CN111973173A - 用于海马脑片的微电极阵列芯片、修饰方法及测试方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种微电极阵列芯片,用于海马脑片的神经电生理信号的检测,包括:绝缘基底(1),其上形成有微电极阵列(2),其中,微电极阵列(2)包括多个以海马脑片的胞体层轮廓排布的微电极;微电极阵列(2)表面修饰有用于神经电生理信号检测的纳米复合材料(7);参比电极(3),其分布在微电极阵列(2)的外围;触点(5),其分布在绝缘基底(1)的四周,微电极阵列(2)及参比电极(3)均通过引线(4)连接至触点(5);其中,所有引线(4)表面均覆盖有绝缘层(6)。该芯片能够实现对海马脑片各主要亚区微弱神经电生理信号的高精度高质量检测,从而实现对不同病理条件下,大鼠海马脑片神经电生理信号传导机制的研究。

Description

用于海马脑片的微电极阵列芯片、修饰方法及测试方法
技术领域
本公开涉及生物传感器的微加工领域和纳米修饰领域,特别是涉及一种用于海马脑片的微电极阵列芯片、修饰方法及测试方法。
背景技术
海马区是大脑最重要的脑区之一,其主管着近期记忆以及帮助处理长期学习。而海马区神经环路的紊乱或异常放电会引发癫痫等神经性疾病,因此,对海马区的深入研究有助于神经科学的发展。海马脑片神经电生理信号检测是研究海马区的重要方法。目前对海马脑片进行神经电生理信号检测的技术包括钨丝电极,膜片钳和微电极阵列等。由于微电极阵列技术能够同时检测多个位点的信号,成为研究海马脑片的主要方法。
然而,目前实验室所使用的微电极阵列不是专门为海马脑片设计的,其位点难以精确定位在海马脑片的各主要亚区,特别是CA区的锥体细胞层和DG区的颗粒细胞层,这大大限制了对海马脑片神经环路传导机制的研究。另一方面,海马脑片中的神经电生理信号十分微弱,这使得普通的微电极阵列无法满足海马脑片高信噪比的信号检测需求。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对于上述技术问题,本公开提出一种用于海马脑片的微电极阵列芯片、修饰方法及测试方法,用于至少部分解决上述技术问题。
(二)技术方案
根据本公开第一方面,提供一种微电极阵列芯片,用于海马脑片的神经电生理信号的检测,包括:绝缘基底1,其上形成有微电极阵列2,其中,微电极阵列1包括多个以海马脑片的胞体层轮廓排布的微电极;微电极阵列2表面修饰有用于神经电生理信号检测的纳米复合材料7;参比电极3,其分布在微电极阵列2的外围;触点5,其分布在绝缘基底1的四周,微电极阵列2及参比电极3均通过引线4连接至触点5;其中,所有引线4表面均覆盖有绝缘层6。
可选地,微电极以海马脑片中海马区的冠状切面的轮廓进行排布。
可选地,纳米复合材料7包括导电聚合物和碳纳米管。
可选地,微电极的直径为5μm-30μm,微电极之间的间距为50-500μm。
可选地,微电极为由导电薄膜材料制成的圆形微电极。
可选地,导电聚合物包括聚乙炔或聚吡咯或聚噻吩或聚苯胺,碳纳米管包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管。
可选地,参比电极3的尺寸比微电极的尺寸大一个数量级。
可选地,微电极阵列2包括28-59个微电极,参比电极3的数量为1-4个。
根据本公开另一方面,提供一种表面定点修饰方法,用于在上述微电极阵列芯片中的微电极阵列2表面修饰纳米复合材料7,包括:将微电极阵列芯片中需要修饰的微电极位点置入磷酸盐缓冲溶液进行表面活化;制备聚苯乙烯磺酸钠与碳纳米管的悬浊液,对悬浊液进行第一次超声分散;将导电聚合物加入第一次超声分散后的悬浊液,并进行第二次超声分散;将第二次超声分散后的悬浊液滴入活化后的微电极,以微电极作为工作电极,向微电极施加电压或者电流波形,使其发生聚合反应。
根据本公开又一方面,提供一种上述微电极阵列芯片的测试方法,包括:在将待测海马脑片置于微电极阵列2中之前,需要对微电极阵列2进行表面处理,表面处理包括:制备硼酸盐缓冲液;向硼酸盐缓冲液中加入聚醚酰亚胺,制备聚醚酰亚胺溶液;在微电极阵列2中加入聚醚酰亚胺溶液,对微电极阵列2进行表面处理。
(三)有益效果
本公开提出一种用于海马脑片的微电极阵列芯片、修饰方法及测试方法,有益效果为:
该芯片通过以海马脑片的胞体层轮廓对微电极阵列位点排布的设计,可以实现对海马脑片各主要亚区神经电生理信号的高精度检测,从而实现对不同病理条件下,海马脑片神经电生理信号传导机制的研究。该芯片在微电极表面修饰纳米复合材料,使微电极具有更好的电子传递能力和生物相容性,从而实现对海马脑片微弱神经电生理信号的高精度高质量检测。同时,本公开还对应设计表面定点修饰方法,以更好地实现在微电极阵列表面修饰纳米复合材料。
附图说明
为了更完整地理解本公开及其优势,现在将参考结合附图的以下描述,此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本公开的实施例,并与说明书一起用于解释本公开的原理。其中:
图1示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片的结构图;
图2示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片制备方法的流程图;
图3示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰方法的流程图;
图4示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰的结构变化图;
图5示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰位点的SEM图;
图6示意性根据本公开实施例的大鼠海马脑片贴附在微电极位点上的相关位置实物图,其中,大鼠海马脑片被划分为DG,CA3c,CA3b,CA3a,CA1这五个主要亚区。
图7示意性示出了根据本公开实施例的大鼠海马脑片癫痫样放电数据分析图。
具体实施方式
以下,将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解,这些描述只是示例性的,而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中,为便于解释,阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而,明显地,一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本公开的概念。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例,而并非意在限制本发明。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在,但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
图1示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片的结构图。
本公开实施例一方面提供一种微电极阵列芯片,如图1所示,该微电极阵列芯片例如可以包括:
绝缘基底1、微电极阵列2、参比电极3、引线4、触点5、绝缘层6和纳米复合材料7。
具体地,绝缘基底1作为整个微电极阵列芯片的载体,微电极阵列2形成在绝缘基底1上。其中,微电极阵列2可以包括多个以海马脑片的胞体层轮廓排布的微电极,其中一种方式为以海马脑片中海马区的冠状切面的轮廓进行排布。微电极阵列2的表面修饰有用于神经电生理信号检测的纳米复合材料7。
在本公开实施例中,绝缘基底1例如可以选用石英玻璃材料,尺寸可以根据根据实际情况设定,例如可以设定为边长为50mm,厚度为1.5mm,具体本公开不做限制。微电极阵列2中的微电极可以为由导电薄膜材料制成的圆形微电极,其直径例如可以为5μm-30μm,所述微电极之间的间距为50-500μm,数量例如可以为28-59个。本实施通过优化微电极的具体的参数可以进一步提高检测的精度及质量。
参比电极3可以分布在微电极阵列2的外围,用于在检测过程中提供参考电位并保持电位稳定。在本公开实施例中,参比电极3的数量可以为1-4个,当参比电极3的数量为偶数时,参比电极3可以对称分布在微电极阵列2的外围。参比电极3的尺寸可以比微电极大一个数量级。
触点5分布在绝缘基底1的四周,微电极阵列2及参比电极3均通过引线4连接至触点5。所有引线4表面均覆盖有绝缘层6。
其中,引线4及触点5也可由导电薄膜材料制成,导电薄膜例如可以为金,厚度例如可为200nm,具体的材料类型及尺寸本公开不做限制,具体根据实际需求设定。绝缘层6的材料例如可以为SiO2/Si3N4/SiO2,具体材料类型本公开不做限制。
导电聚合物高导电性,多孔结构和可加工性的优点。碳纳米管具备独特的化学性质、较好的机械强度、较强的吸附能力、较多的催化位点和较大的比表面积等。将导电聚合物与碳纳米管共同修饰在微电极表面能够极大地提高微电极的电子传递能力和生物相容性,从而有利于海马脑片神经电生理信号的检测。因此,在本公开实施例中,纳米复合材料7例如可以包括导电聚合物和碳纳米管。导电聚合物例如可以包括聚乙炔或聚吡咯或聚噻吩或聚苯胺等,碳纳米管例如可以包括多壁碳纳米管(MWCNT)或单壁碳纳米管(SWCNT)。
本公开实施例提供的芯片通过以海马脑片的胞体层轮廓对微电极阵列位点排布的设计,可以实现对海马脑片各主要亚区神经电生理信号的高精度检测,从而实现对不同病理条件下,海马脑片神经电生理信号传导机制的研究。该芯片在微电极表面修饰纳米复合材料,使微电极具有更好的电子传递能力和生物相容性,从而实现对海马脑片微弱神经电生理信号的高精度高质量检测。此外,通过合理选择纳米复合材料的材料以及微电极相关参数的设定,可以进一步提高检测的精度及质量。
本公开实施例另一方面提供一种上述微电极阵列芯片的制备方法,图2示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片制备方法的流程图,如图2所示,该方法例如可以包括:
S201,对绝缘基底进行清洁。
在操作S201,绝缘基底石英玻璃,选择采用煮沸的浓硫酸溶液清洗玻璃片15-20分钟,利用其强氧化性去除石英玻璃基底上残留的有机杂质或无机杂质。
S202,对清洁后的绝缘基底图案化。
在操作S202,采用光刻工艺(例如选择正性光刻胶AZ1500)对绝缘基底上的微电极,参比电极,引线和触点进行图案化
S203,制作微电极,参比电极,引线和触点。
在操作S203,在光刻胶图形表面先溅射预设厚度Cr种子层,再溅射一层预设厚度的Au薄膜层。具体厚度本公开不做限制,例如溅射50nm的Cr种子层及200nm的Au薄膜层。
采用剥离工艺去除多余导电薄膜层,形成所需的微电极,参比电极,引线和触点。
S204,制备绝缘层。
在操作S204,采用等离子体化学气相沉积(PECVD,例如300℃)沉积SiO2(例如100nm)/Si3N4(例如200nm)/SiO2(例如200nm)绝缘层。
S205,对微电极和触点进行刻蚀。
在操作S205,再次用光刻工艺暴露出微电极和触点上方的绝缘层,通过CHF3反应离子刻蚀(RIE)选择性地去除微电极和触点上的绝缘层。
S206,对微电极阵列进行清洗。
在操作S206,使用丙酮去除微电极阵列芯片上残留的光刻胶,并用去离子水冲洗干净。
S207,采用纳米复合材料对微电极阵列进行表面定点修饰,得到最终的微电极阵列芯片。
图3示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰方法的流程图,图4示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰的结构变化图,图5示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列芯片表面定点修饰位点的SEM图。参阅图3结合图4及图5,该方法例如可以包括:
S301,将微电极阵列芯片中需要修饰的微电极位点置入磷酸盐缓冲溶液进行表面活化。
在活化之前,将微电极阵列芯片置于去离子水中清洗,氮气枪吹干芯片表面,再用氧等离子体刻蚀的方法清洁芯片表面,其中,氧等离子体刻蚀的功率例如可以为50-100W,氧流量例如可以30L/min,时间例如可以30-90s。清洁完成后,将微电极阵列芯片中需要修饰的微电极位点置入磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中,采用电化学的方法进行表面活化,其中,电化学方法例如可以采用计时电流法,电压例如可以为-2V,时间例如可以为10-20s。本实施例中氧等离子体刻蚀的具体工艺参数选择功率100W,氧流量30L/min,时间90s进行,表面活化的工艺参数具体选择电压-2V,时间20S。
S302,制备聚苯乙烯磺酸钠与碳纳米管的悬浊液,对悬浊液进行第一次超声分散。
本实施例中,选择制备PSS及MWCNT悬浊液,其中,PSS例如可以为0.1-1M,MWCNT例如可以为1-10mg/ml。本实施例中制备悬浊液的工艺参数具体选择制备0.1M PSS和2mg/mlMWCNT悬浊液4ml,超声分散30分钟。
S303,将导电聚合物加入第一次超声分散后的悬浊液,并进行第二次超声分散。
本实施例中,导电聚合物选择EDOT,其中,EDOT单体的浓度例如可以为10-100mM,超声分散的时间例如可以为30-60分钟。本实施例中量取20mM的EDOT滴入4ml的分散液中,并继续超声分散30分钟
S304,将第二次超声分散后的悬浊液滴入活化后的微电极,以微电极作为工作电极,向微电极施加电压或者电流波形,使其发生聚合反应。
本实施例将超声后的分散液抽取2ml滴入微电极阵列中,电沉积采用的循环伏安法在三电极体系中进行,其中,对电极为铂丝,参比电极为Ag/AgCl。电压范围为0-0.95V,扫描速率为100mV/s,扫描圈数为3-5圈。聚合反应完成后,将微电极中的电解液倒出并用去离子水冲洗干净,然后在室温下晾干,得到修饰在微电极上的纳米复合材料MWCNTs/PEDOT∶PSS。
至此,完成图1所示的微电极芯片的制备。
本公开实施例另一方面提供了采用上述微电极芯片对大鼠海马脑片神经电生理信号进行检测方法。具体制备大鼠海马脑片的步骤包括:
选择3-6周左右的SD大鼠,选用10%水合氯醛作为麻醉剂,注射剂量为0.3-0.5ml/100g,直接断头,取脑时间(从断头到脑浸入人工脑脊液冰水混合物的时间)小于3分钟。剥离出的全脑放置于氧混合(95%O2+5%CO2)饱和的0~4℃人工脑脊液(ACSF)中冷却。采用振动切片机切取坐标为AP:-3.6mm的冠状海马脑片,脑片的厚度为350μm。将脑片放置于32℃恒温水浴中孵育50分钟,得到待检测的大鼠海马脑片。
在将待测海马脑片置于所述微电极阵列2中进行检测之前,还需要对微电极阵列进行表面处理,表面处理包括:
首先,制备硼酸盐缓冲液。
在蒸馏水中溶解硼酸盐、四硼酸钠,制备硼酸盐缓冲液。本实施例在蒸馏水中溶解硼酸盐3.1g、四硼酸钠4.75g,制备硼酸盐缓冲液1L,使用盐酸将PH值调整到8.4。
然后,向硼酸盐缓冲液中加入聚醚酰亚胺(PEI),制备聚醚酰亚胺溶液。本实施例中用50%PEI在硼酸盐缓冲液中制备0.1%PEI溶液。
最后,在微电极阵列中加入聚醚酰亚胺溶液,对微电极阵列进行表面处理。处理时,采用封口膜包裹,防止溶液蒸干。在使用前,用无菌去离子水冲洗PEI溶液处理过的微电极阵列芯片。本实施例中在每个MEA中加入2ml的PEI溶液,将MEA放置在生物安全柜中过夜。用无菌去离子水冲洗PEI溶液处理过的MEA 4次。
应当理解上述参数只是本实施例的一个示例,并不用于限制本公开。
上述测试准备工作完成,对大鼠海马脑片进行电生理信号的检测,以检测大鼠海马脑片癫痫样放电。具体包括如下步骤:
首先,将孵育后的脑片放置于表面处理后的微电极阵列中,采用倒置显微镜将微电极阵列和脑片对齐,如图6所示。
其次,将微电极阵列芯片通过接口电路连接到128通道的电生理检测系统中,并保证微电极阵列芯片和接口电路能够良好的接地和屏蔽。在检测开始后,不断地将富含氧气的普通人工脑脊液,通入培养池进行灌流,满足切片中大量细胞的耗氧需求,并提供相对恒定的灌流速度(例如2ml/min)和温度(例如32℃),以保证脑片的细胞活性。其中,普通人工脑脊液(ACSF)的成分(in mM)例如可以包括:NaCl 125,KCl 3.5,NaH2PO4·2H2O 1.2,CaCl2·2H2O 2.4,MgCl2·6H2O 1.3,HCO3 26,Glucose·H2O 25。
最后,在大鼠海马脑片能够稳定放电预设时间(例如10分钟)后,将普通人工脑脊液换成高钾人工脑脊液(high-K+ACSF)(in mM):NaCl 125,KCl 8.5,NaH2PO4·2H2O 1.2,CaCl2·2H2O 2.4,MgCl2·6H2O 1.3,NaHCO3 26,Glucose·H2O 25。高钾人工脑脊液的灌流速度例如可以为2ml/min,用于引发大鼠海马脑片的癫痫样放电。微电极阵列芯片实时同步地检测大鼠海马脑片在高钾人工脑脊液灌流前后各主要亚区的电生理信号,完成大鼠海马脑片神经电生理信号的检测。
在完成大鼠海马脑片神经电生理信号的检测之后,需要对神经电生理信号进行分析,具体步骤包括:
首先,采用大于200Hz的高通滤波器获取原始电生理信号中的高频信号,采用小于200Hz的低通滤波器获取原始电生理信号中的场电位信号(LFP)。提取高频信号中信噪比大于3的信号作为动作电位(spike)
然后,取大鼠海马脑片各主要亚区癫痫样放电稳定发放10分钟的数据段,求得该时间段内动作电位的平均发放频率,从而比较癫痫样放电时海马脑片各主要亚区神经细胞的兴奋性差异,如图7中a所示,其示出了大鼠海马脑片各主要亚区spike放电频率图。
最后,通过对癫痫样放电期间LFP信号负峰值的延迟来判断癫痫样放电信号在大鼠海马脑片中的起源,传播和终止,如图7中b所示,其大鼠海马脑片癫痫样放电LFP信号负峰值的延时图,图中的微电极位点标号对应于图4中的微电极位点。
至此,采用上述微电极阵列芯片完成大鼠海马脑片神经电生理信号的检测。
本领域技术人员可以理解,尽管已经参照本公开的特定示例性实施例示出并描述了本公开,但是本领域技术人员应该理解,在不背离所附权利要求及其等同物限定的本公开的精神和范围的情况下,可以对本公开进行形式和细节上的多种改变。因此,本公开的范围不应该限于上述实施例,而是应该不仅由所附权利要求来进行确定,还由所附权利要求的等同物来进行限定。

Claims (10)

1.一种微电极阵列芯片,用于海马脑片的神经电生理信号的检测,其特征在于,包括:
绝缘基底(1),其上形成有微电极阵列(2),其中,所述微电极阵列(2)包括多个以所述海马脑片的胞体层轮廓排布的微电极;所述微电极阵列(2)表面修饰有用于神经电生理信号检测的纳米复合材料(7);
参比电极(3),其分布在所述微电极阵列(2)的外围;
触点(5),其分布在所述绝缘基底(1)的四周,所述微电极阵列(2)及所述参比电极(3)均通过引线(4)连接至所述触点(5);其中,所有所述引线(4)表面均覆盖有绝缘层(6)。
2.根据权利要求1所述的微电极阵列芯片,其中,所述微电极以所述海马脑片中海马区的冠状切面的轮廓进行排布。
3.根据权利要求1所述的微电极阵列芯片,其特征在于,所述纳米复合材料(7)包括导电聚合物和碳纳米管。
4.根据权利要求1或2所述的微电极阵列芯片,其中,所述微电极的直径为5μm-30μm,所述微电极之间的间距为50-500μm。
5.根据权利要求1所述的微电极阵列芯片,其特征在于,所述微电极为由导电薄膜材料制成的圆形微电极。
6.根据权利要求3所述的微电极阵列芯片,其特征在于,所述导电聚合物包括聚乙炔或聚吡咯或聚噻吩或聚苯胺,所述碳纳米管包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管。
7.根据权利要求1所述的微电极阵列芯片,其特征在于,所述参比电极(3)的尺寸比所述微电极的尺寸大一个数量级。
8.根据权利要求1所述的微电极阵列芯片,其特征在于,所述微电极阵列(2)包括28-59个所述微电极,所述参比电极(3)的数量为1-4个。
9.一种表面定点修饰方法,用于在如权利要求1-8任一项所述微电极阵列芯片中的微电极阵列(2)表面修饰纳米复合材料(7),其特征在于,包括:
将所述微电极阵列芯片中需要修饰的微电极位点置入磷酸盐缓冲溶液进行表面活化;
制备聚苯乙烯磺酸钠与碳纳米管的悬浊液,对所述悬浊液进行第一次超声分散;
将导电聚合物加入第一次超声分散后的悬浊液,并进行第二次超声分散;
将第二次超声分散后的悬浊液滴入活化后的微电极,以所述微电极作为工作电极,向所述微电极施加电压或者电流波形,使其发生聚合反应。
10.一种基于权利要求1-8任一项所述微电极阵列芯片的测试方法,其特征在于,包括:
在将待测海马脑片置于所述微电极阵列(2)中之前,需要对所述微电极阵列(2)进行表面处理,所述表面处理包括:
制备硼酸盐缓冲液;
向所述硼酸盐缓冲液中加入聚醚酰亚胺,制备聚醚酰亚胺溶液;
在所述微电极阵列(2)中加入所述聚醚酰亚胺溶液,对所述微电极阵列(2)进行表面处理。
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