CN111978291A - 一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针的制备和应用 - Google Patents

一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针的制备和应用，结构式如下所示：
Figure DDA0002470585470000011
本发明提供的荧光探针可用于一氧化碳的检测，探针对一氧化碳的识别基于分子内电荷转移机制，对不同浓度的一氧化碳在0～50μM范围呈现出良好的线性关系，灵敏度高，检测限可达37.2nM；选择性好，不受其它活性氧物种、活性氮物种、生物活性硫醇和常见阴阳离子的测定干扰；实验证明探针具有良好的生物相容性，具备线粒体靶向能力，实现了活细胞线粒体中内源性和外源性一氧化碳的成像，并监测到线粒体氧化应激下一氧化碳的产生。

Description

一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针的制备和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针领域，更具体的，涉及一种比率检测一氧化碳的荧光探针的制备和应用。
背景技术
生物体内的内源性一氧化碳主要是由血红素在血红素氧化酶的催化代谢下产生的。作为一种气体信号分子，一氧化碳在许多的生理或病理过程中扮演重要的角色。然而，一氧化碳的异常代谢与阿尔茨海默病、高血压、炎症和心力衰竭等许多疾病有关。同时，医学证明一氧化碳具有舒张血管、抗高血压、抗炎、抗氧化和细胞保护的功能。作为细胞内重要的呼吸场所，线粒体是一氧化碳分子的主要靶标，原因是:(1)血红素产生于线粒体膜内；(2)一氧化碳的生理作用依赖于线粒体活性氧信号。研究证明，一氧化碳可以通过竞争来抑制氧气和细胞色素c氧化酶结合，会破坏线粒体膜电位，减少三磷酸腺苷合成，诱导细胞死亡。因此，实现对线粒体中一氧化碳的定量检测对于揭示一氧化碳生理意义和细胞代谢具有重要意义。
传统的方法如比色检测、电化学和气相色谱等，虽然能够实现对一氧化碳的检测，但是不能够对生物体内一氧化碳进行实时、原位的检测。荧光探针方法由于其高灵敏和高选择性，可以实现生物体内活性物种实时、原位的可视化成像成为对检测生物体内目标活性物种的一个有力的工具。目前报道的大多数一氧化碳荧光探针无法实现线粒体的定位，虽然已经有两篇工作实现了线粒体中一氧化碳的成像和检测，但信号响应都是“off-on”型，容易受到激发光光源、探针浓度聚集、pH和黏度等微环境的干扰。因此，设计比率的一氧化碳荧光探针对于定量检测具有更加准确和可靠的结果。同时，目前报道的一氧化碳荧光探针还没有实现对线粒体氧化应激下一氧化碳的变化的监测。为了解决这一难题，本发明提供了一种基于分子内电荷转移发光机制的，高灵敏度和选择性的，比率检测一氧化碳的，用于氧化应激下细胞线粒体中一氧化碳变化的可视化分析的荧光探针的制备和应用。
发明内容
1.本发明的一个目的在于提供一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针，其特征在于，结构式如下所示：
Figure RE-GDA0002694470170000021
具有上述结构式的一氧化碳荧光探针通过下述方法制备得到，步骤如下：
将4-烯丙基醚-N-2-氨基乙基吡啶-1，8-萘酰亚胺和碘甲烷溶于甲苯中，混合物在加热搅拌下，反应得到目标探针。
制备步骤中，所述反应生成目标探针时其反应条件为105～125℃下回流反应 8～10个小时。
制备步骤中，所述反应得到目标探针其反应结束后将反应物冷却至室温析出沉淀，过滤，真空干燥，所得产物即为目标探针。
制备步骤中，所述的4-烯丙基醚-N-2-氨基乙基吡啶-1，8-萘酰亚胺和碘甲烷的用量摩尔比为1：(3～5)。
2.本发明的另一个目的在于提供一种一氧化碳荧光探针在氧化应激下细胞线粒体中一氧化碳变化的可视化检测的应用。
有益效果
本发明提供的一氧化碳荧光探针具有以下显著的特征：
1)探针和Pd(Ⅱ)混合体系在磷酸盐缓冲溶液中发射蓝色荧光；探针和Pd(Ⅱ)混合体系识别一氧化碳后，在磷酸盐缓冲溶液中发射绿色荧光；
2)探针对一氧化碳的灵敏度高，且荧光强度比值与一氧化碳的浓度具有良好的线性关系；
3)探针的选择性好，对其他常见的活性氧物种、活性氮物种、生物硫醇物种和常见阴阳离子几乎不响应；同时对一氧化碳的检测不受这类物质的干扰；
4)探针和商业线粒体红色染料的细胞共定位实验结果说明，探针可以特异性靶向到细胞的线粒体；
5)探针可以对氧化应激下细胞线粒体中一氧化碳的变化实现可视化成像分析；
6)探针的合成方法简便，产品易得。
附图说明
图1为制备的荧光探针对一氧化碳的比率响应示意图和线粒体中一氧化碳细胞成像图。
图2(A)为制备的荧光探针和Pd(Ⅱ)对不同浓度一氧化碳的荧光响应谱图。图 2(B)为两个最大发射波长处荧光强度比值对0-50μM一氧化碳的线性关系拟合结果。探针的浓度为10μM，Pd(Ⅱ)浓度为10μM,一氧化碳(CORM-3)的浓度为 0-50μM，检测体系为二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝7.4)的混合溶液，体积比为1:9，激发波长为430nm。
图3为制备的荧光探针和Pd(Ⅱ)对各种常见的活性氧、活性氮、生物硫醇和阴阳离子的荧光强度比值响应结果。探针的浓度为10μM，Pd(Ⅱ)浓度为10μM，谷胱甘肽的浓度为1mM，其他物质的浓度为50μM。
图4为荧光探针和商业红色线粒体染料的共定位实验图。(A)5μM荧光探针的蓝色通道，激发波长405nm，发射范围420-490nm；(B)100nM商业红色线粒体染料的红色通道，激发波长543nm,发射范围580-680nm；(C)明场成像；(D)叠加成像图片(E)蓝色和红色荧光强度散点图。(F)两个通道内特定区域的荧光强度。标尺10μm。
图5为荧光探针对HepG2细胞线粒体氧化应激下一氧化碳变化的可视化荧光成像。A为用10μM探针和10μM Pd(Ⅱ)孵育30min的细胞成像；B为先将细胞用20ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激后，再加入10μM探针和10μM Pd(Ⅱ)孵育30min的细胞成像；C为先将细胞用1μg/mL脂多糖(LPS) 刺激后，再加入10μM探针和10μM Pd(Ⅱ)孵育30min的细胞成像；D为细胞成像的荧光强度统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但不限于此。
实施例1
荧光探针的合成
将4-烯丙基醚-N-2-氨基乙基吡啶-1，8-萘酰亚胺(215mg,0.6mmol)溶于到25mL甲苯中，充分溶解，再向上述溶液中加入碘甲烷(150μL,2.4mmol)。混合物110℃加热搅拌，回流过夜10小时，冷却至室温，析出沉淀，过滤，真空干燥，得到目标探针(57％)。表征结果如下：HRMS(ESI):m/z[M]+理论值为373.1547,测试得到373.1546。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.04-9.05(d,1H),8.60-8.62 (q,1H),8.46-8.49(q,1H),8.40-8.42(m,2H),7.94-8.00(t,2H),7.83-7.87(q,1H), 7.33-7.36(d,1H),6.16-6.26(m,1H),5.55-5.60(q,1H),5.38-5.41(q,1H),4.95-4.97 (d,2H),4.47(s,1H),4.46(s,3H),4.44(s,1H),3.49-3.53(t,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):δ＝163.12,162.42,158.81,154.82,146.26,144.58,132.81, 131.92,130.67,128.42,128.16,128.10,125.97,125.30,122.36,121.09,117.70, 113.41,106.82,68.81,44.75,36.39,30.59。
实施例2
探针对一氧化碳的荧光滴定实验
将10μM探针和Pd(Ⅱ)加入到二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液(v/v＝1:9，pH＝7.4)的混合体系中，再加入一氧化碳(CORM-3)，使得其浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、 0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40和50μM，反应时间结束后测定各个浓度下的荧光强度，绘制结果如图2(A)所示。随着一氧化碳浓度的增加，探针在466nm处的荧光强度逐渐降低，556nm处的荧光强度逐渐增强，表现出对一氧化碳比率响应的信号模式。经计算得出检出限为37.2 nM。
实施例3
荧光探针对一氧化碳的选择性实验
将10μM探针和Pd(Ⅱ)分别加入50μM一氧化碳和其他活性分析干扰物(其中，谷胱甘肽浓度为1mM，其余物质的浓度为50μM)的体系中，检测体系为二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液(v/v＝1:9，pH＝7.4)混合体系，测定不同反应体系的荧光强度，计算荧光强度比值，结果如图3所示。由图可知，探针仅对一氧化碳有响应，并且在其他活性物质存在下依然对一氧化碳具有很好的响应，实验结果说明探针对一氧化碳具有高的选择性和抗干扰能力。
实施例4
探针的线粒体共定位实验
将100nM商业线粒体红色染料与5μM探针同时加入HepG2细胞中孵育15min 后，用PBS缓冲液清洗三次后，用OLYMPUS FV-1000共聚焦显微镜进行荧光成像。探针的激发光选取405nm，发射范围选取420-490nm；线粒体红色染料的激发光选取543nm，发射580-680nm。实验结果如图4所示，结果表明，探针和线粒体红色染料共定位皮尔森系数为0.9723，具有很好靶向线粒体的能力。
实施例5
氧化应激下细胞线粒体中一氧化碳的可视化分析
HepG2细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100μg/mL青霉素-链霉素培养基中培养，培养条件为37℃，5％CO2。HepG2细胞分别预先用20ng/mL佛波酯(PMA)37℃下孵育2小时和1μg/mL G-脂多糖(LPS)37℃下孵育4小时，然后用PBS缓冲液洗涤三次，并加入新的培养基，孵育10μM探针和10μM Pd(Ⅱ) 30分钟后，PBS缓冲液洗涤三次进行共聚焦荧光成像。结果如图5所示。由图 4A可知，正常细胞状态下，细胞成像中蓝色荧光强度很强，绿色荧光很微弱。当细胞受到脂多糖(LPS)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激后(图4B和4C)，细胞线粒体处于氧化应激环境下，细胞的蓝色荧光强度降低，绿色荧光强度显著增强。表明探针可用于氧化应激下线粒体中一氧化碳的可视化成像分析，并且线粒体中会产生一定的一氧化碳用于发挥一氧化碳的抗氧化和细胞保护作用。

Claims (8)

1.一种线粒体靶向比率检测一氧化碳荧光探针，结构式如下所示：
Figure FDA0002470585440000011
2.根据权利要求1所述的一氧化碳荧光探针，其特征在于：探针可以实现对一氧化碳的比率荧光信号响应，同时探针可以精确靶向细胞中的线粒体。
3.根据权利要求2所述的线粒体靶向比率一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将4-烯丙基醚-N-2-氨基乙基吡啶-1，8-萘酰亚胺和碘甲烷溶于甲苯中，加热搅拌，得到目标探针。
4.根据权利要求3所述的一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的反应生成目标探针时其反应条件为105～125℃下加热回流8～10小时。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的反应得到目标探针，其反应结束，冷却至室温，析出沉淀，过滤，真空干燥，所得产物即为目标探针。
6.根据权利要求3所述的一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的4-烯丙基醚-N-2-氨基乙基吡啶-1，8-萘酰亚胺和碘甲烷的投料用量摩尔比为1：(3～5)。
7.根据权利要求1或2所述的一氧化碳荧光探针在检测一氧化碳中的应用，其特征在于，所述的一氧化碳荧光探针具有对一氧化碳比率荧光信号的响应模式。
8.根据权利要求1或2所述的一氧化碳荧光探针在检测一氧化碳中的应用，其特征在于，所述的一氧化碳荧光探针可以特异性靶向到细胞的线粒体，同时对线粒体氧化应激下一氧化碳内源性的产生实现可视化细胞成像。
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