CN111948402A - 一种检测EVs上携带的Der p 1的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测EVs上携带的Derp1的试剂盒及检测方法。本发明提供的检测细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)上携带的Derp1的相对表达水平的ELISA试剂盒，可用于检测血浆、鼻腔分泌物和细胞培养上清等中EVs上携带的Derp1的相对表达水平。该试剂盒适用于科研上检测过敏性/变态反应性病人不同的体液以及细胞上清中EVs上Derp1的相对表达水平，有助于科研人员研究EVs对变应性炎症疾病的抗原依赖的调控机制。

Description

一种检测EVs上携带的Der p 1的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测EVs上携带的Der p 1的试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道变应性炎症是最常见的过敏性炎症疾病之一，在全球范围内其患病率可高达10％，降低了患者的生活质量，给社会带来了严重的经济负担。环境中的过敏原，如：尘螨、花粉和豚草等，是引起呼吸道变应性炎症的关键因素。传统上认为，过敏原进入气道后，主要被树突状细胞等抗原递呈细胞摄取和处理，再递呈给CD4+T细胞，促进CD4+T细胞分化形成Th2细胞，进而释放IL-4、IL-5和IL-13等炎症因子，促进气道上皮细胞的杯状化生、气道高反应和气道炎症浸润等病理改变。
EVs是由人体多种细胞分泌的纳米级别的囊泡，其可携带丰富的生物活性分子，如：蛋白质分子和miRNA等，广泛地参与人体的生理和病理过程。近年来，相关的研究表明，抗原递呈细胞释放的EVs可携带过敏原活性成份、抗原递呈分子和共刺激分子等，从而参与抗原递呈细胞类似的抗原递呈过程。抗原递呈细胞所产生的EVs亦可通过体液进入气道分泌物和血液中参与对CD4+T细胞的免疫调控。因此，对细胞培养上清、气道分泌体和血浆等标本中携带Der p 1的EVs的表达水平的检测，在科研上有助于揭示EVs对呼吸道变应性炎症的调控机制。
在中国南方地区，屋尘螨是引起呼吸道变应性炎症最为常见的过敏原，而Der p 1是屋尘螨中引起过敏反应的关键成份。因此，寻找一种针对EVs上携带的Der p 1的检测方法显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测EVs上携带的Der p 1的试剂盒及检测方法，为特异性检测样品中EVs上携带的Der p 1的相对表达水平提供便利的手段。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测EVs上携带的Der p 1相对表达水平的试剂盒，包括封闭液、Der p 1抗体、Der p 1抗体稀释液、洗涤液、生物素化CD63抗体、生物素化抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其稀释液、底物显色液和终止液。
本发明的试剂盒，采用Der p 1包被加样板孔，使得样品中的被EVs携带的Der p 1和游离的Der p 1能够结合于板上；进一步利用EVs的特异性标记物CD63作为二抗，特异性检测EVs上的Der p 1；最后通过Streptavidin-HRP结合二抗上的生物素，利用显色液显色，放大信号。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述Der p 1抗体稀释液为NaHCO3溶液，NaHCO3溶液中NaHCO3的体积摩尔浓度为0.1-1.0M。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述Der p 1抗体稀释液为NaHCO3溶液，NaHCO3溶液中NaHCO3的体积摩尔浓度为0.2M。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述生物素化CD63抗体为鼠抗人CD63抗体。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述生物素化抗体稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液中含有质量浓度为0.5-5％的BSA。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述生物素化抗体稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液中含有质量浓度为1％的BSA。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述底物显色液为TMB底物显色液。
本发明还提供了利用所述的试剂盒检测EVs上携带的Der p 1相对表达水平的方法，包括以下步骤：
(1)包板：将Der p 1抗体包被于加样板孔内，孵育后洗涤加样板孔；
(2)封闭：加样板孔中加入封闭液封闭，孵育后洗涤加样板孔；
(3)上样：加样板孔中加入样品后，样品中的Der p 1与Der p 1抗体结合，洗涤加样板孔，将未结合的多余样品去除，空白孔加入等体积PBS溶液；
(4)二抗孵育：加样板孔中加入生物素化CD63抗体，孵育后洗涤加样板孔；
(5)链霉亲和素孵育：加样板孔中加入链霉亲和素，孵育后洗涤加样板孔；
(6)显色：加入底物显色液孵育，然后加入终止液后测量OD450的数值。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者外周静脉血，离心去除血细胞，取血浆离心去除细胞碎片得到。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者鼻腔分泌物，离心去除炎症细胞后，再次离心去除细胞碎片得到。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者外周静脉血，分离出外周血单个核细胞，给予Der p 1进行刺激后收取细胞培养上清得到。
本发明的有益效果：
(1)本发明的试剂盒，采用Der p 1包被加样板孔，使得样品中的被EVs携带的Derp 1和游离的Der p 1能够结合于板上；进一步利用EVs的特异性标记物CD63作为二抗，特异性检测EVs上的Der p 1；最后通过Streptavidin-HRP结合二抗上的生物素，利用显色液显色，放大信号。
(2)该方法适用于科研上检测过敏性炎症病人不同的体液以及细胞上清中EVs上Der p 1的相对表达水平，有助于科研人员研究EVs对变应性炎症疾病的抗原依赖的调控机制。
附图说明
图1为本发明检测EVs上Der p 1相对表达水平的ELISA方法的原理示意图。
图2为本发明血浆EVs携带的Der p 1相对表达水平的检测结果图；其中，A：表明M-AR和S-AR病人血浆中EVs携带的Der p 1均显著比HC高，而且S-AR病人血浆中EVs携带的Derp 1显著比M-AR病人高；B：表明过敏性鼻炎患者血浆EVs携带的Der p 1与其症状评分具有显著正态相关性；EVs，细胞外囊泡；HC，健康对照；M-AR，轻度过敏性鼻炎；S-AR，中重度过敏性鼻炎；**P＜0.01，***P＜0.001。
图3为本发明AR患者鼻腔分泌物中EVs携带的Der p 1相对表达水平的检测结果图；其中，A：表明AR病人鼻腔分泌物中EVs携带的Der p 1可被本发明的ELISA方法检测到；B表明AR病人鼻腔分泌物中EVs携带的Der p 1与其症状评分具有正态相关性的趋势；AR：过敏性鼻炎；EVs：细胞外囊泡。
图4为本发明人PBMC培养上清中EVs上Der p 1相对表达水平的检测结果图；其中，A：为实验示意图；B：表明健康人和过敏性鼻炎患者来源的PBMC在Der p 1的刺激下，其释放的EVs上携带的Der p 1的表达水平均显著上升。EVs：细胞外囊泡；HC：健康对照；AR：过敏性鼻炎；*P＜0.05。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1血浆EVs携带的Der p 1相对表达水平的检测
(1)标本采集：招募健康(healthy control,HC)、轻度过敏性鼻炎(Allergicrhinitis,AR)和中重度过敏性鼻炎志愿者(过敏原为屋尘螨)，采集外周静脉血2mL，于600g离心10min去除血细胞，取血浆于2000g离心20min去除细胞碎片，最后将血浆冻存于-80℃用于ELISA检测；
(2)包板：用一抗稀释液将Der p 1抗体稀释成1μg/mL，ELISA板中每孔加入100μL稀释后的抗体，封板后放置于4℃，孵育过夜(约16-18h)；
(3)甩干液体，每孔加入300μL洗涤液，进行洗涤，重复5次；
(4)封闭：每孔加入100μL封闭液，封板后放置于摇床上，室温孵育1h；
(5)甩干液体，每孔加入300μL洗涤液，进行洗涤，重复5次；
(6)上样：每孔加入100μL血浆样品，封板后放置于摇床上，室温孵育2h，空白孔加入等体积PBS溶液；
(7)甩干液体，每孔加入300μL洗涤液，进行洗涤，重复5次；
(8)二抗孵育：用二抗稀释液将生物素化CD63抗体按1：100稀释，每孔加入100μL稀释后的抗体，空白加入等体积二抗稀释液，封板后放置于摇床上，室温孵育1h；
(9)甩干液体，每孔加入300μL洗涤液，进行洗涤，重复5次；
(10)Streptavidin-HRP孵育：用稀释液将链霉亲和素按1：100稀释，每孔加入100μL，封板后放置于摇床上，室温孵育20min；
(11)甩干液体，每孔加入300μL洗涤液，进行洗涤，重复5次；
(12)显色：将显色液中的A液和B液按照1：1配制，每孔加入100μL，封板后放置于摇床上，室温孵育5min；
(13)检测：每孔加入100μL终止液，混匀后即刻测量OD450的数值；
(14)结果：如图2所示，过敏性鼻炎患者血浆中EVs上携带的Der p 1的含量显著高于健康对照，同时其与过敏性鼻炎患者的症状评分成显著的正态相关性。
实施例2过敏性鼻炎患者鼻腔分泌物中EVs携带的Der p 1相对表达水平的检测
(1)标本采集：招募健康、轻度过敏性鼻炎和中重度过敏性鼻炎志愿者(过敏原为屋尘螨)，在左下鼻甲前端放置一小块用生理盐水浸泡过的棉片，5min后用镊子取出棉片放置于1mL注射器针筒里，用注射器活塞将棉片中的鼻腔分泌物挤出，于600g离心10min去除炎症细胞，并于2000g离心20min去除细胞碎片，最后将鼻腔分泌物分装冻存于-80℃，用于ELISA检测；
(2)利用本发明的ELISA方法检测鼻腔分泌物中EVs上携带的Der p 1的表达水平，具体同实施例1；
(3)结果：如图3所示，用本发明的ELISA方法可检测到过敏性鼻炎患者鼻腔分泌物中EVs上携带的Der p 1的表达，并且其与患者的症状评分具有正态相关性的趋势。
实施例3人PBMC培养上清中EVs携带的Der p 1相对表达水平的检测
(1)标本采集：招募健康和过敏性鼻炎志愿者(过敏原为屋尘螨)，采集外周静脉血5mL，用Ficoll密度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，按5×105/孔种植于96孔板，分别给予或不给予10μg/mL Der p 1进行刺激，3天后收取细胞培养上清，用于ELISA检测；
(2)利用本发明的ELISA方法检测细胞培养上清中EVs上携带的Der p 1的表达水平，具体同实施例1；
(3)结果：如图4所示，在Der p 1的刺激下，来源于健康或者屋尘螨过敏性鼻炎志愿者的PBMC释放的EVs所携带的Der p 1的表达水平均显著上升。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种检测EVs上携带的Der p 1相对表达水平的试剂盒，其特征在于，包括封闭液、Der p 1抗体、Der p 1抗体稀释液、洗涤液、生物素化CD63抗体、生物素化抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其稀释液、底物显色液和终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Der p 1抗体稀释液为NaHCO3溶液，所述NaHCO3溶液中NaHCO3的体积摩尔浓度为0.1-1.0M。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化CD63抗体为鼠抗人CD63抗体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗体稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液中含有质量浓度为0.5-5％的BSA。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为TMB底物显色液。
6.利用权利要求1～5任一所述的试剂盒检测EVs上携带的Der p 1相对表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包板：将Der p 1抗体包被于加样板孔内，孵育后洗涤加样板孔；
(2)封闭：加样板孔中加入封闭液封闭，孵育后洗涤加样板孔；
(3)上样：加样板孔中加入样品后，样品中的Der p 1与Der p 1抗体结合，洗涤加样板孔，将未结合的多余样品去除，空白孔加入等体积PBS溶液；
(4)二抗孵育：加样板孔中加入生物素化CD63抗体，孵育后洗涤加样板孔；
(5)链霉亲和素孵育：加样板孔中加入链霉亲和素，孵育后洗涤加样板孔；
(6)显色：加入底物显色液孵育，然后加入终止液后测量OD450的数值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者外周静脉血，离心去除血细胞，取血浆离心去除细胞碎片得到。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者鼻腔分泌物，离心去除炎症细胞后，再次离心去除细胞碎片得到。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品是采用以下步骤采集得到：采集患者外周静脉血，分离出外周血单个核细胞，给予Der p 1进行刺激后收取细胞培养上清得到。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107144688A (zh) * 2017-04-07 2017-09-08 浙江大学 Cd19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒
CN108845148A (zh) * 2018-07-05 2018-11-20 天津渤海水产研究所 半滑舌鳎来源的外泌体夹心elisa检测方法及试剂盒
CN109991427A (zh) * 2019-04-08 2019-07-09 王延博 一种用于检测血清中外泌体表面蛋白标志物的试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107144688A (zh) * 2017-04-07 2017-09-08 浙江大学 Cd19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒
CN108845148A (zh) * 2018-07-05 2018-11-20 天津渤海水产研究所 半滑舌鳎来源的外泌体夹心elisa检测方法及试剂盒
CN109991427A (zh) * 2019-04-08 2019-07-09 王延博 一种用于检测血清中外泌体表面蛋白标志物的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOJI UEDA ET AL: "Antibody-coupled monolithic silica microtips for highthroughput molecular profiling of circulating exosomes", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
SHUQI QIU ET AL: "Antigen-specific activities of CD8+ T cells in the nasal mucosa of patients with nasal allergy", 《ASIAN PAC J ALLERGY IMMUNOL》 *

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