CN114966062A - 用于预测抗mda5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的分子标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病（ILD）的分子标记物及其应用。所述的分子标记物为人CXC趋化因子配体16（CXCL16）。本发明通过研究发现抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并ILD、特别是合并快速进展型ILD（RPILD）的患者血清中CXCL16的含量远高于不合并ILD的抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者。本发明的提出使得能够在发病早期预警抗MDA5抗体阳性DM患者出现ILD，特别是RPILD的风险，对于改善抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并ILD，特别是RPILD患者的预后、避免抗MDA5抗体阳性皮肌炎不合并ILD患者过度接受免疫抑制治疗提供了一种有效的技术手段。

Description

用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的分子标记 物及其应用
技术领域
本发明涉及一种分子标志物及其应用，特别涉及一种用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的分子标记物及其应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIM)也被统称为肌炎，是一组异质性比较强的系统性自身免疫病，以进行性肌无力、肌酶升高和肌肉炎症为特征，常伴有肌外其他系统受累表现，如皮疹、关节炎及间质性肺病（interstitial lungdisease, ILD）等。目前更倾向于将IIM分为皮肌炎（dermatomyositis, DM）、多发性肌炎（polymyositis, PM）、重叠性肌炎（含抗合成酶综合征anti-synthetase syndrom, ASS）、免疫介导的坏死性肌炎（immuno-mediated necrotising myopathy, IMNM）以及散发性包涵体肌炎（sporadic inclusion body myositis, sIBM）五种亚型。
临床上发现不同肌炎亚型在疾病进展及预后方面存在较大差异，其中抗黑色素瘤分化相关基因 5 (melanoma differentiation associated gene 5, MDA5) 抗体阳性皮肌炎亚型，尤其在亚裔人群中更容易合并快速进展型间质性肺病 (rapidly progressiveinterstitial lung disease, RPILD) ，预后极差。据研究统计，抗MDA5抗体阳性DM患者出现RPILD的风险比阴性者高20倍以上，此部分患者病情进展迅速，虽经积极的呼吸支持和免疫抑制强化治疗，90天的生存率仅有66.7%，是本病最主要的死因。但临床上发现，约有50%左右的抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者会出现RPILD，而另外约一半的抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者不出现RPILD，且这两个群体患者的预后也截然不同。
因此，能够在发病早期预警并有效性识别出这两个疾病群体，对于改善抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并RPILD患者的预后、避免抗MDA5抗体阳性皮肌炎不合并RPILD患者过度接受免疫抑制治疗非常重要。
人CXC趋化因子配体16（CXCL16）是2000年首次发现的CXC趋化因子家族成员，由趋化因子结构域、粘蛋白茎样结构域、跨膜结构域及胞质尾区结构域四个不同部分组成，其结构与CX3CL1相类似，是迄今发现的第二个既能以分泌型又可以膜结合形式存在的趋化因子，具有黏附和趋化双重作用。近年来的研究表明CXCL16及其受体CXCR6具有参与炎症反应、组织损伤修复及肾脏、心脏和皮肤等脏器纤维化的广泛生物学作用。但对于CXCL16是否直接参与抗MDA5抗体阳性皮肌炎相关ILD，特别是RPILD的进展尚未有任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的分子标记物。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明使用市售的人CXC趋化因子配体16 （CXCL16）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒按照说明书的操作初步检测了50例DM患者、32例ASS患者以及年龄性别相匹配的40例正常对照人群（Healthy control, HC）血清中CXCL16的表达情况，结果发现DM患者血清中CXCL16水平显著高于ASS患者和HC人群。进一步把DM患者分为抗MDA5抗体阳性组和抗MDA5抗体阴性组的亚组分析发现，抗MDA5抗体阳性DM患者血清中CXCL16表达水平显著高于抗体阴性组，随后又根据是否合并ILD对DM疾病组进行亚组分析，结果显示DM-ILD的患者血清CXCL16水平显著高于DM-non-ILD的患者。随后我们把DM-ILD患者根据抗MDA5抗体阳性与否进行分组分析，结果发现抗MDA5抗体阳性DM-ILD组血清CXCL16水平显著高于抗MDA5抗体阴性DM-ILD的患者且抗MDA5抗体阳性DM患者中死亡患者的血清CXCL16水平也显著高于幸存患者。依据临床表现我们针对29例抗MDA5抗体阳性DM患者按照是否合并RPILD进行分组比较，结果发现合并RPILD组CXCL16的表达水平显著高于不合并RPILD组。后通过绘制 ROC 曲线以分析血清CXCL16水平对诊断抗MDA5抗体阳性DM出现RPILD的预测价值。应用SPSS 25以及Prism 6.0进行绘图和统计学分析，血清CXCL16诊断抗MDA5抗体阳性DM-RPILD的诊断阈值为4.989 ng/mL，诊断的敏感性为75%，特异性为80.95%，曲线下面积为0.8512，p=0.004。
在上述研究的基础上，本发明首先提出了CXCL16作为分子标志物在制备用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的药物或试剂中的应用。
其中，优选的，所述的间质性肺病为快速进展型间质性肺病。
其次，本发明还提出了用于检测CXCL16的试剂在制备用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的药物或试剂中的应用。
其中，优选的，所述的用于检测CXCL16的试剂包括采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CXCL16的试剂。
其中，优选的，所述的用于检测CXCL16的试剂为抗CXCL16的抗体。
其中，优选的，抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的患者血清中CXCL16的表达水平显著高于不合并间质性肺病的患者。
其中，优选的，所述的间质性肺病为快速进展型间质性肺病。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种可用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病，特别是快速进展型间质性肺病的分子标记物。本发明通过研究发现抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病、特别是合并快速进展型间质性肺病的患者血清中CXCL16的含量远高于不合并间质性肺病的抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者。本发明的提出使得能够在发病早期预警抗MDA5抗体阳性DM患者出现ILD，特别是RPILD的风险，对于改善抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并ILD，特别是RPILD患者的预后、避免抗MDA5抗体阳性皮肌炎不合并ILD患者过度接受免疫抑制治疗提供了一种有效的技术手段。
附图说明
图1为血清CXCL16水平与DM患者ILD发生及抗MDA5抗体阳性相关；
注：A，正常对照（HC）人群（n=40）、抗合成酶综合征（ASS）患者（n=32）以及皮肌炎（DM）患者（n=50）血清CXCL16水平比较；B，抗MDA5抗体阴性DM患者（n=21）与抗MDA5抗体阳性DM患者（n=29）血清中CXCL16水平比较；C，DM合并ILD患者（n=35）与DM不合并ILD患者（n=15）血清CXCL16水平比较；*代表p<0.05，**代表p<0.01；
图2为血清CXCL16水平与抗MDA5阳性DM-ILD发生相关；
注：A，DM-ILD患者中抗MDA5抗体阴性患者（n=9）与抗MDA5抗体阳性患者（n=26）血清CXCL16水平比较；B，抗MDA5抗体阳性DM存活患者（n=17）与死亡患者（n=12）发病初期血清CXCL16水平比较； *代表p<0.05；
图3为血清CXCL16可用于鉴别抗MDA5抗体阳性DM-RPILD患者；
注：A，抗MDA5抗体阳性DM者中合并RPILD患者（n=8）与不合并RPILD患者（non-RPILD，n=21）血清CXCL16水平比较；B，血清CXCL16作为鉴别抗MDA5抗体阳性DM-RPILD血清标志物的ROC曲线分析；**代表p<0.01。AUC代表ROC曲线下面积；
图4为MDA5活化上调了CXCL16 mRNA表达及CXCL16的胞外分泌；
注：A和B，不同浓度Poly(I:C)/LyoVec刺激A549细胞24 h，检测CXCL16 mRNA表达及细胞外分泌情况；C和D，Poly(I:C)/LyoVec刺激A549细胞不同时间后，检测CXCL16 mRNA和细胞外分泌情况。图中Poly(I:C)代表Poly(I:C)/LyoVec；*代表p<0.05，**代表p<0.01，n.s.代表无统计学差异，以上均是与对照组相比；
图5为Poly(I:C)/LyoVec刺激A549上调CXCL16表达受到MDA5的调控；
注：A，siMDA5转染A549细胞48小时后转染效果验证，NC代表转染实验阴性对照，PC代表siGAPDH的转染实验阳性对照；B，siRNA转染A549细胞24小时后，加Poly(I:C)/LyoVec继续刺激转染后A549细胞24小时，收集细胞培养上清，ELISA检测CXCL16表达情况；**代表p<0.01，n.s.代表无统计学差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
使用市售的人CXC趋化因子配体16 （CXCL16）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒（所述试剂盒中含有纯化的抗CXCL16抗体包被的微孔板、HRP 标记的CXCL16抗体）按照说明书的操作初步检测了50例DM患者、32例ASS患者以及年龄性别相匹配的40例正常对照人群（Healthy control, HC）血清中CXCL16的表达情况，结果发现DM患者血清中CXCL16水平显著高于ASS患者和HC人群（图1A）。进一步把DM患者分为抗MDA5抗体阳性组和抗MDA5抗体阴性组的亚组分析发现，抗MDA5抗体阳性DM患者血清中CXCL16表达水平显著高于抗体阴性组（图1B），随后又根据是否合并ILD对DM疾病组进行亚组分析，结果显示DM-ILD的患者血清CXCL16水平显著高于DM-non-ILD的患者（图1C），初步提示血清CXCL16水平与DM患者ILD的发生以及抗MDA5抗体阳性有关。
随后我们把DM-ILD患者根据抗MDA5抗体阳性与否进行分组分析，结果发现抗MDA5抗体阳性DM-ILD组血清CXCL16水平显著高于抗MDA5抗体阴性DM-ILD的患者（图2A）。随访截止至2021年12月，本研究纳入的抗MDA5抗体阳性DM患者中死亡患者的血清CXCL16水平也显著高于幸存患者（图2B）。这一结果充分提示CXCL16水平与抗MDA5抗体阳性DM患者ILD的发生以及病情活动情况相关。
依据临床表现我们针对29例抗MDA5抗体阳性DM患者按照是否合并RPILD进行分组比较，结果发现合并RPILD组CXCL16的表达水平显著高于不合并RPILD（non-RPILD）组（图3A）。后通过绘制 ROC 曲线以分析血清CXCL16水平对诊断抗MDA5抗体阳性DM出现RPILD的预测价值。应用SPSS 25以及Prism 6.0进行绘图和统计学分析，结果如图3B所示，血清CXCL16诊断抗MDA5抗体阳性DM-RPILD的诊断阈值为4.989 ng/mL，诊断的敏感性为75%，特异性为80.95%，曲线下面积为0.8512，p=0.004。
我们观察了Poly(I:C)/LyoVec（配体）活化MDA5（受体）后细胞表达CXCL16的情况，具体方法为：取对数生长期的A549细胞，常规胰酶消化并制备成单细胞悬液，按照2×105个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，次日用终浓度为0.3和0.6 µg/mL的Poly(I:C)/LyoVec刺激A549细胞，不同时间点收集细胞培养上清、细胞总蛋白及RNA。结果发现0.3或0.6 µg/mL的Poly(I:C)/LyoVec刺激肺泡上皮细胞A549细胞24小时均可显著上调CXCL16的表达，且具有浓度依赖性（图4A和图4B），0.6 µg/mL的Poly(I:C)/LyoVec刺激不同时间发现CXCL16 mRNA的表达呈现“抛物线”型上升趋势，而细胞外分泌型CXCL16表达呈现出了时间依赖性（图4C和图4D）。提示Poly(I:C)/LyoVec在特异性活化MDA5的同时，显著促进了CXCL16的表达和分泌。
在A549细胞中使用siRNA敲低MDA5表达，观察了CXCL16的表达情况。具体方法为：取对数生长期的A549细胞，常规胰酶消化并制备成单细胞悬液，按照1×105个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，次日用RNAiMAX转染试剂转染siMDA524小时后用0.6 µg/mL的Poly(I:C)/LyoVec继续处理细胞24小时，后收集总蛋白和细胞培养上清。结果显示敲低MDA5表达（图5A），可在一定程度上阻止Poly(I:C)/LyoVec刺激A549分泌CXCL16（图5 B），这提示Poly(I:C)/LyoVec刺激A549上调CXCL16表达受到MDA5的调控。

Claims (7)

1.CXCL16作为分子标志物在制备用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的药物或试剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的间质性肺病为快速进展型间质性肺病。
3.用于检测CXCL16的试剂在制备用于预测抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的药物或试剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于检测CXCL16的试剂包括采用酶联免疫吸附实验检测CXCL16的试剂。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于检测CXCL16的试剂为抗CXCL16的抗体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，抗MDA5抗体阳性皮肌炎合并间质性肺病的患者血清中CXCL16的表达水平显著高于不合并间质性肺病的患者。
7.如权利要求3或6所述的应用，其特征在于，所述的间质性肺病为快速进展型间质性肺病。
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