CN111973730A - BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或其并发症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用。所述的药物的剂型为口服型。所述的口服剂型为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、药丸、糖浆或柠檬水剂。本发明实施例所公开的应用，通过对T1DM小鼠进行BefA蛋白口服治疗可缓解其高血糖及体重降低症状；口服BefA蛋白可显著降低TLR‑4/NF‑κB这一致糖尿病炎性信号通路在T1DM小鼠胰腺中的表达；BefA蛋白发挥浓度依赖性的抑制胰岛细胞坏死、促进胰岛β细胞分化增殖的作用。

Description

BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或其并发症药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一类以血糖持续升高为特征的代谢性疾病，临床上依据其对胰岛素依赖与否可分为I型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）和II型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）。糖尿病晚期可出现多器官损伤如糖尿病足、眼疾、肾病及心肌病等。糖尿病的治疗根据其类型不同、是否伴有并发症等而不同。一般地，I型糖尿病需要长期给予胰岛素医治，II型糖尿病的防治是在调节饮食结构的基础上，通过对促进胰岛素分泌或增强胰岛素敏感性或延迟食物吸收等进行药物单用或联合应用，严重者也可给予胰岛素治疗。因此，研发可以有效防治糖尿病的新型药物具有重大意义。
目前糖尿病的治疗主要集中在多种降血糖药和胰岛素治疗，但均存在严重的毒副作用，且均不能有效预防并发症的发生。现有技术中也存在一些蛋白物质是针对糖尿病的。
如CN200810226190.3公开了一种预防和/或治疗免疫相关疾病的T细胞组分疫苗。它的活性成分是下述蛋白质或多肽中的至少一种：1)至少含有自GenBank AccessionNumber AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的由calreticulin蛋白缺失得到的多肽；2)至少含有自GenBank Access ion Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的由ERp57蛋白缺失得到的多肽；3)vimentin蛋白；4)calreticulin蛋白；5)ERp57蛋白。该疫苗可用于预防和/或治疗I型糖尿病。
又如CN201510158006.6 公开一种以乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)为载体的抗I型糖尿病疫苗及其制备方法和应用。利用本实验室的微基因技术平台，构建了一种以乳酸乳球菌为载体，经诱导后表达融合蛋白HSP65-6IA2P2的重组乳酸乳球菌疫苗。通过Westernblot鉴定检测融合蛋白疫苗的正确表达。
但上述均为疫苗，现有技术中用于治疗I型糖尿病的蛋白报道并不明朗。
发明内容
本发明的目的是提供一种BefA蛋白（BefA表达载体）在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
通过进一步实验研究，我们首先构建了原核BefA表达载体，利用大肠杆菌BL21系统进行蛋白表达与提纯，进而获得较高纯度的BefA重组蛋白。
通过一种BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用。
进一步，上述的应用中，所述I型糖尿病或I型糖尿病并发症为胰腺组织炎症。
进一步，上述的应用中，所述BefA蛋白降低胰腺组织炎症信号通路蛋白及炎性因子表达。
进一步，上述的应用中，所述BefA蛋白降低TLR-4/NF-κB在T1DM动物模型中的表达。
进一步，上述的应用中，所述I型糖尿病或I型糖尿病并发症为β细胞受自身免疫异常疾病。
进一步，上述的应用中，所述BefA蛋白对抑制胰岛细胞坏死具有浓度依赖性特点。
进一步，上述的应用中，所述BefA蛋白促进胰岛β细胞分化增殖。
进一步，上述的应用中，所述BefA蛋白能浓度依赖性地促进β细胞分泌胰岛素。
进一步，上述的应用中，所述的药物的剂型为口服型。
进一步，上述的应用中，所述的口服剂型为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、药丸、糖浆或柠檬水剂。
进一步，一种BefA蛋白对糖尿病治疗作用的动物模型建立方法，包括如下步骤：
8周龄雄性C57BL/6鼠，分组为正常对照组、T1DM模型组、低浓度BefA蛋白治疗组10组、高浓度BefA蛋白治疗组50组，每组15只；
适应性喂养一周后分别称量体重，正常对照组给予腹腔注射生理盐水做对照处理，T1DM模型组、低浓度BefA蛋白治疗组10组、高浓度BefA蛋白治疗组50组连续五天腹腔注射链脲佐菌素造T1DM模型所述的链脲佐菌素的注射剂量为50mg/kg/d，造模前禁食12 h；注射完成后给予正常饮食饮水饲养，每隔三天测定小鼠空腹血糖，当血糖浓度在11.1 mM及以上并稳定后，造模成功；
治疗中以包被液重悬蛋白，所述的包被液位质量浓度为0.9％的生理盐水配制的质量浓度为0.01％的明胶，口服给药；治疗方式：正常对照组和T1DM模型组给予包被液灌胃处理，低浓度BefA蛋白治疗组10组和高浓度BefA蛋白治疗组50组分别10 μg BefA/只和50 μgBefA/只灌胃处理，均为隔天给药。
进一步，所述的检测包括降糖表型数据检测、蛋白表达及炎症因子转录水平检测、组织病理检测和肠道菌群分析。
本发明具有如下有益效果：
1）本发明实施例所公开的应用，通过对T1DM小鼠进行BefA蛋白口服治疗可缓解其高血糖及体重降低症状；
2）口服BefA蛋白可显著降低TLR-4/NF-κB这一致糖尿病炎性信号通路在T1DM小鼠胰腺中的表达；
3）BefA蛋白发挥浓度依赖性的抑制胰岛细胞坏死、促进胰岛β细胞分化增殖的作用；
4）在T1DM小鼠模型中，BefA蛋白的摄入可保护胰腺及胰岛的健康形态，同时可浓度依赖性地促进β细胞分泌可唯一降低血糖的激素——胰岛素。
附图说明
图1为本发明一实施例中 BefA蛋白对T1DM小鼠血糖及体重的影响中不同处理组小鼠血糖结果。
图2为本发明一实施例中 BefA蛋白对T1DM小鼠血糖及体重的影响中不同处理组小鼠体重结果。
图1和图2实验分组：C：正常对照组；M：T1DM模型组；MB 10：低浓度BefA蛋白治疗组（10 μg BefA/只）；MB 50：高浓度BefA蛋白治疗组（50 μg BefA/只）。*表示与C组相比有显著性差异，p﹤0.05；##表示与M组相比有显著性差异，p﹤0.01。
图3为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺炎症通路蛋白和促炎因子表达的抑制作用中Western-blot检测胰腺TLR-4/NF-κB炎症信号通路蛋白的表达。
图4为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺炎症通路蛋白和促炎因子表达的抑制作用中q-PCR检测胰腺组织中促炎因子IL-1β的转录水平。
图5为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺炎症通路蛋白和促炎因子表达的抑制作用中q-PCR检测胰腺组织中促炎因子TNF-α的转录水平。
图3-图5实验分组：C：正常对照组；M：T1DM模型组；MB 10：低浓度BefA蛋白治疗组（10 μg BefA/只）；MB 50：高浓度BefA蛋白治疗组（50 μg BefA/只）。*表示有显著性差异，p﹤0.05；**表示有显著性差异，p﹤0.01。
图 6为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺增殖及凋亡的作用中Western-blot检测胰腺组织中Bax/Bcl-2凋亡信号通路蛋白的表达。
图7为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺增殖及凋亡的作用中q-PCR检测胰腺组织中PDX-1蛋白的表达。
图8为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺增殖及凋亡的作用中免疫组化（200×）检测胰腺组织中PDX-1蛋白的表达。
图6-8实验分组：C：正常对照组；M：T1DM模型组；MB 10：低浓度BefA蛋白治疗组（10μg BefA/只）；MB 50：高浓度BefA蛋白治疗组（50 μg BefA/只）。*表示有显著性差异，p﹤0.05；**表示有显著性差异，p﹤0.01。
图 9为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺形态及功能的保护作用中 HE染色检测胰腺组织病理损伤程度（100×）。
图10为BefA蛋白对T1DM小鼠胰腺形态及功能的保护作用中免疫荧光（400×）检测胰腺中胰岛素的分泌情况。
图9和图10实验分组：C：正常对照组；M：T1DM模型组；MB 10：低浓度BefA蛋白治疗组（10 μg BefA/只）；MB 50：高浓度BefA蛋白治疗组（50 μg BefA/只）。
图 11为通过高通量测序分析BefA蛋白对T1DM小鼠肠道菌群的影响中 Venn图。
图12为通过高通量测序分析BefA蛋白对T1DM小鼠肠道菌群的影响中PCoA分析。
图13为通过高通量测序分析BefA蛋白对T1DM小鼠肠道菌群的影响中LDA分析。
图11-13实验分组：C：正常对照组；M：T1DM模型组；MB 10：低浓度BefA蛋白治疗组（10 μg BefA/只）；MB 50：高浓度BefA蛋白治疗组（50 μg BefA/只）。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
一种BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用，包括如下步骤：
首先，构建一种T1DM动物模型：
8周龄雄性C57BL/6鼠，分组为正常对照组、T1DM模型组、低浓度BefA蛋白治疗组10组、高浓度BefA蛋白治疗组50组，每组15只；
适应性喂养一周后分别称量体重，正常对照组给予腹腔注射生理盐水做对照处理，T1DM模型组、低浓度BefA蛋白治疗组10组、高浓度BefA蛋白治疗组50组连续五天腹腔注射链脲佐菌素造T1DM模型所述的链脲佐菌素的注射剂量为50mg/kg/d，造模前禁食12 h；注射完成后给予正常饮食饮水饲养，每隔三天测定小鼠空腹血糖，当血糖浓度在11.1 mM及以上并稳定后，造模成功；
治疗中以包被液重悬蛋白，所述的包被液位质量浓度为0.9％的生理盐水配制的质量浓度为0.01％的明胶，口服给药；治疗方式：正常对照组和T1DM模型组给予包被液灌胃处理，低浓度BefA蛋白治疗组10组和高浓度BefA蛋白治疗组50组分别10 μgBefA/只和50 μgBefA/只灌胃处理，均为隔天给药。
我们首先构建了原核BefA表达载体，利用大肠杆菌BL21系统进行蛋白表达与提纯，进而获得较高纯度的BefA重组蛋白，并通过灌胃给药方式观察了该重组蛋白对小鼠I型和II型糖尿病模型的治疗效果。结果表明，口服BefA蛋白可以浓度依赖性的方式降低糖尿病小鼠的血糖、抑制组织炎症、促进胰岛β细胞增殖及胰岛素的分泌。同时，该蛋白对小鼠肠道菌群发挥积极调节作用。
BefA（Beta cell expansion factor A）是一种由人体肠道细菌产生的蛋白，发明人研究显示该蛋白（BefA表达载体）具有促进胰岛β细胞增殖的作用，提示其可能具有潜在的治疗糖尿病的巨大应用价值。
本申请的BefA蛋白的制备方法步骤如下：
一）pET 28C-BefA表达载体的构建及蛋白表达
根据文献报道获得BefA基因序列进行优化设计，并在蛋白序列N端添加组氨酸（His）标签以利于后期蛋白的分离和纯化。随后交由南京金斯瑞公司进行合成，同时该公司将BefA基因序列转入pET 28C质粒中获得原核细胞表达载体pET 28C-BefA。然后进行BefA蛋白的诱导表达：
（1）取大肠杆菌BL21感受态100 μL，冰上溶解；加入2 μL重组质粒（浓度不低于200 ng/μL)，摇匀，放在冰上处理30 min；
（2）42 oC热击90 s，然后快速置于冰上静置2 min；加入900 μL LB液体培养基，37 oC振荡培养1 h。4000 rpm离心1 min。弃上清后轻轻吹打底部菌体；
（3）取上述菌液50 μL涂布于含卡那霉素的筛选平板上，37 oC培养16-24 h；
（4）挑取单克隆进行菌落PCR及1%琼脂糖凝胶电泳，验证BefA蛋白的表达；
（5）配置200 mL LB培养液，静置冷却后加入200 μL卡那霉素，加入1 mL BL21-pET28C-BefA菌液于37 oC摇床过夜培养；
（6）将上述菌液按1%的比例加入3 L LB（含卡纳霉素）培养基中，37 oC，160 rpm培养；2h后开始测定培养液菌体OD值，待OD为0.6时加入IPTG（浓度为1M）继续置于160 rpm的摇床，温度设置为30 oC；
（7）连续诱导6-8 h后离心收集细菌，-70 oC保存备用。
注：分别在加入IPTG诱导前后取诱导前菌体和诱导后菌体各1 mL备用。
二）BefA蛋白的纯化
（1）EQ buffer、wash buffer、elution buffer的配制；
（2）用30 mL EQ 缓冲液重新悬起菌体，超声仪破碎至液体较为清亮。离心（10000 rpm，10 min，4 oC），留上清；保留裂解液上清和沉淀样本各1 mL备用；
（3）镍珠悬液的制备：吸取His-tag镍珠2 mL，悬浮于10 mL EQ buffer中，离心（4000rpm，15 min），收集沉淀，重复一次，收集2 ml沉淀即为镍珠悬液；
（4）将镍珠悬液加入裂解液上清中于4 oC条件下混匀旋转 2 h，离心（4 oC，4000 rpm，15 min），收集沉淀悬浮于10 mL wash buffer中；并在旋转混匀仪上常温旋转10 min后离心（4000 rpm，15 min），以wash buffer重悬沉淀，重复三次；
（5）将上述沉淀物悬浮于1.5 mL elution buffer中，在旋转仪上常温旋转15 min，离心（4000 rpm，15 min）收集上清，重复三次；
（6）合并所有上清，13000 rpm，4 oC，离心30-60 min后装入14 kD的蛋白透析袋，在1×磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）中于4 oC摇床上透析3 h。透析后换液，连续三次，最后用25 %体积浓度的甘油水溶液透析3 h，即得到纯化蛋白。以1 mL/支进行分装，封存于超低温冰箱中。
三）蛋白纯度检测
（1）配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝胶；
（2）样品处理：需要电泳的样品分别为诱导前菌体、诱导后菌体、裂解液上清、裂解液沉淀、上清纯化后蛋白。在样品中添加SDS-PAGE蛋白上样buffer于沸水中处理3-5 min，以充分变性蛋白；
（3）上样与电泳：静置样品至温度降低至RT后，加入SDS-PAGE胶上样孔内；上层胶低压约80 V电泳，下层胶高电压约100 V电泳；
（4）电泳结束后以考马斯亮蓝染液覆盖胶面，置于摇床上常温慢速孵育30 min；
（5）将染色后的胶块取出，以脱色液覆盖胶面，置于摇床上常温洗涤15 min，倒掉液体再换成新的脱色液，重复洗涤3次；拍照分析蛋白纯度。
四）验证目的蛋白条带位置
（1）按照2.3上样、电泳完成后拿下胶块进行转膜。选用聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF），湿转，条件为110 V恒压转膜70 min；
（2）封闭：转膜完毕后，加入封闭液（5%脱脂乳），室温下在摇床上缓慢摇动，封闭90min；
（3）一抗孵育：参照一抗说明书，按中间比例用1%脱脂乳或1% 牛血清白蛋白（Albuminfrom bovine serum，BSA）配制一抗。TBST缓冲液（Tris buffered saline tween）洗涤一次，加入一抗，4 oC在摇床上缓慢摇动，孵育过夜。回收一抗，TBST洗涤3次（5-10 min/次）；
（4）二抗孵育：参照二抗的说明书，按适当比例用1%脱脂乳或1% BSA配制辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗。TBST洗3次后（5-10 min/次），加入二抗，室温在摇床上缓慢摇动孵育1 h。TBST洗涤3次（5-10 min/次）；
（5）蛋白检测：曝光液避光混合，现配现用，进行显色分析。
五）蛋白浓度检测
样本为诱导前菌体、诱导后菌体、裂解液上清、裂解液沉淀、上清纯化后蛋白共五组。实验步骤参照CST公司BCA蛋白检测试剂盒说明书。
进一步的，进行降糖表型数据检测、蛋白表达及炎症因子转录水平检测、组织病理检测和肠道菌群分析。
降糖表型数据检测
（1）血糖体重、粪便收集：每周取血检测血糖、同时记录体重。分别在造模成功后、治疗中每周同一时间、血糖降低节点无菌收集每只老鼠粪便3-4粒，用于荧光定量分析和高通量分析；
（2）进食与进水量：统计每只小鼠每周进食与进水量。判断T1DM的多饮、多食症状有无缓解；
（3）脏器收集：解剖后取胰腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠道等器官，置于液氮或多聚甲醛中保存。
蛋白表达及炎症因子转录水平检测
胰腺组织总蛋白的提取
（1）组织用含苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，1 mM）的无菌去离子水冲洗数次后放置于匀浆器中，加入适量裂解液缓冲液（Radio immunoprecipitationassay，RIPA）和蛋白酶抑制剂（按50 mg标本用1 mL裂解缓冲液），冰水混合浴中充分匀浆；
（2）将裂解产生的蛋白溶液全部转移至新的EP管中，漩涡震荡10 s，将EP管置于冰上放置5 min，此过程重复3-4次；
（3）4 oC，13000 rpm离心10 min；取上清至全新的EP管中，-80 oC冰箱保存，上清即为胰腺组织总蛋白。
蛋白质免疫印迹
在样品中加入上样buffer，沸水处理10 min；配制SDS-PAGE凝胶，把蛋白样品上样到凝胶加样孔内；开始电泳，先选择低压恒压电泳（60 V）至胶面平齐，再转为高电压恒压电泳（80 V），电泳时间依据蛋白分子量大小而定；选用PVDF膜进行转膜，一般条件为110 V恒压转膜70 min；
转膜完毕后，加入封闭液（5％脱脂乳或5％BSA），室温下在摇床上缓慢摇动，封闭90min；参照一抗说明书，用1％脱脂乳或1％BSA配制一抗，慢速摇动4 oC过夜孵育一抗；回收一抗后，TBST洗涤3次（5-10 min/次）；参照二抗说明书，按适当比例用1％脱脂乳或1％BSA配制HRP标记的二抗，加入二抗，室温孵育1 h。TBST洗涤3次（5-10 min/次）；蛋白检测时曝光液避光混合，显色分析。
q-PCR
从各组中称取相同重量的动物组织，加入Trizol，匀浆离心后保留上清；加入氯仿充分振荡混匀后保留离心上清；加入异丙醇充分振荡后保留离心沉淀；加入75％乙醇，充分洗涤后，离心去上清；加入无水乙醇，充分洗涤后，离心去上清；室温晾干，加入RNase FreeWater，55 oC水浴锅中促进RNA溶解；测定RNA浓度；按表1去除基因组DNA，按表2进行逆转录，按表3完成q-PCR。
表1去除基因组DNA
试剂 加入量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0 µL
gDNA Eraser 1.0 µL
Total RNA 1.0 µg
RNase-free dH<sub>2</sub>O up to 10.0 µL
表2逆转录反应
试剂 加入量
步骤 1 的反应液 10.0 µL
5×PrimeScript Buffer 2 4.0 µL
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 µL
RT Primer Mix 1.0 µL
RNase Free dH<sub>2</sub>O 4.0 µL
Step 1：37 oC，15 min；Step 2：85 oC，5 s；Step 3：4 oC。
mRNA逆转录为cDNA后，用无核酶水进行3倍稀释，立即使用。
表3 q-PCR反应体系
试剂 加入量
SYBR Premix Ex Taq<sup>TM</sup> 10.0 µL
PCR Forwar Primer（10 µM） 0.8 µL
PCR Reverse Primer（10 µM） 0.8 µL
ROX Reference Dye 0.4 µL
ddH<sub>2</sub>O 6.0 µL
cDNA模板 2.0 µL
每孔总反应体系为20.0 μL。
组织病理检测
苏木精伊红染色（Hematoxylin-eosin staining，HE染色）
（1）脱水。将由多聚甲醛固定好的小鼠胰腺组织取出，用PBS冲洗后分别用70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，95％乙醇各脱水180 min；之后用100％乙醇Ⅰ脱水60 min，100％乙醇Ⅱ脱水60 min；
（2）二甲苯透明。二甲苯I 10 min，二甲苯II 10 min；
（3）浸蜡与包埋。经二甲苯处理后的脱水组织，采用56-58 oC石蜡进行包埋，蜡的溶点应适应被包埋组织硬度；
（4）切片和封片。切片厚度为5 μm，连续切片。在展片机水槽中将蜡片展平。用吸水纸吸干周围水珠后放置在烤片机上（60 oC）处理4 h；
（5）切片脱蜡。分别用二甲苯I、II脱蜡10 min，然后用无水乙醇I、II处理3-5 min，之后用浓度递减的乙醇溶液，95％乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇处理3-5 min，自来水冲洗2 min；
（6）染色。苏木素处理5-10 min，流水洗涤1 min，1％的盐酸酒精处理几秒，流水洗涤，0.6％氨水返蓝，流水洗涤，伊红处理3-5 min，流水洗涤1 min；
（7）脱水、透明、封固。分别用浓度递增的乙醇溶液，70％乙醇、80％乙醇处理10-20 s，95％乙醇I、II处理3-5 min，100％乙醇I、II处理3-5 min，分别在二甲苯I、II、III中透明3-5 min。中性树胶封片；
（8）观察。将封片置于显微镜下拍照，并做病理生理学分析。
免疫组化
（1）同HE染色常规脱蜡，脱水处理；
（2）用3％新鲜配置的H2O2溶液室温处理5-10 min，用PBS冲洗3次；
（3）抗原修复。将切片浸入0.01 moL/L pH = 6.0枸橼酸盐缓冲液中，加热至沸腾后自然冷却5-10 min后，重复此操作1-2次，冷却后用pH=7.2-7.6的PBS洗涤2-3次；
（4）在室温条件下用5％小牛血清封闭切片20 min，除去多余的液体；
（5）加一抗50 μL，4 oC过夜，37 oC复温45 min，PBS洗涤3次，5 min/次；加二抗50 μL，37 oC共同处理1 h，PBS洗3次，5 min/次；
（6）DAB显色5-10 min，显微镜下观察显色程度；
（7）显色完毕后用去离子水充分洗涤以终止反应；
（8）苏木精复染1 min，自来水洗涤10 min，脱水、透明、封片，拍照观察，并作病理生理学分析。
免疫荧光
（1）石蜡切片经脱蜡、酒精梯度脱水后进行抗原修复，以0.01 M PBST漂洗3次，每次5min。在37 oC环境下置于2% BSA中封闭30 min；
（2）在玻片上滴加荧光标记抗体，加盖，37 oC环境下静止30 min-45 min；PBS洗涤3次，3 min/次，再以水冲洗、晾干；
（3）加甘油缓冲液，封片、避光镜检。
肠道菌群分析
肠道微生物DNA基因组的提取
（1）无菌收集粪便约100 mg加入3 mL PBS用枪吹打，室温放置10 min保留上清；向粪渣中再加入3 mL PBS用枪吹打混匀，静置取上清；
（2）合并上清，600 rpm离心3 min取上清，若上清仍然浑浊则继续离心一次，收集上清；
（3）后续步骤按照北京天根的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。
q-PCR检测肠道菌群变化
利用提取得到的粪便微生物基因组DNA为模板，进行q-PCR检测，数据分析采用2-△△Ct的方法。
粪便菌群高通量测序分析
将提取的肠道（粪便）微生物基因组DNA，送至北京诺禾致源公司进行16S rRNA测序。以提取的基因组DNA为模板，扩增16S rRNA基因的V3-V4区，引物为338F/806R，进行文库构建和上机测序。基于有效数据进行OTUs（Operational taxonomic units）聚类和物种分类分析，再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析。最后，可以进行基于OTUs的聚类分析，挖掘样品之间的物种组成结构差异。
检测结果：
血糖及体重
为评价BefA蛋白在哺乳动物DM模型中的治疗作用，我们以STZ腹腔注射的方式建立了T1DM小鼠模型。如图1所示，由STZ处理的各组小鼠（M组、MB 10组、MB 50组）在前3周内，血糖保持稳定持续上升，且在第3周时，均达到12mM以上，符合T1DM的成模标准即开始灌胃治疗。治疗1周后，BefA蛋白组血糖约下降了25%，显著低于M组（p﹤0.01）。在整个治疗周期中BefA蛋白组血糖水平均显著低于M组且降糖疗效呈现浓度依赖性：相对于MB 10组，MB 50组血糖更低且趋近于C组。T1DM典型症状之一为体重降低，如图2所示，正常情况下生长期小鼠随着发育的进程逐渐增重（C组），而经STZ处理的其它各组小鼠未见正常增重，证明T1DM造模成功。相比于M组，MB 10组和MB 50组小鼠的体重无显著增高，表现出持续高于M组的趋势。同时，这种趋势也呈现出浓度依赖性：MB 50组体重高于MB 10组。上述结果表明，对T1DM小鼠进行BefA蛋白口服治疗可缓解其高血糖及体重降低症状。该实验为揭示相关机制提供了最基本的数据支持。
胰腺组织炎症信号通路蛋白及炎性因子表达
为了更深入地探讨BefA蛋白降血糖的机制，我们对炎症相关蛋白进行表达量检测。如图3 Western-blot结果所示，与M组相比，BefA蛋白灌胃治疗（MB 10组和MB 50组）可降低小鼠胰腺组织中炎症相关蛋白TLR-4的表达及NF-κB蛋白的磷酸化水平，且MB 50组的抗炎效果更为显著（p﹤0.05）。如图4和图5的q-PCR结果所示，相比于M组，MB 10组和MB 50组小鼠胰腺中的促炎因子IL-1β和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的转录水平有效降低，且呈现浓度依赖性。以上结果表明，口服BefA蛋白可显著降低TLR-4/NF-κB这一致糖尿病炎性信号通路在T1DM小鼠胰腺中的表达。
胰腺组织凋亡与增殖信号通路蛋白表达
T1DM小鼠胰岛β细胞受自身免疫异常攻击而发生不可逆的破坏。在图6-8中，我们检测了胰腺组织中凋亡及增殖的关键蛋白。Bax（Bcl-2-associated X protein）蛋白和Bcl-2（Bcell lymphoma-2）蛋白分别作为细胞凋亡的启动子和抑制剂，Bax/Bcl-2的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。胰腺/十二指肠同源盒因子-1（Pancreas/duodenum homeobox protein-1，PDX-1）蛋白可促进胰岛β细胞分化、成熟和增殖。如图6的Western-blot结果所示，M组Bax/Bcl-2水平显著高于其它三组（p﹤0.01），说明T1DM小鼠胰腺已出现明显的细胞死亡现象。相对于M组，该比值在MB 10组和MB 50组中均显著降低，其中MB 50组数值约降低至M组的30%（p﹤0.01）。如图7和图8针对PDX-1蛋白的q-PCR和免疫组化结果所示，M组小鼠胰腺β细胞增殖水平受到抑制，经BefA蛋白治疗后，PDX-1的表达水平显著提高（p﹤0.01）。值得注意的是，PDX-1蛋白在MB 50组的表达水平显著高于MB 10组（p﹤0.01）。以上结果说明BefA蛋白发挥浓度依赖性的抑制胰岛细胞坏死、促进胰岛β细胞分化增殖的作用。
胰腺组织病理染色
如图9中T1DM小鼠胰腺HE结果所示，M组中胰腺组织腺泡出现纤维化，胰岛形态变小，细胞皱缩，呈条束状而变窄，细胞核固缩致密，少胞浆，细胞层次减少。在正常情况下，胰岛β细胞约占胰岛细胞总数的70%，也就是说，在HE染色中，胰岛的面积正比于β细胞的数目。相比与M组，MB 10组和MB 50组胰岛β细胞的数目呈浓度依赖性增加，且胰岛形态更趋向于C组，细胞层次更为丰富。图10为胰腺组织中胰岛素的免疫荧光，可以发现，C组胰岛素分泌最多，以此为正常水平。M组红色荧光强度最弱，即因胰岛β细胞被破坏而显著降低了胰岛素的分泌水平。经BefA蛋白灌胃处理后，MB 10组和MB 50组小鼠胰腺中的胰岛素信号强度逐渐增强，呈现出向正常水平恢复的趋势。以上结果说明，在T1DM小鼠模型中，BefA蛋白的摄入可保护胰腺及胰岛的健康形态，同时可浓度依赖性地促进β细胞分泌可唯一降低血糖的激素——胰岛素。
T1DM小鼠肠道菌群变化分析
肠道菌群与人类健康关系密切，肠道菌群失调可导致胰岛β细胞发生自身免疫性损坏而诱发T1DM。鉴于BefA蛋白来源于肠道代谢物，肠道菌群又与糖尿病的发生发展相关，我们收集了各组小鼠的粪便，利用高通量测序技术对小鼠肠道菌群进行分析。以16S rRNA扩增子测序分析了V3-V4高变区序列，原始测序数据过滤获得有效数据，并对有效数据进行标记，序列相似性>97％即被认为是同一个OTU。本次稀释曲线随着序列数目的增多而趋近平坦，表面测序的数据已趋于饱和，样本数目足够，数据结果合理（数据未显示）。
图11中Venn图结果表明，4个处理组共有OTU数目为632，分别占各组总OTU的80.82%（C组，632/782）、79.60%（M组，632/794）、80.10%（MB 10组，632/789）、82.83%（MB 50组，632/763）。PCoA（Principal co-ordinates analysis）是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，该结果中不同颜色代表不同分组，样品间距越近，样品之间的微生物组成越相近。如图12所示，M组和MB 10组小鼠肠道菌群组成结构与C组距离最远，相似性低。MB 50组与C组样品距离最近，甚至出现部分重合，说明口服较高浓度BefA蛋白可使T1DM小鼠的肠道菌群组成结构更趋近于正常小鼠。接下来，我们利用LDA分析寻找各组间在丰度上有显著性差异的菌种，LDA score（Log 10）＞4即表示该菌种在该组内丰富度显著高于其它组别。如图13所示，在MB 50组中，益生性乳酸菌的丰度在科（f）、属（g）、目（o）水平上较其它三组均显著提高。在M组中，糖尿病机会致病性梭状芽胞杆菌的丰度在门（c）和目（o）水平上显著高于其它三组。以上高通量测序结果说明，在T1DM小鼠模型中，口服BefA蛋白对紊乱的肠道菌群有一定的调节作用，且这种作用呈现浓度依赖性。相对于MB 10组，MB 50组小鼠的肠道菌群组成结构更趋向于C组，同时MB 50组小鼠肠道内益生性乳酸菌的丰度显著提高，乳酸菌可以分解葡萄糖而降低血糖，其本身具有的胃肠道益生功效也可对机体健康起到积极保护功效。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.BefA蛋白在制备治疗I型糖尿病或I型糖尿病并发症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：BefA表达载体为利用大肠杆菌BL21系统进行蛋白表达与提纯，进而获得较高纯度的BefA重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述I型糖尿病或I型糖尿病并发症为胰腺组织炎症。
4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述BefA蛋白降低胰腺组织炎症信号通路蛋白及炎性因子表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述BefA蛋白降低TLR-4/NF-κB在T1DM动物模型中的表达。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述I型糖尿病或I型糖尿病并发症为β细胞受自身免疫异常疾病。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述BefA蛋白对抑制胰岛细胞坏死具有浓度依赖性特点。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述BefA蛋白促进胰岛β细胞分化增殖。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述BefA蛋白能浓度依赖性地促进β细胞分泌胰岛素。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为口服型。
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