CN111971042B - 用于确认作为阿尔茨海默病的致病因子的颗粒蛋白、抑制颗粒蛋白的聚集和治疗阿尔茨海默病的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于抑制颗粒蛋白从无毒性低分子量形态聚集为毒性高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的组合物。这种组合物典型地包含一种以上的活性化合物或制剂，这可在本申请中还被称为分解化合物。提供利用本申请中所记载的化合物及组合物，i)调节、抑制或防止颗粒蛋白和金属离子的相互作用的方法，ii)调节、抑制、防止颗粒蛋白的聚集或解离聚集的颗粒蛋白的方法，iii)减少或抑制细胞毒性的方法及iv)治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的方法及v)治疗或预防帕金森病和/或亨廷顿病的方法。
Description
技术领域
以下包含可有用于理解本发明的信息。并不认定在此提供的信息为当前说明或所请求的发明的现有技术，或有关，或具体或默示提及的现有技术。
背景技术
据悉，阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)患者的脑具有被称为老年斑(senile plaque)的蛋白质聚集体，阿尔茨海默病患者的临床重症度与这些老年斑直接连接(Glass et al.,2010；Heneka et al.,2010,2015)。因此，用于寻找阿尔茨海默病的治疗法的过去努力的焦点主要放在这些老年斑的研究，努力研究出寻找老年斑的成分，或妨碍老年斑形成或妨碍构成老年斑的蛋白质成分的聚集来使已形成的老年斑破坏或减少的方法((Glass et al.,2010；Heneka et al.,2010,2015)。确认的老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白(beta-amyloid，Aβ)和颗粒蛋白(嗜铬粒蛋白(chromogranins)和分泌粒蛋白(secretograinins))(Heneka et al.,2010,2015,Willis et al.,2008,2011)。老年斑中发现的β-淀粉样蛋白由～42个氨基酸构成，相反，颗粒蛋白大部分由～430-700个氨基酸构成(Bartolomucci et al.,2011；Helle,2000；Taupenot et al.,2003)。
传统上，用于寻找阿尔茨海默病的治疗法的几乎所有努力未成功，而集中于β-淀粉样蛋白(Doody et al.,2014；Glass et al.,2010；Heneka et al.,2010,2015；Sallowayet al.,2014)。其结果，人类在无任何治疗的情况下无力地暴露在这致命的疾病中，与阿尔茨海默病的治疗相关的全年全球支出达到约1万亿美元。在严重的全球情况下，广泛努力约30年，当前在商品供应线中也无可消除这疾病的有望的药物(Doody et al.,2014；Salloway et al.,2014)。这种紧迫情况因用于寻找阿尔茨海默病治疗剂的全球努力的焦点主要放在作为老年斑的小成分的β-淀粉样蛋白的窄的接近方式而发生。
实际上，阿尔茨海默病的特征为在脑细胞外部的脑间质(brain interstitium)中存在有被熟知为老年斑的蛋白质聚集体(Glass et al.,2010；Heneka et al.,2010,2015)。老年斑由脑蛋白，即，颗粒蛋白和β-淀粉样蛋白的聚集体构成(Heneka et al.,2010,2015,Willis et al.,2008,2011)。其中，颗粒蛋白显著大于β-淀粉样蛋白，脑中更丰富(Bartolomucci et al.,2011；Helle,2000；Taupenot et al.,2003)。在本申请中，将聚集的颗粒蛋白识别为阿尔茨海默病的致病因子，确认金属离子起到阿尔茨海默病的辅因子(co-factor)的作用，不仅如此，指出当抑制由金属诱导的颗粒蛋白的聚集时，可预防阿尔茨海默病，至少部分进行治疗。因此，通常，报告用于抑制颗粒蛋白的聚集及聚集的颗粒蛋白的毒性的组合物及方法相关实验结果及发明。
现有技术文献
专利文献
韩国授权专利第1868343号
发明内容
要解决的问题
本说明书中说明并请求的发明包括本摘要中说明或参照的，但具有不局限于此的很多特征或实施例。本说明书中说明并请求的发明不局限于本摘要中确认的特征或实施例，这仅为了说明而包括，而不用于限制。
在本申请中，研究作为老年斑的主要结构蛋白的颗粒蛋白的贡献、老年斑的形成及脑细胞的病原性发育中颗粒蛋白的潜在作用。该研究蔓延至开发用于抑制颗粒蛋白从无毒性低分子量形态聚集为毒性高分子量聚集形态和/或解离高分子量的聚集形态的组合物。这种组合物典型地包含在本申请中被称为分解化合物(disaggregation compound)的一种以上的活性化合物或制剂。
问题的解决方案
在本申请中所记载的一实施方式为调节、抑制或减少颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态。
更具体地，提供用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的组合物。这种组合物典型地包含抑制、防止或调节颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的一种以上的分解化合物。
在本申请中所记载的特定的花黄素(anthoxanthin)化合物为优选的分解化合物。因此，本申请提供的特定实施方式涉及使用用于抑制颗粒蛋白和金属离子的相互作用和/或由颗粒蛋白的金属-诱导的聚集的组合物的方法，其中，组合物包含一种以上的花黄素作为至少1个分解化合物。
在本申请提供的再一实施方式中，为了减少、阻断或抑制诱发阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的脑细胞的病因(pathogenesis)，在动物的脑中调节、阻断或抑制颗粒蛋白的聚集。
在另一实施方式中，提供调节、抑制或防止颗粒蛋白和金属离子的相互作用的方法。该实施方式的实施例提供抑制、防止或调节颗粒蛋白与选自Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的金属离子或与辅因子的相互作用或结合的分解化合物。
在还一实施方式中，本申请提供的分解化合物起到如下功能，抑制、防止、阻断或隔离选自Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的金属离子，在神经系统中抑制、预防或调节金属离子和颗粒蛋白的相互作用或结合，调节、抑制或防止颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态。
在又一实施方式中，提供调节、抑制或防止颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的方法和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的方法。
在又一实施方式中，提供减少或抑制细胞毒性的方法。在特定实施方式中，提供包括用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物的给药和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的步骤的方法。
在又一实施方式中，提供痴呆或阿尔茨海默病的治疗或预防方法。在特定实施方式中，这种方法使用用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物。
与例示本发明的实施方式的原理的附图一同，以下更详细的说明使本发明实施方式的其他特征及优点变得明确。
附图说明
附图例示本发明的实施方式。
图1表示存在于阿尔茨海默病患者的脑海马的嗜铬粒蛋白A(a、d)、分泌粒蛋白Ⅱ(b、e)、嗜铬粒蛋白B(c、f)的存在在免疫染色反应中由黑色表示。比例尺(bar)＝100μm(a)、200μm(b、c)、40μm(d)、80μm(e、f)。
图2表示存在于阿尔茨海默病患者的脑海马的嗜铬粒蛋白B(A、C)和β-淀粉样蛋白(B、D)。
图3表示基于来自作为脑的免疫细胞的小胶质细胞(microglia)的嗜铬粒蛋白A-(板A)和β-淀粉样蛋白-(板B)的一氧化氮(nitric oxide，NO)和肿瘤坏死因子-α(TNFα，tumor necrosis factor-α)的剂量反应(dose-response)诱导分泌。
图4表示纯化的自然状态的嗜铬粒蛋白B(c)、分泌粒蛋白Ⅱ(d)和嗜铬粒蛋白A(b)蛋白质分子。
图5表示根据Fe2+浓度增加而出现的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图6表示根据Fe2+浓度增加而出现的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图7表示根据Fe2+浓度增加而出现的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集。
图8表示根据Zn2+浓度增加而出现的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图9表示根据Zn2+浓度增加而出现的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集。
图10表示根据Cu2+浓度增加而出现的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集。
图11表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白A的聚集的野黄芩素(scutellarein)的效果。由Cu2+诱导的嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μM)的聚集大部分被1μM的野黄芩素抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在野黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图12表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的野黄芩素的效果。由Cu2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集大部分被1μM的野黄芩素抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在野黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图13表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白B的聚集的木犀草素(luteolin)的效果。由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)(0.06μM)的聚集大部分被1μM的木犀草素抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在木犀草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图14表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的木犀草素的效果。由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集大部分被1μM的木犀草素抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在木犀草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图15表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白B的聚集的黄芩素(baicalein)的效果。由Cu2+诱导的嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)(0.06μM)的聚集大部分被1μM的黄芩素抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图16表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的黄芩素的效果。由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.01mg/ml)(0.14μM)的聚集完全被1μM的黄芩素抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图17表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的山柰酚(kaempferol)的效果。由Cu2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集大部分被1μM的山柰酚抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在山柰酚的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图18表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白A的聚集的山柰酚的效果。由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μM)的聚集完全被1μM的山柰酚抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在山柰酚的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图19表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白B的聚集的白藜芦醇(resveratrol)的效果。由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)(0.06μM)的聚集大部分被1μM的白藜芦醇抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在白藜芦醇的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图20表示抑制随着Zn2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的白藜芦醇的效果。由Zn2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集大部分被1μM的白藜芦醇抑制(pH7.4)。根据Zn2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在白藜芦醇的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图21表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的表没食子儿茶素3-没食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGC G)的效果。由Cu2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集大部分被1μM的表没食子儿茶素3-没食子酸酯抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在表没食子儿茶素3-没食子酸酯的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图22表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的表没食子儿茶素3-没食子酸酯的效果。由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集完全被1μM的表没食子儿茶素3-没食子酸酯抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在表没食子儿茶素3-没食子酸酯的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图23表示抑制随着Cu2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白A的聚集的虫草素(cordycepin)的效果。由Cu2+诱导的嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μM)的聚集大部分被1μM的虫草素抑制(pH7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在虫草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图24表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的虫草素的效果。由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集完全被1μM的虫草素抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在虫草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图25表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的嗜铬粒蛋白A的聚集的酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478的效果。由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μM)的聚集完全被1μM的酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图26表示抑制随着Fe2+浓度的增加而诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集的酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478的效果。由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μM)的聚集完全被1μM的酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图27表示在0.2mM的Fe2+存在下嗜铬粒蛋白B的流体力学(hydro dynamic)状态的分布图。有关由金属诱导的颗粒蛋白的聚集状态下的流体力学状态分布图，在0.2mM的Fe2+存在下使用动态光散射(dynamic light scattering)方法测定嗜铬粒蛋白B(0.5mg/ml)的分布(pH7.4)。
图28表示在Fe2+和类黄酮(flavonoid)之一的黄芩素的存在下嗜铬粒蛋白B的流体力学状态的分布图。由金属诱导的颗粒蛋白的聚集状态下的流体力学状态分布图在0.2mM的黄芩素和0.2mM的Fe2+存在下使用动态光散射方法测定嗜铬粒蛋白B(0.5mg/ml)(6μM)的分布(pH7.4)。
图29表示头部安装有注入管(injection cannula)的大鼠(rat)的头部图片和注入的位置。(右侧)大鼠的脑室(intracereborventricle)由灰色表示，右侧脑室的注入管的位置也由灰色表示。
4种分子以如下所述的方式通过注入管注入于脑室。(从左侧到右侧)：组(Group)1(调节组)：将1μl的缓冲液(2mM的3-吗啉丙磺酸(MOPS)，pH7.4)注入于鼠脑室(7只)。组2(颗粒蛋白)：将1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)中分别包含0.1μm的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ的颗粒蛋白溶液注入于鼠脑室(9只)。组3(颗粒蛋白+金属离子)：在分别包含0.1μM的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ的颗粒蛋白溶液中添加0.8mM的Cu2+、250μM的Fe2+、2mM的Zn2+，将所有放入1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)来注入于鼠脑室(9只)。组4(颗粒蛋白+金属离子+4种类黄酮和芪类化合物(stilbenoid)分子)：在分别包含0.1μM的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ、0.8mM的Cu2+、250μM的Fe2+、2mM的Zn2+的溶液中分别以1μM添加4种类黄酮和芪类化合物分子，将所有放入1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)来注入于鼠脑室(8只)。
图30表示试验分子注入于脑室之后1.5个月的鼠在莫里斯水迷宫(Morris watermaze)试验中寻找逃避台所需的时间。包括标准偏差来表示各组的鼠寻找逃避台所需的平均时间(秒)(n为属于各组的鼠的数量)。
图31表示各组鼠的代表性游泳轨迹。
图32表示鼠寻找移走的逃避台所需的时间。数字表示组号，包括标准偏差来表示寻找逃避台所需的平均时间(秒)。
图33表示属于各组的鼠的代表性游泳轨迹。左侧上端的编号为组号，表示各组的鼠的游泳轨迹。右侧上端的小圆表示鼠为了寻找下部左侧的由大圆表示的逃避台而出发的地点。
图34表示注入颗粒蛋白分子的鼠的异常姿势。组3的鼠中的一部分从注入颗粒蛋白和金属离子(Cu2+、Zn2+及Fe2+)的2周后开始颈部稍微倾斜，组2的一部分鼠从注入颗粒蛋白之后的4-5周后开始颈部稍微倾斜。但是，组1和组4的鼠在注入之后经过35周(约8个月)，其姿势也无任何异常。
图35表示注入颗粒蛋白的组2的鼠中收缩的海马(右侧一半)。在注入颗粒蛋白之后的第10周(颈部异常之后的第6周)检查组2的鼠中颈部倾斜的鼠的脑组织。
图36表示芹菜素(Apigenin)抑制基于Zn2+的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图37表示芹菜素抑制基于Cu2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图38表示桔皮素(Tangeretin)抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图39表示桔皮素抑制基于Cu2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图40表示槲皮素(Quercetin)抑制基于Cu2+的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图41表示槲皮素抑制基于Fe2+的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集。
图42表示漆黄素(Fisetin)抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图43表示漆黄素抑制基于Fe2+的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集。
图44表示杨梅素(Myricetin)抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图45表示杨梅素抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白B的聚集。
图46表示桑色素(Morin)抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图47表示桑色素抑制基于Zn2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图48表示5,7-二甲氧基黄酮(5,7-dimethoxyflavone)抑制基于Zn2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图49表示5,7-二甲氧基黄酮抑制基于Fe2+的嗜铬粒蛋白A的聚集。
图50表示当20μM的Cu2+和1μM的毒性抑制剂木犀草素存在时，各个颗粒蛋白对细胞的毒性。使用PC12细胞通过MTT试验(Cheruva ra et al.,2015；Shearman et al.,1994)测定各个颗粒蛋白(0.1μM的嗜铬粒蛋白A、0.06μM的嗜铬粒蛋白B、0.07μM的分泌粒蛋白Ⅱ)在20μM的Cu2+和1μM的木犀草素(由金属引起的颗粒蛋白聚集的抑制剂中的一种分子，参照图13-14)的存在下对细胞引起的毒性。木犀草素(参照图13-14)实质上阻断颗粒蛋白引起的毒性。
图51表示试验分子注入脑室之后经过2.5个月之后各组的鼠在莫里斯水迷宫试验中寻找逃避台所需的时间。
图52表示图51的实验中各组鼠的代表性游泳轨迹。
图53表示利用苏木精(haematoxylin)染色注入颗粒蛋白之后7.5个月(10.5个月的鼠)的鼠脑的海马。
图54表示图53的脑海马的类似区域的高分辨率照片。
图55表示正常鼠和患有阿尔茨海默病症状的10.5个月的鼠脑皮质的前面组织。
图56表示正常鼠和患有阿尔茨海默病症状的10.5个月的鼠脑组织的密度比较。
图57表示利用嗜铬粒蛋白A抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马。
图58表示利用嗜铬粒蛋白B抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马。
图59表示利用分泌粒蛋白Ⅱ抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马。
图60表示正常鼠和患有阿尔茨海默病症状的11.5个月的鼠的活动性(mobileactivity)比较。
上述说明的图例示一种以上的例示性实施例中的本发明的实施方式，这在以下说明中更详细地定义。在另一图中，由相同的附图标记参照的本发明的特征、因素及实施方式根据一种以上的实施例表示相同或等同或类似的特征、因素或实施方式。
具体实施方式
据悉，阿尔茨海默病患者的脑具有被称为老年斑的蛋白质聚集体，阿尔茨海默病患者的临床重症度与这些老年斑直接连接(Glass et al.,2010；Heneka et al.,2010,2015)。因此，考虑到这种问题，用于寻找阿尔茨海默病治疗法的过去努力的焦点主要放在这些老年斑的研究，研究出寻找老年斑的成分，抑制老年斑的形成或妨碍老年斑的蛋白质成分的聚集来使已形成的老年斑破坏和/或减少的方法(Glass et al.,2010；Heneka etal.,2010,2015)。确认的老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白和颗粒蛋白(嗜铬粒蛋白和分泌粒蛋白)(Hen eka et al.,2010,2015,Willis et al.,2008,2011)。老年斑中发现的β-淀粉样蛋白由～42个氨基酸构成，相反，颗粒蛋白大部分由～430-700个氨基酸构成(Bartolomucci et al.,2011；Helle,2000；Taupenot et al.,2003)。
颗粒蛋白分泌于构成脑细胞的～80％的3种主要分泌细胞，即，星形胶质细胞(astrocytes)、神经元(neurons)及小胶质细胞(microglia)，脑中更丰富，相比于β-淀粉样蛋白，脑中具有更高的聚集特性(Brinkmalm et al.,2018；Duits et al.,2018；Mattssonet al.,2013；Shaw et al.,2009；Wildsmith et al.,2014；Twig et al.,2005；Wu etal.,2013)，相比于β-淀粉样蛋白，至少以摩尔为基准～5400倍且以重量为基准～500倍对脑细胞具有毒性(Twig et al.,2005；Wu et al.,2013)。
本发明人研究作为老年斑的主要结构蛋白的颗粒蛋白的贡献、老年斑的形成及脑细胞的病原性发育中颗粒蛋白的潜在作用。研究表明，在此过程中，颗粒蛋白在存在有Ca2+、Cu2+、Fe2+及Zn2+之类的金属离子的酸性pH、阿尔茨海默病患者的脑具有这两种明显的特征时容易聚集(Faller et al.,2014；Wang and Xu,2011；Ward et al.,2014；Yates et al.,1990；Zatta et al.,2009)，聚集的颗粒蛋白积极参与老年斑的形成。颗粒蛋白的聚集倾向非常高于β-淀粉样蛋白的聚集倾向。并且，表明颗粒蛋白对脑细胞具有很大的毒性，毒性相比于β-淀粉样蛋白，至少以摩尔为基准～5400倍且以重量为基准～500倍对脑细胞具有毒性(Twig et al.,2005；Wu et al.,2013)。
本发明的一实施方式研究提供调节、阻断或抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的方法和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的方法。特定实施方式提供为了调节、阻断或抑制诱发阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的脑细胞的病因，在动物的脑中调节、阻断或抑制颗粒蛋白聚集的方法。颗粒蛋白典型地包含以下的嗜铬粒蛋白A(CGA)、嗜铬粒蛋白B(CGB)、分泌粒蛋白Ⅱ(SgⅡ)及分泌粒蛋白Ⅲ(SgⅢ)中的一种以上。
因此，本发明的实施例公开用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物。这种组合物典型地包含一种以上的活性化合物或制剂，这还可在本申请中被称为分解化合物。本说明书中使用的活性(active)化合物(compound)或制剂(agent)(本说明书中互相交换地使用)典型地是指充分的量被动物或患者的血流吸收时可诱发生物学效果的药剂。实施例可包含用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的一种以上的分解化合物。
至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个分解化合物用于多种实施例中。但是，10个以上的分解化合物可用作替代实施例。在一实施方式中，本申请提供的分解化合物抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态。在再一实施方式中，本申请提供的分解化合物抑制、防止或调节例如，包含Ca2+、Cu2+、Fe2+及Zn2+的金属离子或辅因子与颗粒蛋白之间的相互作用或结合。特定实施例提供为了在动物的神经系统内抑制、预防或调节颗粒蛋白和金属离子的相互作用或结合而减少、阻断、抑制或隔离选自Ca2+、Cu2+、Fe2 +及Zn2+中的金属离子的一种以上的分解化合物，抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或在动物中使高分子量聚集形态解离为低分子量形态。
适当的分解化合物不受限制地包含花黄素(anthoxanthins)、花色苷(anthocyanins)、花青素(anthocyanidins)、黄烷(flavans)、黄烷酮(flavanones)、黄酮醇(flavonols)、芪类化合物(stilbenoi ds)、金属蛋白(metalloproteins)、Zn2+结合及隔离分子(Zn2+bindi ng and sequestering molecules)、酪蛋白(casein)、白蛋白(albu min)、锌指转录因子(zinc finger transcription factors)、金属离子螯合剂(metal ionchelators)、Cu2+结合及隔离分子(Cu2+binding and sequestering molecules)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、Fe2+结合及隔离分子(Fe2+binding and sequestering molecules)、钙调蛋白(calmodulin)、肌钙蛋白(troponin)、铁蛋白(ferritin)、转铁蛋白(transferrin)、乳铁蛋白(lactoferrin)、虫草素(cordycepin)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478及5,7-二甲氧基黄酮(5,7-dimethoxyflavone)。
适当的花黄素不受限制地包含野黄芩素(scutellarein)、木犀草素(luteolin)、黄芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)、桔皮素(tangeretin)、杨梅素(myricetin)、漆黄素(fisetin)、桑色素(morin)、高良姜素(galangin)、异鼠李素(isorhamnetin)、霍香黃酮醇(pachypodol)、鼠李秦素(rhamnazin)、吡喃黄酮醇(pyranoflavonols)及呋喃黄酮醇(furanoflavonols)。
适当的芪类化合物不受限制地包含白藜芦醇(resveratrol)、白皮杉醇(piceatannolin)、银松素(pinosylvin)、紫檀芪(pterostilbene)、白皮杉醇葡萄糖苷(astringin)及白藜芦醇苷(piceid)。其中，优选的芪类化合物为白藜芦醇。
适当的黄烷不受限制地包含表没食子儿茶素3-没食子酸酯(epigallocatechin3-gallate，EGCG)、儿茶素(catechin)、没食子儿茶素(gallocatechin)、儿茶素3-没食子酸酯(catechin 3-gallate)、没食子儿茶素3-没食子酸酯(gallocatechin 3-gallate)、表儿茶素(epicat echin)、表没食子儿茶素(epigallocatechin)、表儿茶素3-没食子酸酯(epicatechin 3-gallate)、茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-galla te)、茶黄素-3’-没食子酸酯(theaflavin-3’-gallate)、茶黄素-3.3’-没食子酸酯(theaflavin-3,3’-gallate)、茶红素(thearubigin)及原花青素(proanthocyanidins)。其中，优选的黄烷为表没食子儿茶素3-没食子酸酯(EGCG)。
方法
在另一实施方式中，提供i)调节、抑制或防止颗粒蛋白和金属离子的相互作用的方法，ii)调节、抑制、防止颗粒蛋白的聚集或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的方法，iii)减少或抑制细胞毒性的方法及iv)治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的方法。
在一实施方式中，这种方法典型地使用一种以上的分解化合物。优选的分解化合物包含花黄素。因此，本申请提供的特定实施例涉及使用用于抑制颗粒蛋白和金属离子的相互作用的组合物的方法，其中，组合物包含一种以上的花黄素。
作为非限制性例，本申请提供的一特定实施例涉及使用用于抑制颗粒蛋白和金属离子的相互作用的组合物的方法，该组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。再一实施例使用包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部的用于抑制金属离子和颗粒蛋白的相互作用的组合物。一实施例包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。另一实施例包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
本申请提供的特定实施例涉及用于抑制颗粒蛋白和金属离子的相互作用的组合物及方法，该组合物包含除了i)花黄素、ii)芪类化合物及iii)花黄素或芪类化合物之外的分解化合物。在特定追加实施例中，花黄素为以下的野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素及漆黄素中的一种以上。在特定追加实施例中，芪类化合物为白藜芦醇或其衍生物、盐或酯。在特定追加实施例中，除了花黄素或芪类化合物之外的分解化合物选自表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中。
在另一实施方式中，提供调节、抑制或防止颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的方法或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的方法。因此，在特定实施例中，公开提供用于调节、抑制或防止颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的药学组合物。在特定实施例中，这种方法使用用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物。用于提供的调节、抑制或防止颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的方法的药学组合物的一特定实施例包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。替代实施例在药学组合物或剂型中包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个分解化合物。
在又一实施方式中，提供痴呆或阿尔茨海默病的治疗或预防方法。因此，在特定实施例中，公开提供用于痴呆或阿尔茨海默病的治疗或预防方法的药学组合物。在特定实施例中，上述方法使用用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的组合物。提供的用于治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的药学组合物的一特定实施例包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。替代实施例在药学组合物或剂型中包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个分解化合物。
在又一实施方式中，提供减少或抑制细胞毒性的方法。在优选的实施例中，上述方法包括将用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物给药和/或本申请中提供的从高分子量聚集形态解离为低分子量形态的步骤。
在又一实施方式中，提供痴呆或阿尔茨海默病的治疗或预防方法。在特定实施例中，上述方法包括将用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的有效量的药学组合物给药到动物(如患者)。在一特定实施例中，组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。在优选的实施例中，上述方法在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
组合物及剂型
活性化合物的一日给药量例如可以为至少10mg、至少15mg、至少20mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少40mg、至少45mg、至少50mg、至少55mg、至少60mg、至少65mg、至少70mg、至少75mg、至少80mg、至少85mg、至少90mg、至少95mg、至少100mg、至少150mg、至少200mg、至少250mg、至少300mg、至少350mg、至少400mg、至少450mg、至少500mg、至少550mg、至少600mg、至少650mg、至少700mg、至少750mg、至少800mg、至少850mg、至少900mg、至少950mg、至少1000mg、至少1050mg、至少1100mg、至少1150mg、至少1200mg、至少1250mg、至少1300mg、至少1350mg、至少1400mg、至少1450mg、至少1500mg、至少2000mg、至少3000mg、至少5000mg或其以上。
在本说明书的实施方式中，用于治疗障碍的治疗化合物的剂量可以在至少0.1mg/kg/日、至少1.0mg/kg/日、至少5.0mg/kg/日、至少10mg/kg/日、至少15mg/kg/日、至少20mg/kg/日、至少25mg/kg/日、至少30mg/kg/日、至少35mg/kg/日、至少40mg/kg/日、至少45mg/kg/日或至少50mg/kg/日或约0.001mg/kg/日至约100mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约10mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约15mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约20mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约25mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约30mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约35mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约40mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约45mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约50mg/kg/日、约0.001mg/kg/日至约75mg/kg/日或约0.001mg/kg/日至约100mg/kg/日的范围内。
在又一实施方式中，在用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的组合物中，一种以上的分解化合物与另一分解化合物的比率可在另一实施例中多样。从这种方面，一个分解化合物的总量与另一个分解化合物的总量之比例如可以在约1：100、1：95、1：90、1：85、1：80、1：75、1：70、1：65、1：60、1：55、1：50、1：45、1：40、1：35、1：30、1：25、1：20、1：15、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1w/w至约100：1、95：1、90：1、85：1、80：1、75：1、70：1、65：1、60：1、55：1、50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1w/w的范围内。
在本说明书的实施方式中，公开颗粒蛋白聚集减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，阿尔茨海默病的症状相关重症度减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在本实施例的其他实施方式中，如本申请中公开的本发明的治疗化合物的给药例如将与颗粒蛋白聚集有关的疾病相关症状的重症度减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在本说明书的实施方式中，公开颗粒蛋白聚集的减少相关症状减少约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％或约50％至约70％。在优选的实施例中，上述颗粒蛋白聚集的减少相关症状还应用于i)调节、抑制或防止颗粒蛋白和金属离子的相互作用的方法，ii)调节、抑制、防止颗粒蛋白的聚集或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的方法，iii)减少或抑制细胞毒性的方法及iv)治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的方法。
给药可以为单次给药或累积(连续给药)，可由本发明所属技术领域的普通技术人员容易确定。本发明的治疗化合物能够以1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或其以上给药到对象。例如，阿尔茨海默病的治疗可包括如本申请中公开的治疗组合物的有效量的1次给药。作为替代方案，阿尔茨海默病的治疗例如可包括如1日1次、1日2次、1日3次、几日1次或每周1次经过多个期间执行的治疗化合物有效量的多次给药。每个人的给药时期可根据个人的症状重症度之类的因素而不同。例如，本申请中公开的治疗化合物的有效剂量可以为无限期间每日1次的给药或个人不再需要治疗为止的给药。本发明所属技术领域的普通技术人员识别个人的状态可在整个治疗过程中被监控，本申请中公开的药学组合物的给药有效量可由此而被调整。在一实施例中，本申请中公开的治疗化合物相比于不接受治疗的患者，可将包括患有阿尔茨海默病的对象解决疾病的症状所需的时间减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在一实施例中，治疗化合物的给药期间可以为1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其以上。在追加实施例中，中断给药的期间可以为1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其以上。
如本说明书中公开的治疗化合物给药到个人。个人通常为人类，但不管是不是家畜，可包括狗、猫、鸟、牛、马、羊、山羊、爬虫类及其他动物，不局限于此。
在又一实施方式中，与使用说明书一同，提供不受限制地包含本发明的至少一种组合物的试剂盒或包装盒。在一实施例中，当各个治疗化合物本身以个别或独立给药形态(例如，胶囊、片剂或液体)不受限制地给药时，试剂盒不受限制地与使用说明书一同包含各个治疗化合物。在追加实施例中，只要包装明确表示治疗化合物给药的方式，治疗化合物的给药能够以适当的任意方式包装，不受特别限制。在追加实施例中，各个治疗化合物或治疗化合物的组合能够以包含皮下给药的液体或其他液态制剂的液体型的单次给药形态进行组合。治疗化合物能够以包装的形态提供给个人。上述包装的形态例如可以为容器、瓶、罐(canister)、管或其他密闭的容器。不受特别限制。
在一实施例中，当各个药物本身以各个或个别给药形态(例如，胶囊或片剂)给药时，上述试剂盒根据使用指南包含构成组合物的各个药物，不受特别限制。在追加实施例中，只要包装明确表示药物成分给药的方式，上述药物成分的给药能够以适当的任意方式包装，不受特别限制。在追加实施例中，组合的各个药物成分能够以胶囊之类的可单次给药的给药形态组合，不受特别限制。
实施例
以下非限制性例以用于使对当前考虑的代表实施例的更完整的理解变得容易的例示目的提供。这些实施例只是例示，并不构成对本发明的范围的限制。
因此，这种例示不应被解释为限制本说明书中说明的实施例。
实施例1
金属离子的结合引起的颗粒蛋白的聚集
进行用于试验颗粒蛋白的聚集相关金属离子，尤其，Cu2+、Zn2+及Fe2+的效果的实验。
材料和方法
材料：从牛肾上腺的分泌颗粒中纯化作为主要颗粒蛋白的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B和分泌粒蛋白Ⅱ(Park et al.,2002；Yoo,1995；Yoo and Albanesi,1990)。Chelex 100购买于伯乐(Bio-Rad)公司(U.S.A)，其他试剂也使用纯度最高的。纯化的自然状态的嗜铬粒蛋白B(c)、分泌粒蛋白Ⅱ(d)及嗜铬粒蛋白A(b)示于图4中。本实验中使用的类黄酮(flavonoid)、芪类化合物(stilbenoid)及其他化合物购买于MedChem Express公司(U.S.A)、西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司(U.S.A)和圣克鲁斯生物技术(Santa CruzBiotech)公司(U.S.A)，所有分子的纯度为98％或其以上。
聚集实验：聚集实验之前，需要去除在颗粒蛋白的纯化过程中结合的金属离子来分离颗粒蛋白聚集体，以作为金属离子去除剂的Chelex 100(伯乐公司，U.S.A)广泛使用。为了由金属诱导的聚集实验，处理Chelex 100，在2mM的MOPS、溶解于pH7.4的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B或分泌粒蛋白Ⅱ中一点点增加CuCl2、FeCl2及ZnCl2之类的金属离子来进行添加。使用贝克曼DU640紫外可见(Beckman DU640 uv/vis)分光器测定浊度(turbidity)变化观察聚集，所有测定在24℃下进行。
图5至图10表示特定颗粒蛋白的金属引起的聚集形态。图5表示根据嗜铬粒蛋白A的Fe2+的增加的聚集形态。0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白A(0.1μM)在pH7.4中使用。图5表示Fe2+浓度越高，由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白A的聚集越增加。图6表示0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白B(0.06μM)在pH7.4中Fe2+浓度越高，由Fe2+诱导的嗜铬粒蛋白B的聚集越增加。图7表示0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μM)在pH7.4中Fe2+浓度越高，由Fe2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集越增加。图8表示0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白B(0.06μM)在pH7.4中Zn2+浓度越高，由Zn2 +诱导的嗜铬粒蛋白B的聚集越增加。图9表示增加分泌粒蛋白Ⅱ的浓度来进行聚集实验，分泌粒蛋白Ⅱ在pH7.4中Zn2+浓度越高，由Zn2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集越增加。图10表示0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μM)在pH7.4中Cu2+浓度越高，由Cu2+诱导的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集越增加。图11表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白A(0.1μm)的聚集大部分被1μm的野黄芩素抑制。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在野黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图12表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集大部分被1μm的野黄芩素抑制。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在野黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图13表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白B(0.06μm)的聚集大部分被1μm的木犀草素抑制。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在木犀草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图14表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集大部分被1μm的木犀草素抑制。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在木犀草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图15表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白B(0.06μm)的聚集大部分被1μm的黄芩素抑制。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图16表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.01mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.14μm)的聚集完全被1μm的黄芩素抑制。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在黄芩素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图17表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集大部分被1μm的山柰酚抑制。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在山柰酚的存在下，由灰线(空心圆)表示。图18表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白A(0.1μm)的聚集完全被1μm的山柰酚抑制。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在山柰酚的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图19表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白B(0.06μm)的聚集大部分被1μm的白藜芦醇抑制。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在白藜芦醇的存在下，由灰线(空心圆)表示。图20表示在pH7.4中由Zn2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集被1μm的白藜芦醇大大抑制。根据Zn2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在白藜芦醇的存在下，由灰线(空心圆)表示。图21表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集大部分被1μm的表没食子儿茶素3-没食子酸酯抑制。根据Cu2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在表没食子儿茶素3-没食子酸酯的存在下，由灰线(空心圆)表示。图22表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集完全被1μm的表没食子儿茶素3-没食子酸酯抑制。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在表没食子儿茶素3-没食子酸酯的存在下，由灰线(空心圆)表示。图23表示在pH7.4中由Cu2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白A(0.1μm)的聚集大部分被1μm的虫草素抑制。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在虫草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图24表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集被1μm的虫草素大大抑制。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在虫草素的存在下，由灰线(空心圆)表示。图25表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的嗜铬粒蛋白A(0.1μm)的聚集完全被1μm的酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478抑制。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478的存在下，由灰线(空心圆)表示。图26表示在pH7.4中由Fe2+诱导的0.005mg/ml的分泌粒蛋白Ⅱ(0.07μm)的聚集完全被1μm的酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478抑制。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478的存在下，由灰线(空心圆)表示。图27表示在0.2mM的Fe2+存在下嗜铬粒蛋白B的流体力学状态的分布图。由金属诱导的颗粒蛋白的聚集状态下的流体力学分布图在0.2mM的Fe2+存在下使用动态光散射方法(pH7.4)测定嗜铬粒蛋白B(0.5mg/ml)的分布。在此溶液状态下，嗜铬粒蛋白B大部分(72.3％)以高分子聚集体状态存在，27.7％以低分子低聚物(oligomer)状态存在。在金属离子的存在下，其他颗粒蛋白也表示几乎类似的分布。该结果确认图5至图10所示的由金属离子诱导的颗粒蛋白的聚集。
如图11至图26和图36至图49所示，呈现由金属离子诱导的颗粒蛋白聚集的抑制效果的其他类黄酮、芪类化合物及分子在细胞毒性实验中也呈现与抑制毒性相似的结果，这表明这些抑制分子是对阿尔茨海默病的强有力的治疗剂候选物质。
实施例2
颗粒蛋白的流体力学特性实验
分子动态光散射：为了掌握颗粒蛋白在条件不同的溶液中是以低分子单体-低聚物(monomer-oligomer)状态存在还是以高分子聚集体状态存在，利用怀雅特技术(WyattTechnology)(Santa BarbarA，CA)公司的DynaPro NanoStar在24℃下进行颗粒蛋白的动态光散射实验，利用公司提供的Dynamics 7.5.0程序分析其结果。
图28表示在Fe2+和类黄酮之一的黄芩素的存在下嗜铬粒蛋白B的流体力学状态的分布图。由金属诱导的颗粒蛋白的聚集状态下的流体力学分布图在0.2mM的黄芩素和0.2mM的Fe2+存在下使用动态光散射方法(pH7.4)测定嗜铬粒蛋白B(0.5mg/ml)(6μM)的分布。非常特异性地，在0.2mM的Fe2+存在下，嗜铬粒蛋白B大部分(94.7％)也以低分子低聚物状态存在，只有5.3％以大聚集体状态存在。这表明黄芩素不仅阻断嗜铬粒蛋白B分子相结合，如图27所示，使高分子聚集体状态的嗜铬粒蛋白分离为低分子低聚物状态。该结果与图11至图26和图36至图49的结果相一致，说明类黄酮分子、芪类化合物分子和其他分子抑制由金属离子诱导的颗粒蛋白的聚集的理由。
实施例3
细胞毒性实验
在该实验中，将为了试验由颗粒蛋白诱发的阿尔茨海默病发病的治疗效果而选择的几种物质及因子投入鼠中。投入的物质为类黄酮、芪类化合物及其他分子。
MTT细胞毒性实验：使用英杰(Invitrogen)公司(U.S.A.)的MTT细胞增殖试验试剂盒以50000的PC12细胞/well通过已知的方法(Cheruvara et al.,2015；Shearman et al.,1994)进行细胞毒性实验。该分析方法用于测定细胞引起的MTT色素的减少，在570nm的波长中将颜色的变化利用为细胞的活性度指数，细胞越健康，颜色的变化越大。
图50表示当20μm的Cu2+和1μM的细胞毒性抑制剂木犀草素存在时，各个颗粒蛋白呈现的细胞毒性。即，通过PC12细胞和MTT分析方法测定在20μm的Cu2+和1μm的木犀草素的存在下各个颗粒蛋白(0.1μm的嗜铬粒蛋白A、0.06μm的嗜铬粒蛋白B、0.07μm的分泌粒蛋白Ⅱ)呈现的细胞毒性(Cheruvara et al.,2015；Shearman et al.,1994)。抑制因金属而聚集的颗粒蛋白的(参照图13、图14)毒性的抑制剂之一的木犀草素阻断颗粒蛋白的毒性。
为了试验对因颗粒蛋白毒性而发病的阿尔茨海默病的这些分子作为治疗剂的功效，将4种分子同时给药到鼠。在各组中，利用由7至9只Wistar大鼠(rats)组成的4组鼠调查阿尔茨海默病发病的颗粒蛋白的作用和阿尔茨海默病治疗剂候选分子的功效，通过注入管向脑室(intracerebroventricle)注入颗粒蛋白和治疗剂候选物质。组1(调节组)：将1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)注入于鼠脑室(7只)；组2(颗粒蛋白)：将1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)中分别包含0.1μm的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ的颗粒蛋白溶液注入于鼠脑室(9只)；组3(颗粒蛋白+金属离子)：在分别包含0.1μm的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ的颗粒蛋白溶液中添加0.8mM的Cu2+、250μm的Fe2+、2m M的Zn2+，将所有放入1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)来注入于鼠脑室(9只)；组4(颗粒蛋白+金属离子+4种类黄酮和芪类化合物分子)：在分别包含0.1μm的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ、0.8mM的Cu2+、250μm的Fe2+、2mM的Zn2+的溶液中分别以1μm添加4种类黄酮和芪类化合物分子，将所有放入1μl的缓冲液(2mM的MOPS，pH7.4)来注入于鼠脑室(8只)。
该结果表明预防或抑制颗粒蛋白聚集的金属隔离去除剂和/或其他分子可阻断或预防金属引起的颗粒蛋白的聚集(图5至图10)来开发为阿尔茨海默病的治疗药。实际上，类黄酮、芪类化合物和其他几种特定分子阻断或抑制金属引起的颗粒蛋白的聚集(图11至图26、图36至图49)，进而，证明对预防细胞(图50)和大鼠的脑中(图30至图35、图51至图59)颗粒蛋白的毒性非常有效。并且，在动态光散射实验中指出金属离子将低分子低聚物状态的颗粒蛋白转换为高分子聚集体(图27)，确认到类黄酮分子和其他分子的作用为阻断低分子单体-低聚物状态的颗粒蛋白转换为高分子状态，并且，使颗粒蛋白从高分子聚集体分离为低分子单体-低聚物状态(图28)。
实施例4
动物实验
以下描述的实验表明阻断从颗粒蛋白的低分子状态到高分子聚集状态的变换的本发明中指出的物质和组合物分子可用作阿尔茨海默病和神经退行性疾病的治疗剂。
材料和方法
动物实验：购买重量为～280-300g的8周龄Wistar大鼠，将其收容于无特定病原体(specific pathogen free，SPF)动物室中，并严格遵守美国国立卫生研究院(NIH)的规定和条件来使用。
以立体定位(stereotaxic)技术注入于鼠的脑室(intracerebrovent ricle)中：在本实验中，将购买于英维沃(Invivo)公司1(VA，U.S.A.)的引导套管(guide cannula)投入于鼠脑的特定部位，即，从脑中心线(从鼻子到尾部)向右侧离2mM，从前囟(bregma)线向尾部离0.8mM且位于脑组织的2.9mM的深度。注入套管从引导套管的末端向脑侧室(lateralventricle)一侧多暴露0.5mM。颗粒蛋白分子或测试分子的最初注入为将这些分子放入1μl的2mM MOPS(pH7.4)中，当鼠为3个月时注入于上面提及的右侧脑室中，一周后进行第二次注入。对照组鼠在与实验组相同的时期注入1μl的2mM M OPS(pH7.4)。
学习能力和记忆力试验：为了了解注入的颗粒蛋白分子在鼠中呈现的效果，利用莫里斯水迷宫实验试验各个鼠的学习能力和记忆力。水槽的直径为135cm，深度为23cm，并且，将直径为12cm的逃避台设置于4等分的水槽的一侧，即，离水槽壁15cm的位置。当鼠为19-20周(4.5个月)时，试验各个鼠的学习能力。为此，在各组中，使每7只鼠在出生后18周-19周之间7-8天期间将水槽中通过游泳寻找逃避台而避开的训练进行5次(隔一两天一次)。训练之后，使逃避台沉浸在从呈牛奶色的水表面向下离1.5cm(水总深度为24.5cm)的位置而被隐藏，测定鼠寻找该逃避台的时间。将各个鼠寻找被隐藏的逃避台的时间用作各个鼠的学习能力的标准。在记忆力试验中，为了可使各个鼠记住逃避台的位置，使各个鼠每日一次3天寻找逃避台来使它们记住其位置之后，将水槽旋转180度使被隐藏的逃避台周围环境与训练时不同有180度的变化。当在被改变的环境中使各个鼠寻找被隐藏的逃避台时，容易记住逃避台的原来位置的鼠为了在原来位置寻找而游泳很久，以此度过时间，但掌握一次新的位置之后，下一次试图时，在更短的时间内寻找。将各个鼠寻找新的位置的逃避台的时间用作各个鼠的记忆力标准。
图29表示头部设有注入管的鼠和表示注入地点的头部截面。(右侧)鼠的脑室由蓝色表示，注入管的位置由灰色表示。图30表示在莫里斯水迷宫试验中各组的鼠寻找所需的时间，与标准偏差一同表示平均时间(秒)(n为属于各组的鼠的数量)。组1和组4的鼠寻找逃避台所需时间为7-8秒，组2的鼠寻找逃避台所需时间为27秒，组3的鼠寻找逃避台所需时间为37秒。尤其，即使颗粒蛋白和金属离子与治疗剂候选分子一同注入，组4的鼠在7-8秒内寻找逃避台。这些结果表明类黄酮分子和芪类化合物分子完全阻断颗粒蛋白带给鼠的毒性-作为阿尔茨海默病的典型症状的学习能力和记忆力抑制。
图31表示各组鼠的代表性游泳轨迹。左侧上端的数字为组号，痕迹(trace)为各组鼠的游泳轨迹。下端左侧的小圆为开始游泳的地点，右侧上端的大圆表示逃避台。
图32表示寻找逃避台所需的时间。表示使鼠充分熟悉逃避台的位置之后，将逃避台的位置180度改变，对于鼠寻找逃避台的时间，在经3次的试验中试验一次之后，直到下一次试验为止隔一天3次所需的时间。数字为各组号，与标准偏差一同表示鼠寻找所需的平均时间(秒)。特别的是，组1和组4的鼠在第一次试图中用了40秒以上的长时间，但自从得知逃避台移到新的位置之后，寻找逃避台的时间更缩短，在第三次试图中，只用了6-8秒。但是，组2和组3的鼠在第一次试图中用了21-32秒，而在第三次试图中也用了16-25秒，这表示记忆力差。
图33表示各组鼠的代表性游泳轨迹。左侧上端为组号，粉色表示游泳轨迹。右侧上端的小圆为开始游泳的地点，左侧下端的大圆表示逃避台。该结果表明组1和组4的鼠具有非常好于组2和组3的鼠的记忆力，不仅明确呈现注入的颗粒蛋白的毒性(神经退行性作用)，还呈现作为这些颗粒蛋白诱发的神经退行性的抑制剂(治疗剂候选)注入的类黄酮和芪类化合物分子的强有力的功效。
图34表示注入颗粒蛋白的鼠的一部分具有异常姿势。组3的一部分鼠在注入颗粒蛋白和金属离子(Cu2+、Zn2+、Fe2+)2周后开始呈现颈部倾斜的状态，组2的一部分鼠在注入颗粒蛋白之后4-5周后开始呈现颈部倾斜的状态。但是，组1和组4的鼠均在18个月之后直到牺牲为止维持正常的姿势和健康的状态。
图35表示组2(注入颗粒蛋白)的颈部倾斜的鼠中海马(右侧一半)减少。使组2的鼠中颈部倾斜的鼠在注入颗粒蛋白10周之后(出生后6个月，颈部倾斜之后6周)牺牲来调查脑组织。惊讶地观察到担当学习和记忆力的海马的右侧一半比左侧显著减少。这些鼠的右侧脑室也是注入颗粒蛋白的位置(参照图29)。在阿尔茨海默病的典型症状中，即使考虑包括海马的整个脑减少，颗粒蛋白在那么短的时间(注入颗粒蛋白之后10周)内使年轻鼠(出生后6个月)的脑显著减少是出乎意料的。
根据上面提及的实验和结果，指出1)颗粒蛋白为阿尔茨海默病的发病原因分子，2)Cu2+、Zn2+和Fe2+之类的金属离子在脑中诱发颗粒蛋白的聚集而作用为阿尔茨海默病发病的辅因子，3)类黄酮分子、芪类化合物分子及这些分子的衍生物和特定其他分子具有阻断并抑制颗粒蛋白的聚集或使高分子状态的聚集体分离为低分子状态的功能，是阿尔茨海默病的治疗剂候选物质，并且指出4)类黄酮分子和芪类化合物分子是在鼠中阻断阿尔茨海默病之类的症状的因子。
根据上面实验和结果，揭示以下因子可用作阿尔茨海默病和神经退行性疾病的治疗剂。1)在脑中阻断或抑制Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+之类的金属离子的增加的分子或因子，2)与颗粒蛋白相结合来阻断或抑制颗粒蛋白的聚集的包含自然产物、蛋白质、核酸等的所有分子，3)可从颗粒蛋白中去除金属离子的金属离子隔离去除剂和因子。
实施例5
体外(in vitro)、体内(in vivo)实验
材料和方法
材料：从牛肾上腺的分泌颗粒中纯化作为主要颗粒蛋白的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B和分泌粒蛋白Ⅱ(Park et al.,2002；Yoo,1995；Yoo and Albanesi,1990)。Chelex 100购买于伯乐公司(U.S.A)，其他试剂也使用纯度最高的。
聚集实验：聚集实验之前，需要去除在颗粒蛋白的纯化过程中结合的金属离子来分离颗粒蛋白聚集体，广泛使用作为金属离子去除剂的Chelex 100(伯乐公司，U.S.A)。为了由金属诱导的聚集实验，处理Chelex 100，在2mM的MOPS、溶解于pH7.4的嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B或分泌粒蛋白Ⅱ中一点点增加CuCl2、FeCl2及ZnCl2之类的金属离子来进行添加。使用贝克曼分光器测定浊度变化观察聚集，所有测定在24℃下进行。
分子动态光散射：为了掌握颗粒蛋白在不同条件的溶液中是以低分子单体-低聚物状态存在还是以高分子聚集体状态存在，利用怀雅特技术(Santa BarbarA，CA)公司的DynaPro NanoStar在24℃下进行颗粒蛋白的动态光散射实验，利用公司提供的Dynamics7.5.0程序分析其结果。
动物实验：购买重量为～280-300g的8周龄Wistar大鼠，将其收容于无特定病原体动物室中，并严格遵守美国国立卫生研究院(N IH)的规定和条件来使用。
以立体定位技术注入于鼠的脑室(intracerebroventricle)中：在本实验中，将购买于英维沃公司1(VA，U.S.A.)的引导套管投入于鼠脑的特定部位，即，从脑中心线向右侧离2mM，从前囟线向尾部离0.8mM且位于脑组织的2.9mM的深度。注入套管从引导套管的末端向脑侧室(lateral ventricle)一侧多暴露0.5mM。颗粒蛋白分子或测试分子的最初注入为将这些分子放入1μl的2mM MOPS(pH7.4)中，当鼠为3个月时注入于上面提及的右侧脑室中，一周后进行第二次注入。对照组鼠在与实验组相同的时期注入1μl的2mM MOPS(p H7.4)。
学习能力和记忆力试验：为了了解注入的颗粒蛋白分子在鼠中呈现的效果，利用莫里斯水迷宫实验试验各个鼠的学习能力和记忆力。水槽的直径为135cm，深度为23cm，并且，将直径为12cm的逃避台设置于4等分的水槽的一侧，即，离水槽壁15cm的位置。当鼠为19-20周(4.5个月)时，试验各个鼠的学习能力。为此，在各组中，使每7只鼠在出生后18周-19周之间7-8天期间将水槽中通过游泳寻找逃避台而避开的训练进行5次(隔一两天一次)。训练之后，使逃避台沉浸在从呈牛奶色的水表面向下离1.5cm(水总深度为24.5cm)的位置而被隐藏，测定鼠寻找该逃避台的时间。将各个鼠寻找被隐藏的逃避台的时间用作各个鼠的学习能力的标准。在记忆力试验中，为了可使各个鼠记住逃避台的位置，使各个鼠每日一次3天寻找逃避台来使它们记住其位置之后，将水槽旋转180度使被隐藏的逃避台周围环境与训练时不同有180度的变化。当在被改变的环境中使各个鼠寻找被隐藏的逃避台时，容易记住逃避台的原来位置的鼠为了在原来位置寻找而游泳很久，以此度过时间，但掌握一次新的位置之后，下一次试图时，在更短的时间内寻找。将各个鼠寻找新的位置的逃避台的时间用作各个鼠的记忆力标准。
脑的组织化学实验：为了调查注入颗粒蛋白的鼠的脑，取出脑来薄地切开之后，进行染色。
结果
Zn2+使嗜铬粒蛋白B聚集被芹菜素阻断。图36表示Zn2+使嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)聚集大部分被1μm的芹菜素抑制(pH7.4)。根据Zn2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在芹菜素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Cu2+使嗜铬粒蛋白A聚集被芹菜素阻断。图37表示Cu2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集完全被1μm的芹菜素抑制(p H7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在芹菜素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白B聚集被桔皮素阻断。图38表示Fe2+使嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)(0.06μm)聚集完全被1μm的桔皮素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在桔皮素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Cu2+使嗜铬粒蛋白A聚集被桔皮素阻断。图39表示Cu2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集被1μm的桔皮素显著抑制(p H7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在桔皮素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Cu2+使嗜铬粒蛋白B聚集被槲皮素阻断。图40表示Cu2+使嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)(0.06μm)聚集完全被1μm的槲皮素抑制(p H7.4)。根据Cu2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在槲皮素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使分泌粒蛋白Ⅱ聚集被槲皮素阻断。图41表示Fe2+使分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μm)聚集完全被1μm的槲皮素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在槲皮素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白A聚集被漆黄素阻断。图42表示Fe2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集完全被1μm的漆黄素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在漆黄素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使分泌粒蛋白Ⅱ聚集被漆黄素阻断。图43表示Fe2+使分泌粒蛋白Ⅱ(0.005mg/ml)(0.07μm)聚集完全被1μm的漆黄素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的分泌粒蛋白Ⅱ的聚集由黑线(实心圆)表示，在漆黄素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白A聚集被杨梅素阻断。图44表示Fe2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集完全被1μm的杨梅素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在杨梅素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白B聚集被杨梅素阻断。图45表示Fe2+使嗜铬粒蛋白B(0.005mg/ml)聚集完全被1μm的杨梅素抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白B的聚集由黑线(实心圆)表示，在杨梅素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白A聚集被桑色素阻断。图46表示Fe2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集完全被1μm的桑色素抑制(p H7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在桑色素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Zn2+使嗜铬粒蛋白A聚集被桑色素阻断。图47表示Zn2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集大部分被1μm的桑色素抑制(pH7.4)。根据Zn2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在桑色素的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Zn2+使嗜铬粒蛋白A聚集被5,7-二甲氧基黄酮阻断。图48表示Z n2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集大部分被1μm的5,7-二甲氧基黄酮抑制(pH7.4)。根据Zn2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在5,7-二甲氧基黄酮的存在下，由灰线(空心圆)表示。
Fe2+使嗜铬粒蛋白A聚集被5,7-二甲氧基黄酮阻断。图49表示F e2+使嗜铬粒蛋白A(0.005mg/ml)(0.1μm)聚集完全被1μm的5,7-二甲氧基黄酮抑制(pH7.4)。根据Fe2+浓度增加的嗜铬粒蛋白A的聚集由黑线(实心圆)表示，在5,7-二甲氧基黄酮的存在下，由灰线(空心圆)表示。
图50表示当20μm的Cu2+和1μm的细胞毒性抑制剂木犀草素存在时，各个颗粒蛋白呈现的细胞毒性。即，使用PC12细胞通过MT T分析方法测定在20μm的Cu2+和1μm的木犀草素的存在下各个颗粒蛋白(0.1μm的嗜铬粒蛋白A、0.06μm的嗜铬粒蛋白B、0.07μm的分泌粒蛋白Ⅱ)呈现的细胞毒性(Cheruvara et al.,2015；Shearman et al.,1994)。抑制因金属而聚集的颗粒蛋白的毒性的抑制剂之一的木犀草素阻断颗粒蛋白的毒性。抑制金属离子引起的颗粒蛋白的聚集的其他类黄酮、芪类化合物和其他分子(参照图11至图26、图36至图49)在细胞毒性实验中也呈现几乎相似的结果，这表明这些抑制分子是阿尔茨海默病治疗剂的强有力的候选物质。
图51表示各个物质注入脑室之后，当2.5个月时，在莫里斯水迷宫试验中各组的鼠寻找逃避台所需的时间，与标准偏差一同表示平均时间(秒)(n为属于各组的鼠的数量)。组1和组4的鼠寻找逃避台的时间为6.0至6.5秒，组2的鼠寻找逃避台的时间为16.8秒，组3的鼠寻找逃避台的时间为13.3秒。这暗示组3的鼠相比于组2的鼠，从颗粒蛋白的毒性中更快速恢复。这些结果表明类黄酮分子和芪类化合物分子在注入颗粒蛋白之后第2.5个月已完全阻断颗粒蛋白对鼠的毒性-作为阿尔茨海默病的典型症状的学习能力和记忆力的损伤-表达。
图52表示图51所示的各组鼠的代表性游泳轨迹。左侧上端为组号，追踪线表示游泳轨迹。左侧下端的小圆为开始游泳的地点，右侧上端的大圆表示逃避台。
图53和图54表示10.5个月的患有阿尔茨海默病症状的鼠和无阿尔茨海默病症状的鼠的海马的截面。图53表示用苏木精(haemat oxylin)染色10.5个月(注入颗粒蛋白之后7.5个月)的脑的截面，是比较调节组(组1)、颗粒蛋白注入组(组2)、颗粒蛋白和金属离子注入组(组3)、颗粒蛋白、金属离子及聚集解体分子注入组(组4)鼠的海马的。组2的鼠的海马被观察到表示死亡的脑细胞的多数、大且空旷的空间，组3的鼠的海马也被观察到大且空旷的空间。但是，调节组(组1)鼠的海马中观察到极少数的小空间，这表明脑细胞死亡数相对少。相反，组4的鼠的海马中脑内空旷的空间不多，其数极少于对照组海马，这表明组4的鼠的海马比自然老化的对照组的脑海马保存得更好。图54为图53所示的海马的类似区域的高分辨率照片(比例尺＝100μm)。
图55表示10.5个月的患有阿尔茨海默病症状的鼠和无阿尔茨海默病症状的鼠的皮质的截面。用苏木精染色10.5个月的脑的截面，是比较调节组(组1)、颗粒蛋白注入组(组2)、颗粒蛋白和金属离子注入组(组3)、颗粒蛋白、金属离子及聚集解体分子注入组(组4)鼠的皮质的。组2的鼠的皮质被观察到表示死亡的脑细胞的多数、大且空旷的空间，组3的鼠的皮质也被观察到大且空旷的空间。如海马中，调节组(组1)鼠的皮质中观察到极少数的小空间，这表明脑细胞死亡数相对少。相反，组4的鼠的皮质中脑内空旷的空间不多，其数极少于对照组皮质，这表明组4的鼠的皮质比自然老化的对照组的脑皮质保存得更好。图54为图53所示的皮质的类似区域的高分辨率照片(比例尺＝100μm)。
图56表示10.5个月的患有阿尔茨海默病症状的鼠和无阿尔茨海默病症状的鼠脑组织的密度比较。表明患有阿尔茨海默病症状的鼠和无阿尔茨海默病症状的鼠脑组织的密度有显著差异。出现阿尔茨海默病症状的鼠(组2和组3)的脑组织密度比调节组减少约10-25％左右。但是，组4的鼠反而比调节组增加约3-4％，这表明与颗粒蛋白、金属离子一同注入的聚集解体剂分子完整地保存脑细胞，以至于抑制正常老化引起的细胞的减少(凋亡)。其结果，4次测定皮质和海马的各不相同的区域以平均值和标准偏差表示与调节组的相对值。
图57表示使用嗜铬粒蛋白A抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马，染色各组鼠的海马进行比较。脑的皮质和海马被观察到包含嗜铬粒蛋白A的很多老年斑，相比于组3和组4的鼠，组1和组2的鼠的脑被观察到包含更多数的嗜铬粒蛋白A的老年斑，但组1的鼠的老年斑显著小。但是，组2和组3的包含嗜铬粒蛋白A的老年斑和脑组织中的孔显著大于组1和组4。组3的鼠的脑中包含颗粒蛋白的特别大的老年斑多，尤其，像被隔离在大孔中的形状多。相反，组4的鼠中包含嗜铬粒蛋白A的老年斑稀少，脑组织也比调节组孔少，保存得更好(比例尺＝50μm)。
图58表示使用嗜铬粒蛋白B抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马，染色各组鼠的海马进行比较。脑的皮质和海马被观察到包含嗜铬粒蛋白B的很多老年斑，相比于组3和组4的鼠，组1和组2的鼠的脑被观察到包含更多数的嗜铬粒蛋白B的老年斑，但组1的鼠的老年斑显著小。但是，组2和组3的包含嗜铬粒蛋白B的老年斑和脑组织中的孔显著大于组1和组4。组3的鼠的脑中包含颗粒蛋白的特别大的老年斑多，尤其，像被隔离在大孔中的形状多。相反，组4的鼠中，与从嗜铬粒蛋白A获得的结果相似地，包含嗜铬粒蛋白B的老年斑稀少，脑组织也比调节组孔少，保存得更好(比例尺＝50μm)。
图59表示使用分泌粒蛋白Ⅱ抗体免疫染色10.5个月的鼠的海马，染色各组鼠的海马进行比较。脑的皮质和海马被观察到包含分泌粒蛋白Ⅱ的很多老年斑，相比于组3和组4的鼠，组1和组2的鼠的脑被观察到包含更多数的分泌粒蛋白Ⅱ的老年斑，但组1的鼠的老年斑显著小。但是，组2和组3的包含分泌粒蛋白Ⅱ的老年斑和脑组织中的孔显著大于组1和组4。组3的鼠的脑中包含颗粒蛋白的特别大的老年斑多，尤其，像被隔离在大孔中的形状多。相反，组4的鼠中，与利用其他颗粒蛋白获得的结果相似地，包含分泌粒蛋白Ⅱ的老年斑稀少，脑组织也比调节组孔少，保存得更好(比例尺＝50μm)。
图60表示11.5个月的患有阿尔茨海默病症状的鼠和无阿尔茨海默病症状的鼠的活动性的比较。鼠的活动性利用旋转轮(spinning w heel)测定，测定各个鼠一边使轮子旋转一边活动的时间。补充地，当将旋转轮向前或向后移动90度时，鼠为了不滑倒继续附着于轮子而努力的时间也被视为活动时间。对照组(组1)鼠在2分钟的指定运动时间内活动17.5秒，但出现阿尔茨海默病症状的组2和组3的鼠分别活动11.2秒和14.2秒。注入颗粒蛋白聚集解体分子的组4的鼠活动更长于其他组的鼠的23.5秒。由平均值和标准偏差表示各组的每4只鼠分别在4次不同的试验中获得的时间。
本发明的结果表明颗粒蛋白诱发以下阿尔茨海默病之类的症状，以下为阿尔茨海默病的典型症状：1)学习能力下降，2)记忆能力下降，3)脑细胞的加速凋亡，4)脑中包含颗粒蛋白的老年斑形成的加速化，以及5)活动性减少。本结果表明通过将4种类黄酮分子和芪类化合物分子同时给药，可阻断鼠中颗粒蛋白诱发的阿尔茨海默病之类的症状。
一种用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物，其包含野黄芩素(scutellarein)、木犀草素(luteolin)、黄芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)、桔皮素(tangeretin)、杨梅素(myricetin)、漆黄素(fisetin)、桑色素(morin)、白藜芦醇(resveratrol)、表没食子儿茶素3-没食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)、虫草素(cordycepin)、5,7-二甲氧基黄酮(5,7-dimethoxyflavone)及酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478中的至少2个。
根据权利要求1的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少4个。
根据权利要求1的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求1的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求1的组合物，上述颗粒蛋白包含嗜铬粒蛋白A(c hromogranin A，CGA)、嗜铬粒蛋白B(chromogranin B，CGB)、分泌粒蛋白Ⅱ(secretograninⅡ)及分泌粒蛋白Ⅲ(secretograninⅢ)中的一种以上。
根据权利要求1的组合物，其还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂，上述制剂为金属蛋白(metalloproteins)、Zn2+结合及隔离分子(Zn2+binding and sequestering molecules)、酪蛋白(casein)、白蛋白(albumin)、锌指转录因子(zinc finger transcriptionfactors)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、Fe2+结合及隔离分子(Fe2+binding andsequestering molecules)、钙调蛋白(calmodulin)、肌钙蛋白(trop onin)、铁蛋白(ferritin)、转铁蛋白(transferrin)、乳铁蛋白(lac toferrin)及花色苷(anthocyanin)。
根据权利要求1的组合物，其还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求1的组合物，上述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
一种用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态的组合物，其包含i)选自野黄芩素(scutellarein)、木犀草素(luteolin)、黄芩素(baica lein)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、芹菜素(apig enin)、桔皮素(tangeretin)、杨梅素(myricetin)及漆黄素(fiseti n)中的花黄素(anthoxanthin)，ii)选自白藜芦醇(resveratrol)、白皮杉醇(piceatannolin)、银松素(pinosylvin)、紫檀芪(pterosti lbene)、白皮杉醇葡萄糖苷(astringin)及白藜芦醇苷(piceid)中的芪类化合物(stilbenoid)，iii)选自表没食子儿茶素3-没食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)、儿茶素(catechin)、没食子儿茶素(gallocatechin)、儿茶素3-没食子酸酯(catechin 3-gallate)、没食子儿茶素3-没食子酸酯(gallocatechin3-gallate)、表儿茶素(epi catechin)、表没食子儿茶素(epigallocatechin)、表儿茶素3-没食子酸酯(epicatechin 3-gallate)、茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-ga llate)、茶黄素-3’-没食子酸酯(theaflavin-3’-gallate)、茶黄素-3.3’-没食子酸酯(theaflavin-3,3’-gallate)、茶红素(thearubigin)及原花青素(proanthocyanidins)中的黄烷(flavan)及iv)选自虫草素(co rdycepin)、5,7-二甲氧基黄酮(5,7-dimethoxyflavone)及酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478中的化合物。
一种用于抑制颗粒蛋白与金属离子之间的相互作用的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。
根据权利要求10的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求10的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求10的组合物，上述颗粒蛋白包含嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ及分泌粒蛋白Ⅲ中的一种以上。
根据权利要求10的组合物，其还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
根据权利要求10的组合物，其还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求10的组合物，上述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
一种用于抑制颗粒蛋白与金属离子之间的相互作用的组合物，其包含i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)选自白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、紫檀芪、白皮杉醇葡萄糖苷及白藜芦醇苷中的芪类化合物，iii)选自表没食子儿茶素3-没食子酸酯、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯、茶黄素-3.3’-没食子酸酯、茶红素及原花青素中的黄烷及iv)选自虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的化合物。
一种用于治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的药学组合物，其包含用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物。
一种用于治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的药学组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。
根据权利要求19的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少4个。
根据权利要求19的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求19的组合物，其包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求19的组合物，上述颗粒蛋白包含嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ及分泌粒蛋白Ⅲ中的一种以上。
根据权利要求19的组合物，其还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
根据权利要求19的组合物，其还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求19的组合物，上述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态有效。
一种用于治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的药学组合物，其包含i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)选自白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、紫檀芪、白皮杉醇葡萄糖苷及白藜芦醇苷中的芪类化合物，iii)选自表没食子儿茶素3-没食子酸酯、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯、茶黄素-3.3’-没食子酸酯、茶红素及原花青素中的黄烷及iv)选自虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的化合物。
一种减少或抑制细胞毒性的方法，其包括将用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物给药的步骤。
一种减少或抑制细胞毒性的方法，其包括将用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物给药的步骤，上述组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯中的至少4个。
一种痴呆或阿尔茨海默病的治疗或预防方法，其包括将用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的药学组合物的有效量给药的步骤，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少2个。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少4个。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物包含嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ及分泌粒蛋白Ⅲ中的一种以上的颗粒蛋白。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
根据权利要求30的方法，上述药学组合物还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求30的方法，上述方法在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
一种治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的方法，上述方法包括将药学组合物的有效量给药的步骤，上述药学组合物包含i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)选自白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、紫檀芪、白皮杉醇葡萄糖苷及白藜芦醇苷中的芪类化合物，iii)选自表没食子儿茶素3-没食子酸酯、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯、茶黄素-3.3’-没食子酸酯、茶红素及原花青素中的黄烷及iv)虫草素、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478及5,7-二甲氧基黄酮。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少4个。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物包含嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ及分泌粒蛋白Ⅲ中的一种以上的颗粒蛋白。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
根据权利要求38的方法，上述药学组合物还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求38的方法，上述方法在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态有效。
一种用于治疗或预防对象的痴呆或阿尔茨海默病的方法，其包括将药学组合物的有效量给药的步骤，上述药学组合物包含一种以上在对象的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的至少4个。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇及表没食子儿茶素3-没食子酸酯。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物包含嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、分泌粒蛋白Ⅱ及分泌粒蛋白Ⅲ中的一种以上的颗粒蛋白。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物还包含在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离选自Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的金属离子的一种以上的制剂。
根据权利要求46的方法，上述药学组合物还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂(chelator)。
根据权利要求46的方法，上述方法在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态有效。
一种筛选阿尔茨海默病的药物候选的方法，上述方法包括阻断和/或抑制从选自Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的金属离子诱导的一种以上的颗粒蛋白的聚集，或基于使聚集的颗粒蛋白解离的能力选择为药物候选的步骤。
本发明中描述的内容包括发明所需的本发明人熟知的最佳方法。当然，这些内容的变形对于具有读取本发明的内容的常规技术的经验者来说是明确的。本发明人视为具有一般经验的技术人员可进行这种适当的变形，能够以本发明中说明的内容以上被应用。因此，本发明包括与相关法律允许的所有变形或修改和请求事项中描述的内容相应的一切内容。进而，除非是例外明确被认定或被指出的情况，根据本发明的内容的所有可变形或变形的组合也包括在本发明的内容。
不应将在大标题下对本发明的大体说明、重要因素(elements)或方法和步骤(step)进行分组(grouping)解释为本发明的限制。各组成员分别指出或与其他组的成员组合指出。因此，为了便利性和/或专利特性，一个组的一个或其以上的成员可包括在一个组或除外。当包括或除外时，视为组满足马库什组方式的条件而使用。
除非特别提及，表示本发明的条件说明和请求事项的特征、项目、分量、参数、特性、条件等的所有数字在所有情况下以大致(about)的值理解即可。此时，大致(about)这一术语表示特征、项目、分量、参数、特性、条件等的数值包括相当于指定值以上10％且以下10％的范围的值。因此，本发明中指定的数值(numerical parameters)为允许这种变形的大致值。因此，表示本请求事项的范围的数值适用有效数字值和四舍五入的方式理解即可。这些数值为大概值，但尽可能准确地描述。但是，有可能存在内在的实验上误差，从而尽可能表示误差范围，本发明的说明中表示各个值。
描述本发明时使用的“a”、“an”和“the”除非特别区别，则使用为均包括单数和复数。描述的方法也除非特别指定，则还可按任何适当的顺序执行。本发明中描述的一部分及所有例(examples)或“之类的(such as)”这些术语用于更好地说明本发明，并不限制发明的范围。本发明的说明中使用的术语并不指本发明的实施例必须的未请求的因素。
本发明的详细内容还可由请求事项中“由～构成的”或“由～必要地形成的”之类的表现进一步限制。当在请求事项中使用时，“由～构成的”这一术语将请求事项中不特别指定的因素、步骤或成分除外。另一方面，“由～必要地形成的”这一术语表示在不改变物质的根源性及特异性的情况下，请求的内容指特定物质或步骤。请求的本发明的内容以根源性地且可明确的方式表现。
所有专利、专利出版物及其他出版物在本发明的说明中以个别且分明的方式被参考并得到鉴定(identification)，其目的在于，介绍本发明相关这些出版物中介绍的组合物分子及方法。这些出版物在本发明的申请日之前仅以告知这些的存在的目的提供。因此，不应被解释为这些的介绍认定本发明人的发明不领先于这些。这些出版物的出版日或内容依据本申请人已知的信息，并不是认定这些的内容或出版日准确。
Claims (17)
1.一种用于抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态的组合物，其特征在于，包含从下组i)至iv)中各选至少一个化合物的至少4个化合物，
其中所述至少4个化合物被选择以抑制由Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+诱导的所有嗜铬粒蛋白A(CGA)、嗜铬粒蛋白B(CGB)、分泌粒蛋白II(SgII)和分泌粒蛋白III(SgIII)的聚集，
i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)白藜芦醇，iii)表没食子儿茶素3-没食子酸酯及iv)选自虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、白藜芦醇、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、表没食子儿茶素3-没食子酸酯以及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂，所述制剂为金属蛋白、Zn2+结合及隔离分子、酪蛋白、白蛋白、锌指转录因子、铜蓝蛋白、Fe2+结合及隔离分子、钙调蛋白、肌钙蛋白、铁蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白及花色苷。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
7.一种用于抑制颗粒蛋白与金属离子之间的相互作用的组合物，其特征在于，包含从下组i)至iv)中各选至少一个化合物的至少4个化合物，
其中所述至少4个化合物被选择以抑制由Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+诱导的所有嗜铬粒蛋白A(CGA)、嗜铬粒蛋白B(CGB)、分泌粒蛋白II(SgII)和分泌粒蛋白III(SgIII)的聚集，
i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)白藜芦醇，iii)表没食子儿茶素3-没食子酸酯及iv)选自虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的化合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
10.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂。
11.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
12.一种用于治疗或预防痴呆或阿尔茨海默病的药学组合物，其特征在于，包含从下组i)至iv)中各选至少一个化合物的至少4个化合物，
其中所述至少4个化合物被选择以抑制由Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+诱导的所有嗜铬粒蛋白A(CGA)、嗜铬粒蛋白B(CGB)、分泌粒蛋白II(SgII)和分泌粒蛋白III(SgIII)的聚集，
i)选自野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素及桑色素中的花黄素，ii)白藜芦醇，iii)表没食子儿茶素3-没食子酸酯及iv)选自虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478中的化合物。
13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯以及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
14.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，包含野黄芩素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、槲皮素、芹菜素、桔皮素、杨梅素、漆黄素、桑色素、白藜芦醇、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、虫草素、5,7-二甲氧基黄酮及酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478。
15.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，还包含一种以上在动物的神经系统中减少、阻断、抑制或隔离Zn2+、Cu2+、Fe2+及Ca2+中的一种以上的制剂。
16.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，还包含选自Zn2+、Cu2+或Fe2+中的金属离子螯合剂。
17.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物在动物中对抑制颗粒蛋白从低分子量形态聚集为高分子量聚集形态和/或使高分子量聚集形态解离为低分子量形态有效。
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