CN111944740A - 增加细胞生长速率的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

一种增加细胞生产速率的无血清培养基，将第一培养基和第二培养基按比例混合。本发明提供的无血清培养基来源于对市面在售的两款无血清培养基，对其进行改良，而适合于细胞无血清培养。通过对比使用改良前后培养细胞的生长增殖情况，发现改良后的培养基在促进细胞生长与细胞维持时间上有明显的提高，适合细胞生长增殖。

Description

增加细胞生长速率的无血清培养基
技术领域
本发明涉及一种用于细胞培养的组合物，尤其涉及一种无血清培养基，用于提高细胞生长速率。
背景技术
动物细胞使用无血清培养基培养是当今生物工程领域的前沿科技，但市面上销售的无血清培养基通常具有光谱性，对于一种细胞生长而言并非最佳。
CN110904025公开了一种Vero细胞的无血清悬浮驯化方法，步骤一，贴壁培养Vero细胞至汇合率达到80％时，弃上清液，加入无钙镁离子的D-PBS洗涤；步骤二，弃D-PBS，加入胰酶，弃胰酶消化液，残留少许胰酶足以覆盖细胞即可，孵育至细胞变圆或孵育一定时间后轻拍瓶底解离细胞；步骤三，用Vero-S悬浮无血清培养基重悬；步骤四，弃上清液，用 Vero-S悬浮无血清培养基重悬；步骤五，将细胞密度稀释，接种到一次性摇瓶中培养；步骤六，当细胞密度达到3×106/ml进行细胞传代；步骤七，一旦连续10代以上细胞密度在48h 能达到3×106/ml以上，细胞活率不低于95％，则认为此细胞适应了悬浮培养。
CN110951677公开了一种Vero细胞无血清培养基，包括基础培养基DMEM/F12、1～10mg/L乙二胺四乙酸二钠、5～30mg/L二水合乙醇胺盐酸盐、2～25mg/L乙二胺四乙酸铁纳、0.005～0.02mg/L重组表皮生长因子、1～10mg/L重组胰岛素、0.1～5mg/L重组纤连蛋白、0.05～0.5mg/L亚油酸钠、0.05～0.5mg/L肉豆蔻酸、0.05～0.8mg/L硬脂酸、6～80mg/L肌醇、 B61～10mg/L维生素和70.1～0.8mg/L维生素B。
CN110628697公开了一种用于VERO无血清细胞培养及相应病毒生产的无血清培养基，包括15-20mg/L甘氨酸、2-5mg/L丙氨酸、150-300mg/L盐酸精氨酸、20-60mg/L一水天门冬酰胺、5-10mg/L天门冬氨酸、15-20mg/L一水盐酸半胱氨酸、25-75mg/L二盐酸胱氨酸、 5-10mg/L谷氨酸、100-200mg/L谷氨酰胺、20-40mg/L一水盐酸组氨酸、25-75mg/L异亮氨酸、25-75mg/L亮氨酸、60-95mg/L盐酸赖氨酸、50-75mg/L甲硫氨酸、20-40mg/L苯丙氨酸、 15-20mg/L脯氨酸、150-180mg/L丝氨酸、40-60mg/L苏氨酸、5-10mg/L色氨酸、200-300mg/L 酪氨酸二钠盐二水合物、25-60mg/L缬氨酸、10-15mg/L羟脯氨酸、40-60mg/L鸟氨酸、 50-75mg/L牛磺酸、10-15mg/L人转铁蛋白、5-10mg/L重组胰岛素、2000-4000mg/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、KERRY超滤植物蛋白胨100-500mg/L和安琪酵母粉100-500mg/L等。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种无血清培养基，以增加细胞生长速率。
本发明的另一个目的在于提供一种无血清培养基，以增加vero细胞生产速率。
一种无血清培养基，将第一培养基和第二培养基按重量比3∶1～4∶1混合。
第一培养基为：VirusPRO Vero-A，购自上海源培生物科技股份有限公司。
第二培养基为：Vero-SFM，购自天信和生物科技有限公司。
另一种无血清培养基，包括第一培养基、第二培养基、NaHCO3、谷氨酰胺、胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子，第一培养基和第二培养基按比例混合。
另一种无血清培养基，包括14.2g/L第一培养基、4.2g/L第二培养基、2.2g/LNaHCO3、0.45g/L谷氨酰胺、25μg/L胰岛素和10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。
本发明提供的无血清培养基来源于对市面在售的两款无血清培养基，对其进行改良，而适合于vero细胞无血清培养。通过对比使用改良前后培养vero细胞的生长增殖情况，发现改良后的培养基在促进vero细胞生长与细胞维持时间上有明显的提高，适合vero细胞生长增殖。
附图说明
图1为本发明的无血清培养基培养Vero细胞的第一次生长曲线对比数据图；
图2为本发明的无血清培养基培养Vero细胞的第二次生长曲线对比数据图；
图3为本发明的无血清培养基培养Vero细胞的第三次生长曲线对比数据图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本实施例所用基础仪器设备如下表1所示，所用主要试剂如下表2所示。
表1
Figure RE-GDA0002686484920000021
表2
Figure RE-GDA0002686484920000022
Figure RE-GDA0002686484920000031
实施例1配置培养基
按如下表3所示配置对照组培养基，按如下表4所示配置改良培养基。
表3
Figure RE-GDA0002686484920000032
表4
Figure RE-GDA0002686484920000033
实施例2
细胞复苏：
从液氮罐中取出冻存细胞1支，在37℃水浴中迅速融化，接种至T75瓶中，补入37℃预热的培养液。培养3-4天后，以1:3传代比例传代2次，扩增出9瓶T75瓶。
细胞接种：
待细胞铺满单层后，使用重组胰蛋白酶进行细胞消化，消化完成后，分别使用3组改良培养基进行培养，同时设置3组对照组，分别使用培养基SFM1a、SFM2a和SFM3a(参见表5)。对比三组细胞生长增殖情况。
表5
Figure RE-GDA0002686484920000041
细胞培养：
每日观察细胞生长增殖情况，培养第3、4天，分别取1瓶进行细胞消化计数。同时检测细胞上清液葡萄糖、乳酸和pH等参数。
实验结果：
第一次试验，分别在培养第三天和第四天检测的数据如表6和表7所示。第二次试验，分别在培养第三天和第四天检测的数据如表8和表9所示。第三次试验，分别在培养第三天和第四天检测的数据如表10和表11所示。
表6
Figure RE-GDA0002686484920000042
表7
Figure RE-GDA0002686484920000043
Figure RE-GDA0002686484920000051
表8
Figure RE-GDA0002686484920000052
表9
Figure RE-GDA0002686484920000053
表10
Figure RE-GDA0002686484920000054
表11
Figure RE-GDA0002686484920000055
可见，培养基A的细胞量最多，且与进口培养基配置的SFM3a相当。
实施例3生长曲线测定
通过培养基优化对比实验，获得最佳培养基配方培养基A,随后进行该培养基生长曲线测定。
使用培养基A复苏Vero细胞1支，复苏至T75瓶中，连续传代扩增至6瓶T75,当细胞铺满单层后，使用TrypLE重组胰蛋白酶进行细胞消化，加入培养基A，调整细胞浓度至2.5×105个/ml接种至T75瓶中，共接种至16瓶T75瓶中，每24h取2瓶使用TrypLE重组胰蛋白酶进行细胞消化计数，直至细胞量达到平台。另取进口培养基SFM3进行绘制生长曲线绘制对照，连续对比三次。第一次测定数据详见表12和图1，第二次测定数据详见表13和图2，第二次测定数据详见表14和图3。
表12
Figure RE-GDA0002686484920000061
表13
Figure RE-GDA0002686484920000062
表14
Figure RE-GDA0002686484920000071
由上述生长曲线对比可见，通过将市购的2款无血清Vero细胞培养基配比后加入适量胰岛素与bFGF生长因子可以促进Vero细胞生长，经过优化后可以明显提高Vero细胞生长增殖速率。通过连续培养对比优化出了1款适合于Vero无血清生长的培养基(培养基A)，将优化后的培养基A与进口培养基SFM3进行Vero细胞生长增殖曲线绘制测定，结果可以看出优化后的培养基生长增殖速率与进口培养基SFM3相当。同时，使用该优化培养基进行细胞复苏传代发现，培养基无需进行培养适应，可以从细胞复苏阶段直接使用该培养基进行细胞复苏传代培养。

Claims (8)

1.一种增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于将第一培养基和第二培养基按重量比3∶1～4∶1混合。
2.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于还包括NaHCO3、谷氨酰胺、胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子。
3.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于所含的NaHCO3浓度为2.2g/L。
4.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于所含的谷氨酰胺浓度为0.45g/L。
5.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于所含的胰岛素浓度为25μg/L。
6.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于所含的碱性成纤维细胞生长因子浓度为10μg/L。
7.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于14.2g/L第一培养基。
8.根据权利要求1所述的增加vero细胞生产速率的无血清培养基，其特征在于4.2g/L第二培养基。
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