g，13.48mmol)，室温搅拌反应4.5h。以100ml二氯甲烷稀释反应液，80ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，80ml饱和食盐水洗涤有机相，合并有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝30:1-15:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品Z-13.97g。MS m/z：C98H143N10O33，[M+H]+，理论：1987.98，实测：1987.90。
(10-1-2)Z-2的合成：
将Z-1(3.97g，2.00mmol)溶于250ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(10.941g，84.85mmol)，室温下反应1h。加入吡啶中和反应液至中性，减压蒸干溶剂得粗品。220g 200-300目正相硅胶装柱，10％吡啶中和硅胶酸性，1‰吡啶平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝10:1-2:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-2 3.49g。MS m/z：C79H129N10O33，[M+H]+，理论：1746.94，实测：1746.90。
(10-1-3)Z-3的合成：
将Z-2(3.49g，2.0mmol)和按照步骤(1-1-7a)中描述的方法得到的A-1(3.06g，6.0mmol)混合溶于30ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，1.80g，6.0mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.55g，12.0mmol)，25℃下搅拌反应3h。100ml二氯甲烷稀释反应液，用饱和碳酸氢钠洗涤有机相2次，每次30ml，水相以10ml二氯甲烷萃取，合并有机相并以50ml饱和食盐水洗涤，合并有机相无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。柱纯化使用200g 200-300目正相硅胶，20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝25:1-15:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-3 2.2g。MS m/z：C103H151N10O38，[M+H]+，理论：2136.02，实测：2136.20。
(10-1-4)Z-4的合成：
将Z-3(2.10g，0.983mmol)溶解在含有DIEA(0.635g，4.915mmol)的14.8ml二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，240mg，1.966mmol)搅拌澄清后，加入丁二酸酐(197mg，1.966mmol)，25℃下搅拌反应18h。加入50ml二氯甲烷稀释反应液，以80ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取2次，每次50ml，合并有机相减压蒸干得到粗品。柱纯化使用188g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝10:1-3:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-4缀合分子1.95g。MS m/z：C107H155N10O41，[M+H]+，理论：1935.07，实测：1935.29。
(10-1-5)Z-5的合成
通过与制备例1中步骤(1-1-5)相同的方法，制备Z-5。不同的是以Z-4缀合分子代替L-9缀合分子，得到连接固相载体的Z-4缀合分子。
(10-2)合成Z5-siHB1M1SVP缀合物
通过与制备例1中步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)相同的方法，制备化合物10，不同的是以Z-5化合物代替L-10化合物起始正义链合成。预期可以得到Z5-siHBa1M1SVP缀合物，其结构如式(422)所示。
本领域技术人员能够理解的是，通过上述制备例1-10的方法，缀合不同的siRNA序列，即可合成出靶向HBV mRNA不同位置的化合物。当目标序列中包含未修饰的核苷酸时，在切割与脱保护条件中，在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，以脱除核糖上的2'-TBDMS保护。因而，任何已知的或未知的抑制HBV表达的siRNA都可以制备出本公开提供的药物A。按照相同的制备手段，也可以缀合抑制HBV表达的单链寡核苷酸得到另一种形式的本公开提供的药物A。
在上述本公开的缀合物制备完成后，使用标准手段冻干为固体粉末保存备用。在使用时，可使用例如注射用水、生理盐水(NS)、磷酸缓冲液(PB)或磷酸盐缓冲液(PBS)等将其重新溶解为所需浓度的溶液使用。
以下实施例中，本公开的联合用药物包含以L10-siHBa1M1SVP和L10-siHBa1M1SP表示的siRNA缀合物为代表的药物A，及恩替卡韦为代表的药物B，并且测试了该联合用药物在HBV模型小鼠上对血清HBsAg和HBV DNA表达量的抑制作用。本领域技术人员可以理解，当本公开的联合用药物使用表1-表5所示序列制得的相应缀合物作为药物A，联合以治疗HBV功效已知的其他种类核苷类药物作为药物B，如拉米夫定、替比夫定、克来夫定、恩曲他滨、阿德福韦酯、替诺福韦(酯)或其药理活性衍生物，可以得到相似的结果。因此，这些联合用药物均落入本公开的范围之内。
实验例1本实验说明本公开的联合用药物在HBV 1.28copy模型小鼠中对血清HBsAg和HBV DNA表达量的抑制效率的时间相关性测试
用0.9％氯化钠水溶液(生理盐水)将化合物1配制成浓度为0.6mg/ml和0.2mg/ml(以siRNA的浓度计算)的溶液，分别适用于化合物1的高剂量(3mg/kg)和低剂量(1mg/kg)给药。用生理盐水充分溶解恩替卡韦片剂(购自上海施贵宝)，配制成浓度为0.02mg/ml的溶液。根据临床剂量0.5mg/日，推算恩替卡韦治疗小鼠的剂量为0.1mg/kg体重。
选取6-9周龄的1.28copy模型小鼠(购自北京维通达)，取血清HBsAg含量大于104COI的小鼠(雌雄各半)，随机分成6组，每组8只，分别记为(1)生理盐水对照组、(2)化合物1高剂量组(3mg/kg)、(3)化合物1低剂量组(1mg/kg)、(4)恩替卡韦ETV组(0.1mg/kg)、(5)联合用药物高剂量组(化合物1 3mg/kg联合ETV 0.1mg/kg)和(6)联合用药物低剂量组(化合物1 1mg/kg联合ETV 0.1mg/kg)。给药前记为D0，给药当天记为D1。对于组别(1)、(2)、(3)、(5)、(6)，根据动物体重单次皮下注射生理盐水或不同浓度的化合物1溶液，给药体积为5mL/kg体重。对于组别(4)、(5)、(6)，灌胃施予恩替卡韦，给药体积为5mL/kg体重，每天一次，连续给药28天。所有动物均在上午给药，如需采血，给药在采血后进行。在给药前第0天与给药后第8、15、22、29、43、57、71、85天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg和HBV DNA含量。第85天处死所有小鼠。终末处理时，所有动物处死前称重、眼眶静脉取血检测血清HBV DNA、HBsAg及ALT、AST肝功能指标，对动物进行大体解剖。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl，用PBS重悬到500μl，送北京迪安医学检验中心检测血清中HBsAg和HBV DNA含量，分别用COI、IU/ml表示。
待测指标(血清HBsAg或血清HBV DNA)的归一化水平按如下等式计算：
待测指标的归一化水平＝给药后待测指标的残留含量/给药前待测指标含量×100％
待测指标的抑制率＝(1-待测指标的归一化水平)×100％。
实验数据均以
Figure BDA0002080976530001112
表示，数据分析采用Graphpad prism5.0统计分析软件。首先对数据进行正态分布及方差齐性检验。符合正态分布(p>0.20)及方差齐(p>0.10)：多组间比较采用单因素方差分析的LSD法进行多重比较，p<0.05认为有统计学意义；不符合正态分布或方差不齐：多组间比较采用非参数检验的Kruskal-Wallis H方法，如果Kruskal-wallis H检验结果显著(p<0.05)，再将数据进行秩转换后，进行多组间两两比较，p<0.05认为有统计学意义。
各组待测指标的归一化水平如图1-2所示。
与给药前相比，各组给药后在不同时间点，血清HBV DNA含量显著降低，其降低的程度用给药前血清HBV DNA含量是给药后血清HBV DNA残留含量的倍数(t)表示，例如，当降低程度显示为10倍时，表明给药前血清HBV DNA含量是给药后血清HBV DNA残留含量的10倍，亦即给药后血清HBV DNA含量是给药前血清HBV DNA残留含量的1/10。检测结果参见表8所示。
表8血清HBV DNA含量
Figure BDA0002080976530001111
由图1可以看出，联合用药物可以高效抑制HBV DNA的表达，在长达85天的观察时间内均保持了较高的抑制率。对于联合用药物高剂量组，HBV DNA最大抑制率出现在给药后第29天，即单次给予化合物1，ETV日服28天后，HBV DNA的抑制率超99.99％；也就是说，给药后第29天，血清HBV DNA残留含量是给药前HBV DNA含量的1/18756，可以理解为，相比于给药前HBV DNA降低了近20000倍。停止ETV治疗，在给药后长达85天的时间内，HBV DNA的抑制率仍然维持在90％以上；血清HBV DNA降低了1030倍。对于联合用药物低剂量组，给药后第29天HBV DNA残留含量是给药前的1/6120。而单纯的ETV治疗组，在连续给药28天后，血清HBV DNA残留含量只是给药前的1/1861。本公开提供的联合用药物与单药在同等剂量下相比，更能显著抑制HBV DNA的表达。以给药后第29天为例，联合用药物高剂量组对HBV DNA的抑制率，是相同治疗时间内，单独施予ETV的10.1倍，是单独施予化合物1的82.6倍。
由图2可以看出，在给药后不同时间点，施以生理盐水的阴性对照组及单独施予ETV组，对血清表面抗原均未显示出任何抑制作用；与之相比，两个剂量下的联合用药物组在给药后不同时间点对HBsAg均体现出优异的抑制效果。对于联合用药物高剂量组，给药后15天，HBsAg最大抑制率达99.9％；给药后长达71天内，HBsAg的抑制率仍然维持在90％左右。联合用药物显著地填补了核苷类似物无法抑制表面抗原的缺陷，对乙肝功能性治愈显示出优异潜力。
此外，终末期取血，ALT、AST肝功能指标送北京迪安医学检验中心检测，与给药前相比，各组均未发现明显异常。动物大体解剖，未观察到有明显病变。这些结果表明，本公开提供的联合用药物相对安全，无明显毒副作用。
采用与上述相同的方法，检测了化合物2联合恩替卡韦对血清HBV DNA和HBsAg的抑制效率随治疗时间的相关性变化。待测指标的归一化水平如图3-4所示。与给药前相比，给药后不同时间点，各组HBV DNA降低的程度见表9。
表9血清HBV DNA含量
Figure BDA0002080976530001121
Figure BDA0002080976530001131
该结果表明本公开提供的联合用药物能够在较长时间内稳定高效地抑制HBV基因的表达，尤其对表面抗原的长效持久的抑制，显示出优异的效果。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物
<130> 13671RIBO
<160> 276
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccuugaggca uacuucaan 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
nuugaaguau gccucaagg 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugcuaugccu caucuucun 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
nagaagauga ggcauagca 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucugugccuu cucaucugn 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ncagaugaga aggcacaga 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgugugcacu ucgcuucan 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
nugaagcgaa gugcacacg 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaaguaugu caacgaaun 19
<210> 10
<211> 19
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<212> RNA
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<400> 113
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<212> RNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
uauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gaaaguaugu caacgaauu 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aauucguuga cauacuuucu u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaguaugu caacgaauu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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gaccuugagg cauacuucaa a 21
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uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ugcuaugccu caucuucua 19
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ucagaugaga aggcacagac g 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
ucugugccuu cucaucuga 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ucagaugaga aggcacagac g 21
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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gaaaguaugu caacgaaua 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
uauucguuga cauacuuucu u 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
gaaaguaugu caacgaaua 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
uauucguuga cauacuuucc a 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
gaaaguaugu caacgaauu 19
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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gaaaguaugu caacgaaua 19
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<211> 21
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ugcuaugccu caucuucua 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 232
uagaagauga ggcauagcag c 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 233
ugcuaugccu caucuucua 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 234
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 250
aauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 251
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 251
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 252
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 252
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 253
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 253
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 254
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 254
uauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 255
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 255
gaaaguaugu caacgaauu 19
<210> 256
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 256
aauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 257
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 257
gaaaguaugu caacgaauu 19
<210> 258
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 258
aauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 259
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 260
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 260
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 261
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 261
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 262
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 262
uauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 263
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
gaaaguaugu caacgaauu 19
<210> 264
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
aauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 265
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 265
gaaaguaugu caacgaauu 19
<210> 266
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
aauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 267
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 267
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 268
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 268
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 269
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 269
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 270
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 270
uauucguuga cauacuuucc a 21
<210> 271
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 271
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 272
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 272
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 273
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 273
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 274
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 274
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 275
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 275
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 276
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 276
acgugacacg uucggagaac u 21

Claims (19)

1.一种联合用药物，所述联合用药物包含药物A和药物B，其中，所述药物A为一种或多种如式(1)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为对由HBV引起的病理状况或疾病具有治疗和/或预防作用的核苷类似物中的一种或多种：
Figure FDA0002080976520000011
其中，
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为选自2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基以及C1-C10烷氧基；
R3为式A59所示结构的基团：
Figure FDA0002080976520000012
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为抑制HBV基因表达的寡核苷酸；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
Figure FDA0002080976520000021
表示基团共价连接的位点；
M1表示药学上可接受的靶向基团。
2.如权利要求1所述的联合用药物，其中，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.0004-200):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
可选的，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.001-100):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。
3.如权利要求1所述的联合用药物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26基团及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002080976520000031
Figure FDA0002080976520000041
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R'独立地为C1-C10烷基；
每个Ra选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002080976520000042
Figure FDA0002080976520000051
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure FDA0002080976520000052
表示基团共价连接的位点；
可选的，L1选自于由基团A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其连接组合所组成的组；
可选的，L1为基团A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；
可选的，L1为基团A1、A8和A10中至少2个的连接组合；
可选的，L1的长度为3-25个原子；
可选的，L1的长度为4-15个原子。
4.如权利要求3所述的联合用药物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R'为C1-C4烷基，Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，Rb为C1-C5烷基；
可选的，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R'为甲基、乙基和异丙基中的一种，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。
5.如权利要求1-4中任一项所述的联合用药物，其中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3；
可选的，每个m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数；
可选的，m1＝m2＝m3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的联合用药物，其中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体；
可选的，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖；
可选的，每个所述靶向基团独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种；
可选的，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
7.如权利要求1-6中任一项所述的联合用药物，其中，R10、R11、R12、R13、R14和R15独立地为H、甲基或乙基；可选的，R10、R11、R12、R13、R14和R15均为H。
8.如权利要求1-7中任一项所述的联合用药物，其中，R2上同时含有与含氮骨架上的N连接的连接位点和与R3中的P连接的连接位点；
可选的，R2上所述与含氮骨架上的N连接的位点与N形成酰胺键，所述与R3上的P连接的位点与P形成磷酸酯键；
可选的，R2选自B5、B6、B5'或B6'：
Figure FDA0002080976520000071
其中，
Figure FDA0002080976520000072
表示基团共价键连接的位点，q2为1-10的整数；
可选的，q2为1-5的整数。
9.如权利要求1-8中任一项所述的联合用药物，其中，式(1)所示的化合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
Figure FDA0002080976520000073
Figure FDA0002080976520000081
Figure FDA0002080976520000091
Figure FDA0002080976520000101
Figure FDA0002080976520000111
Figure FDA0002080976520000121
Figure FDA0002080976520000131
Figure FDA0002080976520000141
10.如权利要求1-9中任一项所述的联合用药物，其中，所述抑制HBV表达的寡核苷酸选自siRNA或反义核酸；
可选的，所述寡核苷酸为反义核酸，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的末端区域，所述反义核酸的末端区域指所述反义核酸中从其一端起算的前4个核苷酸；可选的，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的末端；可选的，式A59中的P原子连接到所述反义核酸的3'末端；
可选的，所述寡核苷酸为siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述式A59中的P原子连接到所述siRNA中正义链或反义链的末端区域，所述末端区域指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸；可选的，式A59中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的末端；可选的，式A59中的P原子连接到所述正义链的3'末端；
可选的，式A59中的P原子通过磷酸二酯键连接至所述寡核苷酸中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。
11.如权利要求10所述的联合用药物，其中，所述抑制HBV表达的寡核苷酸为siRNA，该siRNA中的每个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸；所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链互补区；所述核苷酸序列2与核苷酸序列A至少部分互补，所述核苷酸序列A为靶HBV mRNA中的一段核苷酸；
可选的，所述核苷酸序列1与所述核苷酸序列A长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列A'长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列A'为与所述核苷酸序列A完全反向互补的核苷酸序列；
可选的，所述核苷酸序列1与所述核苷酸序列A不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列A'不多于1个核苷酸差异；
可选的，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列A'之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异；
可选的，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上最后的核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸；
可选的，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选的，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4；所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端；所述核苷酸序列4与核苷酸序列B互补；所述核苷酸序列B是指靶HBV mRNA中与所述核苷酸序列A相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列；并且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选的，所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；
可选的，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'到3'的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与核苷酸序列C互补；所述核苷酸序列C指靶HBV mRNA中与所述核苷酸序列A或所述核苷酸序列B相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列；
可选的，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列：
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG-3'(SEQ ID NO:2)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Z'AGAAGAUGAGGCAUAGCA-3'(SEQ ID NO:4)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-UCUGUGCCUUCUCAUCUGZ-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Z'CAGAUGAGAAGGCACAGA-3'(SEQ ID NO:6)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-CGUGUGCACUUCGCUUCAZ-3'(SEQ ID NO:7)；
5'-Z'UGAAGCGAAGUGCACACG-3'(SEQ ID NO:8)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：
5'-GAAAGUAUGUCAACGAAUZ-3'(SEQ ID NO:9)；
5'-Z'AUUCGUUGACAUACUUUC-3'(SEQ ID NO:10)；
其中，所述Z'是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z选自A、U、G或C，并且Z'是与Z互补的核苷酸；
可选的，所述siRNA为表1中任意一种siRNA。
12.如权利要求11所述的联合用药物，其中，所述正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
可选的，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸；
可选的，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸存在于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；
可选的，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8和9位或者第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；
可选的，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种；
可选的，所述核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自于由以下所组成的组：2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸和2'-脱氧核苷酸(DNA)；所述核苷酸类似物选自于由以下所组成的组：异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA；
可选的，每一个非氟代修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，其中所述甲氧基修饰的核苷酸指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸；
可选的，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列1的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列2的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
可选的，所述siRNA为表2中任意一种siRNA。
13.如权利要求12所述的联合用药物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
可选的，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
Figure FDA0002080976520000181
可选的，所述siRNA中，硫代磷酸酯连接存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
可选的，所述siRNA为表3中任意一种siRNA。
14.如权利要求11-13中任一项所述的联合用药物，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸；
可选的，所述5'-磷酸核苷酸为具有如式(202)所示结构的核苷酸，所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸选自结构如式(203)-式(206)中任意一个所示的核苷酸：
Figure FDA0002080976520000191
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G和T的碱基；
可选的，所述siRNA为表4或表5中任意一种siRNA。
15.如权利要求1所述的联合用药物，其中，所述药物B选自聚合酶抑制剂或逆转录酶抑制剂中的一种或多种；
可选的，所述药物B选自于以下药物所组成的组中的任何一种或多种：拉米夫定、替比夫定、克来夫定、恩曲他滨、阿德福韦酯、替诺福韦(酯)、恩替卡韦或其药理活性衍生物。
16.如权利要求15所述的联合用药物，其中，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为恩替卡韦或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(1-100):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
或者，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为阿德福韦酯或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.05-5):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
或者，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替诺福韦或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.02-2):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
或者，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为拉米夫定或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.005-0.5):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
或者，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替诺福韦酯或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.002-0.2):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计；
或者，所述药物A为式(403)所示的化合物或其药理活性衍生物，所述药物B为替比夫定或其药理活性衍生物，所述药物A单次用药和所述药物B单次用药的重量比为(0.001-0.1):1，药物A单次用药的重量以寡核苷酸计。
17.如权利要求1-16中任一项所述的联合用药物在制备用于治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的药物中的用途；
可选的，所述疾病选自于由以下疾病所组成的组中的任何一种或多种：慢性肝病、肝炎、肝纤维化、肝增生性疾病。
18.一种抑制肝细胞中HBV基因表达的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1-16中任一项所述的联合用药物与感染HBV的肝细胞进行接触。
19.一种包含如权利要求1-16任一项所述的有效量的联合用药物以及说明其治疗和/或预防由HBV引起的病理状况或疾病的使用说明书的商品化包装。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015006740A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN107075516A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 经修饰的双链rna试剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015006740A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN107075516A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 经修饰的双链rna试剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONALD J. FOSTER等: "Advanced siRNA Designs Further Improve In Vivo Performance of GalNAc-siRNA Conjugates" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117534717A (zh) * 2024-01-09 2024-02-09 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法

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