CN111956809A - 一种核酸类生物药物及其制备方法及其在肿瘤治疗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸类生物药物及其制备方法及其在肿瘤治疗的应用，核酸类生物药物包括Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr长余辉纳米颗粒和包含二茂铁人工碱基的核酸适配体，两者之间通过疏水相互作用连接，该核酸适配体通过互补配对再结合一条siRNA。核酸类生物药物应用于肿瘤的治疗，核酸适配体可以准确靶向肿瘤组织，通过核酸适配体的互补配对和化学修饰可以实现精准的基因治疗和氧化治疗，不对正常组织产生副作用，生物安全性高。

Description

一种核酸类生物药物及其制备方法及其在肿瘤治疗的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种核酸类生物药物及其制备方法，以及其在肿瘤治疗的应用。

背景技术

癌症又称为恶性肿瘤，近几十年已成为威胁人类生命健康的重大疾病之一。据报道2015年全国范围内约有281万人死于癌症，中晚期的癌症治疗对于人类更是一大难题。因此，开发精准、高效、稳定的癌症治疗技术对于保障人民群众身体健康、改善人民生活质量具有重要的意义。

现有技术中，有以下这些治疗方案和药物：

1)化疗药物：化疗药物是临床上应用非常广泛的抗癌手段，一般通过化学药物抑制肿瘤细胞的增殖过程来阻止肿瘤的生长，对肿瘤细胞具有较强的杀伤能力。但是化疗药物通过全身血液循环到达肿瘤组织，缺少靶向性，杀灭肿瘤细胞的同时也会杀死一些正常细胞，引起巨大的副作用。同时肿瘤细胞容易对化疗药物产生耐药性，减弱化疗药物的治疗效果，长期使用化疗手段容易使肿瘤复发。

2)小分子靶向药物：小分子靶向药物是一类能识别肿瘤细胞表面特殊位点的小分子化学药物，通过与肿瘤细胞表面特定位点结合或其他机制来阻止肿瘤细胞的生长、信号传导等过程，从而精准杀灭肿瘤细胞。然而小分子靶向药物只对部分细胞表面受体具有特定基因突变位点的肿瘤患者有效，对于非敏感性的患者人群仍需依赖化疗等非靶向手段，仍需面临化疗的副作用和耐药性问题。

3)基因治疗：基因治疗是近三十年发展起来的新兴治疗技术，它通过将外源正常基因引入肿瘤细胞，修复表达异常的肿瘤细胞基因，或者抑制肿瘤生长、繁殖相关基因的表达，从而治疗癌症。但是单一的基因治疗存在靶向性差等问题，严重限制了其疗效，因此基因治疗往往需要与其他治疗手段联合。

4)氧化治疗：氧化治疗包括光动力学、化学动力学等疗法，是利用活性氧破坏肿瘤细胞的稳态、激活细胞死亡途径等来抑制癌细胞增殖。但过氧化氢消耗不彻底、靶向性差、活性氧产量不足、催化持续时间短等多种问题限制了活性氧的产生和氧化治疗的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸类生物药物及其制备方法，利用核酸适配体解决了基因治疗和氧化治疗靶向性差的问题，比小分子靶向药物有更强的特异性识别能力；氧化治疗和基因治疗协同治疗取代化疗药物，解决了化疗药物耐药性的问题，对肿瘤组织的杀伤效果更彻底；利用二茂铁和长余辉纳米颗粒的共同催化作用以及余辉现象，同时利用基因治疗抑制细胞修复过程，解决了氧化治疗在肿瘤组织活性氧产生量不足和治疗效果较差的问题。

为此，本发明采用了如下的技术方案：

一种核酸类生物药物，其特征在于：具有如式I所示的结构，

式I中，A为Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr长余辉纳米颗粒，B为包含二茂铁人工碱基的核酸适配体，AB之间通过疏水相互作用连接，该核酸适配体通过互补配对再结合一条siRNA。

进一步地，二茂铁人工碱基的结构式如下式II所示：

本发明还用了如下技术方案：

一种核酸类生物药物的制备方法，包括以下步骤：

1)铬掺杂镓锗酸锌(ZGGO:Cr)长余辉纳米颗粒(PLNPs)的制备：

水热法合成Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr PLNPs，称量4.5g硬脂酸和0.6g NaOH加入到8mL去离子水和18mL乙醇中，在剧烈搅拌下，加入1.5mM Zn(NO₃)₂，1mM Ga(NO₃)₂，0.5mMNa₂GeO₃和0.005mM Cr(NO₃)₃，然后加入NaOH调节pH到10.0，室温下搅拌20min，将混合溶液转移到20mL水热釜中，在220℃下反应10h，然后将所得ZGGO:Cr纳米颗粒使用环己烷与乙醇(体积比1:1)洗涤3次；

2)二茂铁(Fe)碱基的制备：

将市售(S)-3-氨基-1,2-丙二醇与二茂铁羧酸偶联，两者摩尔比为1:0.5-2，制,磷酰胺化合物；

3)Fe碱基和siRNA修饰的核酸适配体(ApFe-siRNA)的制备：

使用标准亚磷酰胺化学方法，在ABI 394DNA合成仪上的受控孔玻璃载体上合成DNA寡核苷酸，将完成的序列在室温下于饱和氢氧化铵中脱保护12小时，再在C-18柱上使用0.1M乙酸三乙胺(TEAA)缓冲液(Glen Research)和乙腈(Sigma Aldrich)作为洗脱液通过反相HPLC(Agilent 1260)进一步纯化；将收集的DNA产物冷冻干燥后将DNA产物溶解于200μL 80％乙酸中并孵育20分钟，进行去三苯甲基化，去三苯甲基化的DNA产物用NaCl(3M，25μL)和乙醇(600μL)沉淀，然后使用Sep-Pac Plus C18柱进行脱盐；

将上述得到的DNA产物与siRNA(序列为GACGACAGCUACUGGUUUC)加入退火缓冲液(10mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，50mM NaCl，10mM MgCl₂)中进行杂交，混合物在95℃孵育5min，然后缓慢冷却至室温，得到产物ApFe-siRNA；

4)ApFe-siRNA修饰的ZGGO:Cr PLNPs核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)的制备：

通过搅拌将2mg上述步骤1)中合成的ZGGO:Cr纳米颗粒分散在2mL的甲苯中，将3nM的ApFe-siRNA溶解在1mL的无菌水中，然后在搅拌下添加到上述ZGGO:Cr纳米颗粒溶液中；将反应混合物在室温下剧烈搅拌15小时，使ZGGO:Cr从上层甲苯相转移到下层水相中，然后将水溶液转移到2mL离心管中，通过离心收集获得的siRNA-AFPLNPs；最后用甲苯洗涤3次，并进一步分散在1mL无菌水中，得到最终可用的核酸类生物药物siRNA-AFPLNPs。

本发明的核酸类生物药物应用于肿瘤的治疗。

本发明的核酸适配体可以准确靶向肿瘤组织，通过核酸适配体的互补配对和化学修饰可以实现精准的基因治疗和氧化治疗，不对正常组织产生副作用，生物安全性高；协同基因治疗和氧化治疗，可以长期使用，无耐药性问题，同时相比于化疗方法治疗更加彻底；利用芬顿反应、光催化协同作用和余辉现象解决了氧化治疗中活性氧产生量不足的问题，以及利用基因治疗抑制细胞氧化修复相关基因的表达，氧化治疗效果得到了提升。

附图说明

以下结合附图和本发明的实施方式来作进一步详细说明

图1核酸类药物通过核酸适配体识别肿瘤细胞的示意图；

图2核酸类药物催化过氧化氢产生活性氧的示意图；

图3停止光照后长余辉纳米颗粒持续发光使二茂铁催化过氧化氢产生活性氧的示意图；

图4核酸类药物中的siRNA部分与细胞内异常的mRNA结合的示意图；

图5不同对照组的药物对于肿瘤细胞的杀伤能力对比；图中PLNPs为长余辉纳米颗粒，DNA为核酸适配体，light为光照；

图6细胞凋亡实验效果；UL：上左，为碎片及损伤细胞；UR：上右，为晚期凋亡及死亡细胞；LL：下左，为阴性对照的正常细胞；LR：下右，为早期凋亡细胞；FITC-A和PE-A：细胞发光强度；PBS：磷酸缓冲盐溶液；PLNPs：长余辉纳米颗粒；AFPLNPs：Fe碱基和核酸适配体修饰的长余辉纳米颗粒；light：光照；

图7不同对照组的药物对于小鼠体内肿瘤质量的影响(a)和对小鼠体重的影响(b)；Control：对照组，PLNPs：长余辉纳米颗粒；AFPLNPs：Fe碱基和核酸适配体修饰的长余辉纳米颗粒；light：光照。

图中标记为：1为Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr长余辉纳米颗粒，2为核酸适配体，3为二茂铁，4为siRNA，5为肿瘤细胞，6为过氧化氢，7为活性氧，8为光照，9为mRNA。

具体实施方式

实施例1核酸类生物药物siRNA-AFPLNPs的制备

1)铬掺杂镓锗酸锌(ZGGO:Cr)长余辉纳米颗粒(PLNPs)的制备：

水热法合成Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr PLNPs。称量4.5g硬脂酸和0.6g NaOH加入到8mL去离子水和18mL乙醇中。在剧烈搅拌下，加入1.5mM Zn(NO₃)₂，1mM Ga(NO₃)₂，0.5mMNa₂GeO₃和0.005mM Cr(NO₃)₃。然后加入NaOH调节pH到10.0，室温下搅拌20min。将混合溶液转移到20mL水热釜中，在220℃下反应10h。然后将所得ZGGO:Cr纳米颗粒使用环己烷与乙醇(体积比1:1)洗涤3次。

2)二茂铁(Fe)碱基的制备：

将市售(S)-3-氨基-1,2-丙二醇与二茂铁羧酸偶联，制备相应的磷酰胺化合物。

3)Fe碱基和siRNA修饰的核酸适配体(ApFe-siRNA)的制备：

使用标准亚磷酰胺化学方法，在ABI 394DNA合成仪上的受控孔玻璃载体上合成DNA寡核苷酸(核酸适配体)。设计的寡核苷酸链具有16个天然碱基(序列为TGGGTGGGTGGGGGGT，SEQ ID NO:1)和9个上述Fe碱基，耦合时间为60s。然后将完成的序列在室温下于饱和氢氧化铵中脱保护12小时，再在C-18柱上使用0.1M乙酸三乙胺(TEAA)缓冲液(Glen Research)和乙腈(Sigma Aldrich)作为洗脱液通过反相HPLC(Agilent 1260)进一步纯化。将收集的DNA产物冷冻干燥后将DNA产物溶解于200μL 80％乙酸中并孵育20分钟，进行去三苯甲基化。去三苯甲基化的DNA产物用NaCl(3M，25μL)和乙醇(600μL)沉淀，然后使用Sep-Pac Plus C18柱进行脱盐。

将上述得到的DNA产物与siRNA(序列为GACGACAGCUACUGGUUUC，SEQ ID NO:1)加入退火缓冲液(10mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，50mM NaCl，10mM MgCl₂)中进行杂交。混合物在95℃孵育5min，然后缓慢冷却至室温，得到产物ApFe-siRNA。

4)ApFe-siRNA修饰的ZGGO:Cr PLNPs核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)的制备：

通过搅拌将2mg上述合成的ZGGO:Cr纳米颗粒分散在2mL的甲苯中。接下来，将3nM的ApFe-siRNA溶解在1mL的无菌水中，然后在搅拌下添加到上述ZGGO:Cr纳米颗粒溶液中。将反应混合物在室温下剧烈搅拌15小时，使ZGGO:Cr从上层甲苯相转移到下层水相中。然后将水溶液转移到2mL离心管中，通过离心收集获得的siRNA-AFPLNPs。最后用甲苯洗涤3次，并进一步分散在1mL无菌水中，得到最终可用的核酸类生物药物siRNA-AFPLNPs。

参见图1-4，药物在经注射进入体内后，首先核酸适配体通过空间构型匹配、氢键等作用靶向特定的肿瘤细胞，并部分通过内吞作用进入细胞内部。由于肿瘤微环境和肿瘤细胞内部的过氧化氢含量较高，二茂铁部分的二价铁发生芬顿反应催化过氧化氢产生活性氧(主要为羟基自由基·OH和氢过氧自由基·OOH)，具体反应式为：Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH^-+·OH，Fe³⁺+H₂O₂→Fe²⁺+H⁺+·OOH。进一步使用可见光光照作为激发源，ZnGa₂O₄纳米颗粒作为一种p型半导体材料被光照激发而持续产生空穴-电子对，利用光催化原理使过氧化氢产生活性氧。同时由于ZnGa₂O₄纳米颗粒内部存在的大量缺陷会捕获激发态的电子，在光照停止后，缺陷内的电子会在热运动作用下逃逸，使发光中心Cr³⁺持续发出红光。其发光的能量会以电子的形式传递到附近的二茂铁上，继续提升其催化过氧化氢产生活性氧的能力，最终产生充足的活性氧。活性氧的大量产生会使肿瘤细胞产生严重的氧化应激，破坏肿瘤细胞结构，同时诱导细胞的凋亡等程序的发生。最后，siRNA在进入细胞后，由于更强的结合作用，siRNA会与细胞内与DNA氧化修复相关的mRNA结合从而沉默该基因，抑制氧化修复蛋白(MTH1)的表达，使细胞无法修复活性氧对细胞造成的损伤，进一步增加氧化治疗效果，杀死肿瘤细胞。

实施例2细胞毒性实验：

在96孔板中种入A549细胞，在培养箱中37℃培养24h后，加入各组不同的对照药物进行毒性实验。待细胞吞噬药物4h后，光照组用光照射10min，之后在培养箱中37℃培养24h后进行CCK8测试，确定药物对肿瘤细胞的杀伤能力。

参见图5，相比于对照组的其他药物，核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)在光照后具有最强的杀伤肿瘤细胞的效果，表明协同治疗具有最好的治疗效果。同时光照能显著增强各组药物肿瘤杀伤效果，表明光照使PLNPs成功地产生氧化治疗效果。

实施例3细胞凋亡验证实验：

将A549细胞种入六孔板中，待细胞长至70％加入各组对照药物。待细胞吞噬药物4h后，光照10min，之后在培养箱中37℃培养24h后进行Annexin V/PI(Sigma-Aldrich,USA)凋亡检测，之后使用flow cytometer(CytoFLEX S,Beckman Coulter)检测，确定二茂铁和长余辉纳米颗粒氧化治疗引起的细胞凋亡过程。

参见图6，光照加PLNPs、光照加PLNPs加siRNA以及二茂铁碱基的引入均能增加凋亡细胞和死亡细胞的数量，并且在三者同时存在时晚期凋亡细胞和死亡细胞数量达到了最大值，表明光照加PLNPs和二茂铁碱基成功地通过产生活性氧激活了细胞的凋亡程序，同时siRNA进一步阻止了细胞的氧化修复过程，导致了凋亡和死亡细胞数量的增加。

实施例4小鼠治疗效果实验：

实验用5周龄裸鼠，每只接种A549细胞，待肿瘤长至50mm³时，注射各组对照药物进行治疗，从第0天开始，每隔两天治疗。每只打尾静脉注射药物200微升，注射药物2h后，光照组进行光照15min。实验期间每隔一天进行肿瘤和体重的测量。最终确定药物对于小鼠活体的肿瘤治疗效果。

参见图7，在各组对照药物中，核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)在光照下使得小鼠活体肿瘤的质量达到了最小，表明协同治疗取得了最好的效果。siRNA和二茂铁碱基的引入均能在一定程度上增强对肿瘤生长的抑制效果。同时光照能显著增强各组药物肿瘤杀伤效果，表明光照使PLNPs成功地产生氧化治疗效果。在各组药物中，小鼠体重未随着给药发生明显变化，表明核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)中各组分不会对生物体产生明显的毒性效果。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种核酸类生物药物及其制备方法及其在肿瘤治疗的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgggtgggtg gggggt 16

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gacgacagcu acugguuuc 19

Claims (4)

1.一种核酸类生物药物，其特征在于：具有如式I所示的结构，

式I中，A为Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr长余辉纳米颗粒，B为包含二茂铁人工碱基的核酸适配体，AB之间通过疏水相互作用连接，该核酸适配体通过互补配对再结合一条siRNA。

2.如权利要求1所述的核酸类生物药物，其特征在于：二茂铁人工碱基的结构式如下式II所示：

3.一种权利要求1所述核酸类生物药物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)铬掺杂镓锗酸锌(ZGGO:Cr)长余辉纳米颗粒(PLNPs)的制备：

水热法合成Zn_1.5GaGe_0.5O₄:0.5％Cr PLNPs，称量4.5g硬脂酸和0.6g NaOH加入到8mL去离子水和18mL乙醇中，在剧烈搅拌下，加入1.5mM Zn(NO₃)₂，1mM Ga(NO₃)₂，0.5mM Na₂GeO₃和0.005mM Cr(NO₃)₃，然后加入NaOH调节pH到10.0，室温下搅拌20min，将混合溶液转移到20mL水热釜中，在220℃下反应10h，然后将所得ZGGO:Cr纳米颗粒使用体积比1:1的环己烷与乙醇洗涤3次；

2)二茂铁(Fe)碱基的制备：

将(S)-3-氨基-1,2-丙二醇与二茂铁羧酸偶联，两者摩尔比为1:0.5-2，制磷酰胺化合物；

3)Fe碱基和siRNA修饰的核酸适配体(ApFe-siRNA)的制备：

使用标准亚磷酰胺化学方法，在ABI 394 DNA合成仪上的受控孔玻璃载体上合成DNA寡核苷酸，将完成的序列在室温下于饱和氢氧化铵中脱保护12小时，再在C-18柱上使用0.1M乙酸三乙胺缓冲液和乙腈作为洗脱液通过反相HPLC(Agilent 1260)进一步纯化；将收集的DNA产物冷冻干燥后将DNA产物溶解于200μL 80％乙酸中并孵育20分钟，进行去三苯甲基化，去三苯甲基化的DNA产物用3M，25μL的NaCl和600μL乙醇沉淀，然后使用Sep-Pac PlusC18柱进行脱盐；

将上述得到的DNA产物与siRNA加入退火缓冲液中进行杂交，退火缓冲液为10mM TrispH 7.5、1mM EDTA、50mM NaCl和10mM MgCl₂，混合物在95℃孵育5min，然后缓慢冷却至室温，得到产物ApFe-siRNA；

4)ApFe-siRNA修饰的ZGGO:Cr PLNPs核酸类生物药物(siRNA-AFPLNPs)的制备：

通过搅拌将2mg上述步骤1)中合成的ZGGO:Cr纳米颗粒分散在2mL的甲苯中，将3nM的ApFe-siRNA溶解在1mL的无菌水中，然后在搅拌下添加到上述ZGGO:Cr纳米颗粒溶液中；将反应混合物在室温下剧烈搅拌15小时，使ZGGO:Cr从上层甲苯相转移到下层水相中，然后将水溶液转移到2mL离心管中，通过离心收集获得的siRNA-AFPLNPs；最后用甲苯洗涤3次，并进一步分散在1mL无菌水中，得到最终可用的核酸类生物药物siRNA-AFPLNPs。

4.权利要求1所述的核酸类生物药物应用于肿瘤的治疗。

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