CN111956608A - 一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的npm结合蛋白偶联胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束及其制备方法；是合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯‑聚乳酸PLA‑PEG‑OTs）；制备空白胶束（PMs）；制备NPM1结合蛋白偶联胶束（PMs‑NPMBP）。该NPM结合蛋白偶联胶束的体外癌细胞抑制试验表明，对急性淋巴细胞白血病细胞具有一定的抑制活性，有望被开发为临床抗白血病药物，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法。
背景技术
纳米胶束，可增强药物的肿瘤靶向输送效率。NPM结合蛋白可特异靶向NPM1蛋白，而NPM1蛋白在难治复发ALL病人中高表达，并与耐药相关。将NPM结合蛋白与纳米胶束系统偶联，可望产生较好的靶向性和抗癌活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束及其制备方法，通过合成聚合胶束，丙酮溶剂蒸发法合成胶束，然后将NPM结合蛋白偶联至胶束。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：步骤如下：1）合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）；2）制备空白胶束（Polymeric micelles，PMs）；3）制备NPM1结合蛋白偶联胶束（Polymeric micelles-Nucleophosmin-binding protein，PMs-NPMBP）。
所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）的合成
首先合成一端含有对甲苯磺酸酯基团（-OTs）的PEG（HO-PEG-OTs）作为大分子引发剂，加入二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入三乙胺，使PEG 完全溶解；称取TsCl及DMAP，使用DCM 溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中；采用开环聚合法合成PLA-PEG-OTs；
2）空白胶束（PMs）的制备
PMs采用丙酮溶剂蒸发法制备：取步骤1）制得的聚合物PLA-PEG-OTs 20 mg 于2 mL丙酮中搅拌溶解后，缓慢滴加入2 mL去离子水并搅拌混合均匀，35℃减压蒸馏除去大部分丙酮后，透析除去残留丙酮，得到透明澄清的PMs溶液；最后使用0.22 μm的滤膜无菌过滤备用；
3）NPM1结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）的制备
取步骤2）制得的浓度为10mg/mL的PMs水溶液，加入NPM结合蛋白，总体积为200 μL；混合均匀后避光放置于4℃条件下孵育12 h，得到NPM1结合蛋白PMs-NPMBP溶液。
所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：称取分子量为4000Da的聚乙二醇（PEG）4.6g，加入10 mL二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入0.3 g三乙胺于冰水浴4℃搅拌30 min，使PEG 完全溶解；称取4-甲苯磺酰氯（TsCl）0.2g 及4-二甲氨基吡啶(DMAP)12.2mg，使用30mL DCM溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中，滴加完后恢复至室温继续搅拌反应24 h；减压蒸馏除去部分溶剂，过滤除去反应生成的盐，滤液于冰乙醚沉淀两次，过滤收集产物，室温真空干燥即得白色粉末状的HO-PEG4000-OTs；然后称取HO-PEG-OTs 1g，D,L-丙交酯适量，异辛酸亚锡（Sn(Oct)2）（质量为丙交酯的0.5 wt%）溶于无水甲苯中，于130℃搅拌反应24 h反应结束以后，将反应产物溶于无水DCM中，于冰乙醚中沉淀两次，过滤收集产物，真空干燥即得产物；通过调整加入丙交酯的量以获得不同亲疏水链比的PLA-PEG-OTs。
本发明所述的方法制得的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束在制备抑制活性或/和治疗癌细胞药物中的应用。
上述的癌细胞包括白血病Nalm6。
为实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案：
合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）；制备空白胶束（PMs）；制备NPM1结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）。
其具体包括以下步骤：
1）胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）的合成
首先合成一端含有对甲苯磺酸酯基团（-OTs）的PEG（HO-PEG-OTs）作为大分子引发剂，加入二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入三乙胺，使PEG 完全溶解。称取TsCl及DMAP，使用DCM 溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中。采用开环聚合法合成PLA-PEG-OTs。
2）空白胶束（PMs）的制备
PMs采用丙酮溶剂蒸发法制备。取聚合物PLA-PEG-OTs 20 mg 于2 mL丙酮中搅拌溶解后，缓慢滴加入2 mL去离子水并搅拌混合均匀，35℃减压蒸馏除去大部分丙酮后，透析除去残留丙酮，得到透明澄清的PMs溶液。最后使用0.22 μm的滤膜无菌过滤备用。
3）NPM1结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）的制备
取上述PMs水溶液适量（10 mg/mL），加入NPM结合蛋白，总体积为200 μL。混合均匀后避光放置于4℃条件下孵育12 h，得到NPM1结合蛋白PMs-NPMBP溶液。
本发明的显著优点在于：本发明所制得的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束合成步骤简单，结构明确，对急性淋巴细胞白血病细胞具有一定的抑制作用。该化合物含有NPM结合蛋白，可靶向抑制癌细胞NPM蛋白的表达，使得本专利合成的化合物具有一定的抗癌活性和靶向性，具有较高的开发为抗白血病药物的应用前景。
附图说明
图1为本发明的不同处理组NPM蛋白表达的差异图，图中：*p<0.05。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）的合成
称取分子量为4000Da的聚乙二醇（PEG）4.6 g，加入10 mL二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入0.3 g三乙胺于冰水浴4℃搅拌30 min，使PEG 完全溶解。称取4-甲苯磺酰氯（TsCl）0.2 g 及4-二甲氨基吡啶 (DMAP) 12.2 mg，使用30 mL DCM 溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中，滴加完后恢复至室温继续搅拌反应24 h。减压蒸馏除去部分溶剂，过滤除去反应生成的盐，滤液于冰乙醚沉淀两次，过滤收集产物，室温真空干燥即得白色粉末状的HO-PEG4000-OTs。然后称取HO-PEG-OTs 1 g，D,L-丙交酯适量，异辛酸亚锡（Sn(Oct)2）（质量为丙交酯的0.5 wt %）溶于无水甲苯中，于130℃搅拌反应24 h反应结束以后，将反应产物溶于无水DCM中，于冰乙醚中沉淀两次，过滤收集产物，真空干燥即得产物。通过调整加入丙交酯的量以获得不同亲疏水链比的PLA-PEG-OTs。
实施例2：空白胶束（PMs）的制备
PMs采用丙酮溶剂蒸发法制备[Int. J. Pharm. 2007, 329, 158–165]。取实施例1制得的聚合物PLA-PEG-OTs 20 mg 于2 mL丙酮中搅拌溶解后，缓慢滴加入2 mL去离子水并搅拌混合均匀，35℃减压蒸馏除去大部分丙酮后，透析除去残留丙酮，得到透明澄清的PMs溶液。最后使用0.22 μm的滤膜无菌过滤备用。
实施例3：NPM结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）的制备
应用原核蛋白表达方法，合成纯化的NPM1蛋白，从Scatin骨架蛋白库中筛选，获得非抗体类的Scatin结合蛋白，即NPM结合蛋白。取实施例2制得的PMs水溶液适量（10 mg/mL），分别加入20 μL、40 μL、80 μL NPM结合蛋白（1.5 mg/mL），总体积为200 μL。混合均匀后避光放置于4℃条件下孵育12 h，得到NPM结合蛋白浓度分别为0.15 mg/mL、0.3 mg/mL、0.6 mg/mL的PMs-NPMBP溶液。
实施例4：PMs-NPMBP对白血病细胞增殖抑制实验
将NPM结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）作为受试药物，用培养基将药物稀释。将人急性淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6的密度调整为3×105个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h；移去旧的培养基，加入受试药物(浓度分别从0.156μM -10μM)，每孔100μL，另设空白对照组，设3个复孔。药物作用48h后，加入MTT溶液20μL，继续孵育4h，终止培养；小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μL DSMO，振荡10min，在酶标仪上于490nm和630nm波长处测定各孔光吸收值（OD值）。结果如表1所示。
表1 不同浓度PMs-NPMBP (μM)对急性淋巴细胞白血病细胞Nalm-6的
增殖抑制率(%)
| 细胞株 | 0.156 | 0.312 | 0.625 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 |
| Nalm-6 | 6.4 | 12.6 | 15 | 19.1 | 26.1 | 29.1 | 30.6 |
结果表明，PMs-NPMBP在一定浓度范围内对白血病细胞呈浓度依赖性抗白血病活性。
实施例5：PMs-NPMBP靶向抑制NPM的蛋白印迹实验
收集对数生长期的Nalm-6细胞，调整细胞接种浓度为2×105/ml，24h后收集阴性对照组、5μM PMs-NPMBP处理组，收集蛋白。如图1所示，经蛋白免疫印迹实验，Nalm-6细胞PMs-NPMBP处理组的NPM蛋白表达下调，表达量为阴性对照组的0.887 ± 0.014，差异具有显著性。
总体来看，NPM结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）具有一定的抗癌活性，并对NPM蛋白具有靶向性，因而有较高的开发为抗癌药物的市场潜力。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：步骤如下：1）合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）；2）制备空白胶束（Polymeric micelles，PMs）；3）制备NPM1结合蛋白偶联胶束（Polymeric micelles-Nucleophosmin-binding protein，PMs-NPMBP）。
2.根据权利要求1所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）的合成
首先合成一端含有对甲苯磺酸酯基团（-OTs）的PEG（HO-PEG-OTs）作为大分子引发剂，加入二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入三乙胺，使PEG 完全溶解；称取TsCl及DMAP，使用DCM 溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中；采用开环聚合法合成PLA-PEG-OTs；
2）空白胶束（PMs）的制备
PMs采用丙酮溶剂蒸发法制备：取步骤1）制得的聚合物PLA-PEG-OTs 20 mg 于2 mL丙酮中搅拌溶解后，缓慢滴加入2 mL去离子水并搅拌混合均匀，35℃减压蒸馏除去大部分丙酮后，透析除去残留丙酮，得到透明澄清的PMs溶液；最后使用0.22 μm的滤膜无菌过滤备用；
3）NPM1结合蛋白偶联胶束（PMs-NPMBP）的制备
取步骤2）制得的浓度为10mg/mL的PMs水溶液，加入NPM结合蛋白，总体积为200 μL；混合均匀后避光放置于4℃条件下孵育12 h，得到NPM1结合蛋白PMs-NPMBP溶液。
3.根据权利要求2所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：称取分子量为4000Da的聚乙二醇（PEG）4.6g，加入10 mL二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入0.3 g三乙胺于冰水浴4℃搅拌30 min，使PEG 完全溶解；称取4-甲苯磺酰氯（TsCl）0.2g 及4-二甲氨基吡啶(DMAP)12.2mg，使用30mL DCM溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM 溶液中，滴加完后恢复至室温继续搅拌反应24 h；减压蒸馏除去部分溶剂，过滤除去反应生成的盐，滤液于冰乙醚沉淀两次，过滤收集产物，室温真空干燥即得白色粉末状的HO-PEG4000-OTs；然后称取HO-PEG-OTs 1g，D,L-丙交酯适量，异辛酸亚锡（Sn(Oct)2）（质量为丙交酯的0.5 wt%）溶于无水甲苯中，于130℃搅拌反应24 h反应结束以后，将反应产物溶于无水DCM中，于冰乙醚中沉淀两次，过滤收集产物，真空干燥即得产物；通过调整加入丙交酯的量以获得不同亲疏水链比的PLA-PEG-OTs。
4.一种如权利要求1-3任一所述的方法制得的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM结合蛋白偶联胶束在制备抑制活性或/和治疗癌细胞药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的癌细胞包括白血病Nalm6。
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