CN111965341A - 一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法 - Google Patents

一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种基于葡聚糖的HRP‑羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法，所述方法包括，先制备环氧修饰葡聚糖，利用羊抗鼠IgG与HRP酶混合在碱性碳酸钠水溶液中与环氧修饰葡聚糖偶联反应，经过纯化、透析以及防腐处理后，得到基于葡聚糖偶联的HRP‑羊抗鼠IgG标记抗体，本发明的标记抗体相比现有技术的商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP‑羊抗鼠igG具有更高的灵敏性，可以避免检测不准确和灵敏度低的问题，具有良好的应用前景。

Description

一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法。
背景技术
随着生物技术的突飞猛进，不同的领域衍生了多种不同的检测手段，包括核酸检测、蛋白浓度检测、有害化学物质检测、生物传感器等，这些检测的主要原理是通过分子或者蛋白靶点相互特异性检测后，再通过指示器进行信号显示，根据标准品浓度对应的强度信号来绘制标准曲线，从而做到对待检测物质的定量分析。这些通过化学物质本身输出信号或者通过固定的酶催化输出信号，化学物质或者酶需要通过化学偶联的方法结合到检测组分的结构上，常用的结合方法非常直接，一般利用化学物质本身的活泼基团来进行结合，但因为受限于被标记物质本身的大小以及活泼基团的数量，偶联的发光化合物或酶的数量有限，输出的信号也很低，当被检测物质的含量极低时，信号往往检测不到，这就大大限制了检测结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种能够大幅度提高检测结果准确性的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将羊抗鼠IgG与HRP酶混合配置成总蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml的50-150mM碳酸钠水溶液；
步骤二、向步骤一所得碳酸钠水溶液中添加环氧修饰葡聚糖，并调节pH值为10-11，在37-45℃下反应1±0.5h，然后添加羟胺，保持37-45℃反应10-50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液；
步骤三、采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对步骤二所得含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部流出的产物进行检测，同时配合自动部分收集器，按照出峰顺序收集产物；
步骤四、将步骤三所收集的不同产物分别装入截留分子量为2000-4000D的透析袋中，使用PBS作为透析液，在3-5℃下透析8-12h，得到透析产物；
步骤五、使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，加水稀释控制浓度为0.1-0.5mg/ml，并添加1-2％的牛血清蛋白，50％的甘油和0.1-1％的防腐剂，在-15--25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤一中，所述羊抗鼠IgG与HRP酶的质量比为1：(10-100)。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的制备方法包括：选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1-10％的葡聚糖水溶液，采用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为11-12，然后添加环氧氯丙烷，在3-5℃下反应6-8h，反应完毕，用盐酸调节反应体系的pH值为2-4，调节完毕，将产物溶液用分子截留量1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，共更换3次，透析后得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液冷冻干燥得到环氧修饰葡聚糖。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述盐酸的浓度不超过50mM。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述环氧氯丙烷的用量为pH值为11-12的葡聚糖溶液质量的1-10％。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的0.1-1％。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述羟胺的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的1％。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤四中，所述PBS用量为步骤三中对应出峰段收集产物体积的10倍。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤四中，每透析2.5h更换一次透析液，共换液3次。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤五中，所述防腐剂为proclin300。
本发明提供一种采用上述制备方法制备得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
本发明的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法以及基于该方法制备得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明利用葡聚糖作为骨架，将抗体分子和酶偶联在葡聚糖骨架上，通过葡聚糖上的羟基与环氧乙烷结合，从而改性得到大量的环氧基和醛基，利用这些活性基团与发光物质结合，从而实现放大洗好的效果，放大的强度与偶联的分子数量成正比，葡聚糖产品分子量大小涵盖较广，可以选择不同分子量来设计不同大小的多聚物质，也可以控制权及数量来控制同一分子量下，偶联不同数量的检测分子，易于控制信号的强度；
(2)本发明提供了一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，制备步骤简单，所得产物应用效果良好，相对现有的酶标二抗而言，检测灵敏度更高，具有更好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用本发明的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体以及商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG显色对比图；
图2为采用本发明的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的IHC染色图；
图3为采用商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG的IHC染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备环氧修饰葡聚糖，选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1％的葡聚糖水溶液，用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为11，称取调节pH后的葡聚糖溶液的质量，加入相对葡聚糖溶液质量的1％的环氧氯丙烷，在3℃条件下反应6h，反应完毕，用20mM的盐酸调节反应体系的pH值为2，调节完毕，将产物溶液用分子街流量为1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，更换3次后，得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液进行冷冻干燥，得到环氧修饰葡萄糖。
将羊抗鼠IgG与HRP酶按照质量比为1:10进行混合，配置成蛋白浓度为0.5mg/ml的50mM碳酸钠水溶液。
向碳酸钠水溶液中加入其溶液质量的0.1％的环氧修饰葡聚糖，用碳酸钠和盐酸调节溶液pH值为10，在37℃下反应0.5h，然后添加碳酸钠水溶液质量的1％的羟胺，在37℃下继续反应10min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液。
采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部出料进行检测，进料采用恒流泵输入，按照出峰的位置进行产物的收集，并对不同出峰位置的产物进行单独存放，收集采用自动部分收集器进行收集。
将不同出峰位置的产物分别装入截留分子量为2000D的透析袋中，采用PBS作为透析液，PBS透析液用量为对应收集产物的体积的10倍，在3℃下进行透析，每2h更换一次透析液，共换液3次，透析8h，得到透析产物。
使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，通过加水稀释控制蛋白总浓度为0.1mg/ml，称量稀释后溶液的质量，添加溶液质量的1％的牛血清蛋白、50％的甘油和0.1％的proclin300，在-15℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
实施例2
制备环氧修饰葡聚糖，选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为5％的葡聚糖水溶液，用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为12，称取调节pH后的葡聚糖溶液的质量，加入相对葡聚糖溶液质量的5％的环氧氯丙烷，在4℃条件下反应7h，反应完毕，用30mM的盐酸调节反应体系的pH值为3，调节完毕，将产物溶液用分子街流量为1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，更换3次后，得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液进行冷冻干燥，得到环氧修饰葡萄糖。
将羊抗鼠IgG与HRP酶按照质量比为1:50进行混合，配置成蛋白浓度为1mg/ml的100mM碳酸钠水溶液。
向碳酸钠水溶液中加入其溶液质量的0.5％的环氧修饰葡聚糖，用碳酸钠和盐酸调节溶液pH值为11，在40℃下反应1h，然后添加碳酸钠水溶液质量的1％的羟胺，在40℃下继续反应30min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液。
采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部出料进行检测，进料采用恒流泵输入，按照出峰的位置进行产物的收集，并对不同出峰位置的产物进行单独存放，收集采用自动部分收集器进行收集。
将不同出峰位置的产物分别装入截留分子量为3000D的透析袋中，采用PBS作为透析液，PBS透析液用量为对应收集产物的体积的10倍，在4℃下进行透析，每2.5h更换一次透析液，共换液3次，透析10h，得到透析产物。
使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，通过加水稀释控制蛋白总浓度为0.3mg/ml，称量稀释后溶液的质量，添加溶液质量的1.5％的牛血清蛋白、50％的甘油和0.5％的proclin300，在-20℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
实施例3
制备环氧修饰葡聚糖，选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为10％的葡聚糖水溶液，用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为12，称取调节pH后的葡聚糖溶液的质量，加入相对葡聚糖溶液质量的10％的环氧氯丙烷，在5℃条件下反应8h，反应完毕，用40mM的盐酸调节反应体系的pH值为4，调节完毕，将产物溶液用分子街流量为1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，更换3次后，得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液进行冷冻干燥，得到环氧修饰葡萄糖。
将羊抗鼠IgG与HRP酶按照质量比为1:100进行混合，配置成蛋白浓度为1.5mg/ml的150mM碳酸钠水溶液。
向碳酸钠水溶液中加入其溶液质量的1％的环氧修饰葡聚糖，用碳酸钠和盐酸调节溶液pH值为11，在45℃下反应1.5h，然后添加碳酸钠水溶液质量的1％的羟胺，在35℃下继续反应50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液。
采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡萄糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部出料进行检测，进料采用恒流泵输入，按照出峰的位置进行产物的收集，并对不同出峰位置的产物进行单独存放，收集采用自动部分收集器进行收集。
将不同出峰位置的产物分别装入截留分子量为4000D的透析袋中，采用PBS作为透析液，PBS透析液用量为对应收集产物的体积的10倍，在5℃下进行透析，每3h更换一次透析液，共换液3次，透析12h，得到透析产物。
使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，通过加水稀释控制蛋白总浓度为0.5mg/ml，称量稀释后溶液的质量，添加溶液质量的2％的牛血清蛋白、50％的甘油和0.1％的proclin300，在-25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
采用实施例2中出峰最高的产物制备所得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体作为实验组，采用商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG抗体作为对照组，分别用于Elisa检测。
第一步：配置1μg/ml的CEA蛋白包被液，包被液用100mM碳酸铵pH9.5按照每孔加入到聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，然后用2％的牛血清蛋白进行封闭。
第二步：微孔板中，每孔分别添加不同浓度的鼠抗CEA抗体，添加样品浓度顺序分别为1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml，抗体稀释液采用含有2wt％BSA的Ph7.4的PBS溶液稀释。在37℃下反应1h。
第三步：添加300μLPBST缓冲液，清洗三次，分别加入实验组的抗体和对照组的抗体，使用浓度分别为50ng/ml和100ng/ml，在37℃下反应1h后，使用PBST缓冲液洗板3次，使用TMB显色。显色结果如图1所示，O1、O2为对照组在50ng/ml使用浓度下的情况，O3、O3为对照组在100ng/ml使用浓度下的情况，P1、P2为实验组在50ng/ml使用浓度下的情况，P3、P4为实验组在100ng/ml使用浓度下的情况，自上而下，鼠抗CEA抗体依次降低。
分别采用实施例2中出峰最高的产物制备所得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体作为实验组，采用商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG抗体作为对照组，用于IHC染色对比试验，图2为实验组染色结果，图3为对照组染色结果，染色结果可以看出，本发明的标记抗体染色效果更佳明显。
具体染色步骤包括：
1、准备好人乳腺癌组织切片两份；
2、向组织上滴加500μl的10％羊血清封闭液，在37℃下孵育1h；
3、弃掉封闭液，滴加配置好的第一抗体1μg/ml，在4℃条件下孵育12h；
4、用PBST缓冲液清洗组织切片，清洗3次；
5、分别向两份人乳腺癌组织切片上滴加基于葡聚糖的实施例2制备的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体和商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG抗体，在37℃下孵育1h；
6、用PBST缓冲液清洗组织片，清洗3次；
7、分别滴加DAB显色剂，显色10分钟；
8、用PBS洗掉显色剂，加入苏木精反蓝；
9、用水洗掉苏木精，干燥玻片，封片后牌照。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、将羊抗鼠IgG与HRP酶混合配置成总蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml的50-150mM碳酸钠水溶液；
步骤二、向步骤一所得碳酸钠水溶液中添加环氧修饰葡聚糖，并调节pH值为10-11，在37-45℃下反应1±0.5h，然后添加羟胺，保持37-45℃反应10-50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液；
步骤三、采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对步骤二所得含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部流出的产物进行检测，同时配合自动部分收集器按照出峰顺序收集产物；
步骤四、将步骤三所收集的不同产物分别装入截留分子量为2000-4000D的透析袋中，使用PBS作为透析液，在3-5℃下透析8-12h，得到透析产物；
步骤五、使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，加水稀释控制浓度为0.1-0.5mg/ml，并添加1-2％的牛血清蛋白，50％的甘油和0.1-1％的防腐剂，在-15--25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
2.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述羊抗鼠IgG与HRP酶的质量比为1：(10-100)。
3.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的制备方法包括：选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1-10％的葡聚糖水溶液，采用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为11-12，然后添加环氧氯丙烷，在3-5℃下反应6-8h，反应完毕，用盐酸调节反应体系的pH值为2-4，调节完毕，将产物溶液用分子截留量1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，共更换3次，透析后得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液冷冻干燥得到环氧修饰葡聚糖。
4.如权利要求3所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，所述环氧氯丙烷的用量为pH值为11-12的葡聚糖溶液质量的1-10％。
5.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的0.1-1％。
6.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述羟胺的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的1％。
7.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述PBS用量为步骤三中对应出峰段收集产物体积的10倍。
8.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤四中，每透析2.5h更换一次透析液，共换液3次。
9.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述防腐剂为proclin300。
10.权利要求1-9中任一所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法制备得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。
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傅叶勍 *

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