CN111944140A - 具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域，应用如下前药聚合物制备而成，所述前药聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构；以7‑7’‑二硫代二庚酸和碳酸二‑3‑氨基苯甲酯为原料，1‑羟基‑7‑偶氮苯并三氮唑、2‑(7‑氧化苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂，N,N‑二异丙基乙胺为催化剂，利用微波技术实现缩聚，通过聚乙二醇化后制备聚合物前药胶束，制备工艺快速简便，绿色环保，具有批量生产的潜力，而且针对人结肠癌细胞具有很好的治疗效果，具有很好的应用前景。
Figure DDA0002656033790000011

Description

具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在基因的表观遗传调控方面发挥了重要作用，目前已经有大量的研究表明，肿瘤的发生发展与HDAC的过度表达或活性异常有紧密的联系。目前已经有很多研究和临床治疗手段将HDAC作为肿瘤治疗的靶标。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)能够抑制组蛋白的去乙酰化过程，还能在其他生物过程如细胞周期、血管新生、免疫调节和凋亡等生理过程发挥作用。
众所周知，肿瘤的发生发展是受多信号通路调控的，各通路之间是相互制约相互影响的。因而，单一的药物靶点并不能取得预期的治疗效果。HDACi与其他药物联合使用，可发挥多靶点的双重抑制作用，表现出良好的协同效果。因此，HDACi和其他抗癌药物联合使用已成为研究的热点。然而，尽管目前已经有一批HDACi药物上市，但HDACi在临床应用中仍然存在一些问题：1)HDACi治疗窗口窄，有效血药浓度难以维持；2)毒副作用明显，容易产生严重的不良反应；3)联合用药时，由于药物的理化性质的差异使药物在体内的分布情况以及代谢速率不同，从而导致药物分子到达病灶部位的浓度难以达到有效治疗浓度；4)治疗方案难以实现普遍化。
聚合物前药应用于纳米药物和联合用药领域的研究为解决这些问题提供了理论依据。聚合物前药通过将小分子药物大分子化，从根本上改变了药物在体内的分布和代谢特征，为药物给药方式、递送方式和协同方式提供了新的视角。尽管如此，聚合物前药仍然存在制备方法繁琐不能保证聚合物前药均一性、化学键不能在肿瘤环境中快速断裂等问题，从而限制了该方法的应用，因此新的聚合物前药体系仍需要继续研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用。
本发明采用的技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种具有还原响应性的聚合物前药胶束，应用如下前药聚合物制备而成，所述前药聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构：
Figure BDA0002656033770000021
其中，x＝6～23；上述结构的缩写为mPEG2000-mMAPn-mPEG2000(n＝2x，m表示羟甲基在苯环的间位，m表示PEG2000的端基是甲氧基)；
所述聚合物前药胶束含有S-S键，S-S键在还原环境下会发生断裂，裂解生成式(II)化合物，中文名称为7-巯基-N-(3-羟甲基苯基)庚酰胺，缩写为mMAP，该化合物具有抑制HDAC以及肿瘤增殖的作用，所述聚合物前药胶束在肿瘤微环境中裂解出mMAP，从而发挥抑制HDAC以及肿瘤增殖的作用，提高了药物稳定性，同时该聚合物前药胶束也可作为药物载体，用于负载抗肿瘤药物，在肿瘤微环境中不仅能裂解出mMAP，而且能释放出抗肿瘤药物，提高了肿瘤细胞抑制效果：
Figure BDA0002656033770000031
本发明的第二个目的是提供上述具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，包括以下步骤：
S1、式(Ⅸ)化合物与羰基二咪唑通过取代反应生成式(Ⅹ)化合物；
S2、将式(Ⅸ)化合物溶于溶剂，0℃下加入氢化钠，再加入式(Ⅹ)化合物，通过取代反应生成式(Ⅺ)化合物；
S3、保护气体氛围下，式(Ⅺ)化合物通过Boc脱保护反应生成式(Ⅻ)化合物；
S4、保护气体氛围下，将式(Ⅷ)化合物和式(Ⅻ)化合物置于微波反应管中，溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)，加入1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，通过微波辅助的缩聚方法制备式(XIII)化合物；
S5、保护气体氛围下，式(XIII)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG2000-NH2，Mw＝2.0KDa)、HOAT、HATU反应，制得式(Ⅰ)化合物，将式(Ⅰ)化合物在水溶液中自组装，制得聚合物前药胶束；
其合成路线如下：
Figure BDA0002656033770000041
优选的，S1中，溶剂为四氢呋喃；反应温度为20～40℃，反应时间为10-20h；式(Ⅸ)化合物和羰基二咪唑的摩尔比为1：2～4。
优选的，S2中，溶剂为四氢呋喃；反应温度为20～40℃，反应时间为10～20h；
式(Ⅹ)化合物：式(Ⅸ)化合物：氢化钠的摩尔比为1：0.5～1.5：0.5～1.5。
优选的，S4中，反应温度为40～80℃，反应时间为5～60min；
式(Ⅷ)化合物：式(Ⅻ)化合物：HOAT：HATU：DIEA的摩尔比为1：1：2～5：2～4：2～5，式(Ⅷ)化合物：NMP的用量比为0.2mmol：0.5mL。
优选的，S5中，溶剂为NMP；反应温度为20～40℃，反应时间为24～72h；
式(XIII)化合物：mPEG2000-NH2：HOAT：HATU摩尔比为1：2～4：3～6：3～6。
本发明的第三个目的是提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制药物，包括活性成分，所述活性成分为上述前药聚合物。
本发明的第四个目的是提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制药物，包括活性成分，所述活性成分为上述聚合物前药胶束和包覆在上述聚合物前药胶束内的抗癌药物；聚合物前药胶束可作为药物，在肿瘤还原环境中裂解释放活性分子mMAP，也可以作为药物载体，负载抗癌药物，释放出的mMAP和抗癌药物具有协同增效抑制组蛋白去乙酰化酶的作用。
优选的，所述抗癌药物为阿霉素。
本发明的第五个目的是提供上述组蛋白去乙酰化酶抑制药物在制备人结肠癌细胞增殖抑制剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以7-7’-二硫代二庚酸和碳酸二-3-氨基苯甲酯为原料，1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂，N,N-二异丙基乙胺为催化剂，利用微波技术实现缩聚，继而通过聚乙二醇化后制备了一种新的聚合物前药胶束，制得的胶束稳定，且与常规缩聚方法相比，缩短了反应时间，提高了反应效率，且制得的聚合物分子量更为均一；
(2)胶束中含有二硫键，能在肿瘤环境中快速断裂，释放活性分子mMAP，其结构如上述式(II)所示，从而对人结肠癌细胞具有抑制效果；另外，该胶束也可作为载体用于包覆药物，实现了HDACi和抗癌药物联合使用，有效地提高了对人结肠癌细胞抑制效果；
(3)本发明制备工艺快速简便，绿色环保，具有批量生产的潜力，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为1H-咪唑-1-甲酸-N-叔丁氧羰基-3-氨基苄酯核磁图1H NMR；
图2为碳酸二-N-叔丁氧基-3-氨基苯甲酯核磁图1H NMR；
图3为碳酸二-3-氨基苯甲酯核磁图1H NMR；
图4为聚合物HOOC-mMAPn-COOH和mPEG2000-mMAPn-mPEG2000的核磁共振氢谱；
图5为聚合物的FT-IR图谱；a为HOOC-mMAP46-COOH，b为mPEG2000-mMAP46-mPEG2000；
图6为mPEG2000-mMAPn-mPEG2000胶束表征图；a、c为mPEG2000-mMAP12-mPEG2000包载等量尼罗红后在水中的荧光强度以及对应的I634-浓度关系曲线；b、d为mPEG2000-mMAP46-mPEG2000包载等量尼罗红后在水中的荧光强度以及对应的I634-浓度关系曲线；
图7为mPEG2000-mMAP12-mPEG2000(a)和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000(b)自组装形成胶束的粒径分布图；mPEG2000-mMAP12-mPEG2000(c)和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000(d)自组装形成胶束的TEM照片；
图8为mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束在含有50％FBS的DMEM中稳定性检测；
图9为结肠癌细胞HCT116对包载NR胶束不同孵育时间的荧光显微照片；a为mMAP12micelle/NR；b为mMAP46 micelle/NR；比例尺：100μm；
图10为化合物mMAP抑制HCT116细胞增殖的能力；
图11为mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束(a)和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束(b)对HCT116细胞增殖的抑制；mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束(c)和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束(d)对HCT116细胞乙酰化组蛋白H3及p21蛋白含量的影响；
图12为胶束对HCT116细胞增殖的抑制；
其中，a为mPEG2000-mMAP12-mPEG2000@DOX胶束；
b为mPEG2000-mMAP46-mPEG2000@DOX胶束。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的范围。除非另有定义，下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
本发明提供了一种具有还原响应性的聚合物前药胶束，应用如下前药聚合物制备而成，所述前药聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构：
Figure BDA0002656033770000071
其中，x＝6～23；上述结构的缩写为mPEG2000-mMAPn-mPEG2000(n＝2x，m表示羟甲基在苯环的间位，m表示PEG2000的端基是甲氧基)；
上述聚合物前药胶束含有S-S键，S-S键在还原环境下会发生断裂，裂解生成式(II)化合物，缩写为mMAP；
Figure BDA0002656033770000081
下述7-7，-二硫代二庚酸可根据现有技术合成制得，下面提供其制备方法，包括以下步骤：
1)由环庚酮制备环庚内酯；
将化合物间氯过氧苯甲酸(335mmol)放入反应瓶中，0℃下依次加入二氯甲烷(500mL)和环庚酮(223mmol)，反应7天；抽滤后用饱和硫代硫酸钠溶液(300mL×2)洗涤两次，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(300mL×2)洗涤两次；用无水硫酸钠干燥有机层，抽滤并旋干得到黄色油状物；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝4.32–4.24(t,2H),2.52–2.44(t,2H),1.83–1.70(m,4H),1.60–1.46(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝176.69,67.87,31.25,30.86,28.33,25.77,23.89.
2)由环庚内酯开环制备7-羟基庚酸甲酯；
取用无水甲醇(55mL)倒入反应瓶中，0℃下依次加入浓硫酸(350μL)和环庚内酯(40mmol)，升温至25℃下反应12h；旋干后用乙酸乙酯50mL溶解，饱和食盐水(50mL×2)洗两次；无水硫酸钠干燥有机层，抽滤并旋干得到无色油状物；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝3.60(s,3H),3.56(t,J＝6.6,2H),2.25(t,J＝7.5Hz,2H),2.08(s,1H),1.60-1.47(m,4H),1.29(m,3.1,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝174.33,62.73,51.50,33.96,32.45,28.86,25.37,24.84.
3)由7-羟基庚酸甲酯制备7-(对甲苯磺酰氧基)庚酸甲酯；
取7-羟基庚酸甲酯(33mmol)、对甲苯磺酰氯(40mmol)、4-二甲氨基吡啶(400mg)投入反应瓶中，N2保护下依次注入二氯甲烷(60mL)和吡啶(6mL)，25℃下反应6h；反应液用1M盐酸水溶液(50mL×2)洗涤两次，饱和食盐水洗涤(50mL×2)两次；用无水硫酸钠干燥有机相，抽滤并旋干得到浅棕色油状物；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.71(d,J＝8.1,2H),7.27(d,J＝8.1,2H),3.94(t,J＝6.4,2H),3.58(s,3H),2.37(s,3H),2.19(t,J＝7.5,2H),1.61–1.44(m,4H),1.28–1.16(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝173.98,144.70,133.17,129.82,127.85,70.46,51.45,33.81,28.60,28.37,25.02,24.62,21.60.
4)由7-(对甲苯磺酰氧基)庚酸甲酯制备7-乙酰巯基庚酸甲酯；
化合物7-(对甲苯磺酰氧基)庚酸甲酯(13mmol)、硫代乙酸钾(15mmol)加入反应瓶中，N2保护下加入N,N-二甲基甲酰胺(25mL)，25℃反应12h；反应液加入乙酸乙酯50mL，饱和食盐水洗涤(50mL×2)两次；无水硫酸钠干燥有机相，抽滤并旋干后得到浅棕色油状物；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝3.64(s,3H),2.83(t,J＝7.3,2H),2.30(s,3H),2.27(t,J＝7.5,2H),1.64–1.51(m,4H),1.39–1.28(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝195.95,174.12,51.47,33.94,30.63,29.31,28.98,28.58,28.37,24.73.ESI-HRMS m/z calcd forC10H18O3S([M+H]+)219.1049,found 219.1054.
5)由7-乙酰巯基庚酸甲酯制备7-巯基庚酸甲酯；
化合物7-乙酰巯基庚酸甲酯(43mmol)加入反应瓶中，N2保护下依次加入甲醇(40mL)和6M盐酸水溶液(40mL)，升温至25℃继续反应24h，将反应液的pH值调至3后继续加40mL蒸馏水稀释，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤并旋干后得到黄色油状物；
6)由7-巯基庚酸甲酯制备7-7’-二硫代二庚酸甲酯；
化合物7-巯基庚酸甲酯(35mmol)、氢氧化钠(35mmol)、碘化钾(7mmol)加入反应瓶中，0℃下加入70mL甲醇，搅拌下滴入碘的甲醇饱和溶液，25℃继续反应15min。旋干后加入60mL乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水(60mL×3)洗涤三次，无水硫酸钠干燥有机相，旋干得到黄白色固体；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝3.60(s,6H),2.60(t,J＝7.3,4H),2.25(t,J＝7.5,4H),1.65–1.51(m,8H),1.37–1.21(m,8H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝174.20,51.52,38.91,33.98,28.97,28.73,28.13,24.79.
7)由7-7’-二硫代二庚酸甲酯制备7-7’-二硫代二庚酸；
将化合物7-7’-二硫代二庚酸甲酯(1mmol)溶于1,4-二氧六环(Dioxane)(6mL)，0℃下滴入3M氢氧化钠溶液(4mL)，升温至25℃反应12h；反应液用10mL二氯甲烷萃取一次，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取三次；无水硫酸钠干燥有机层，抽滤，旋干乙酸乙酯，得到白色固体；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝2.68(t,J＝7.3Hz 4H),2.37(t,J＝7.3Hz,4H),1.73–1.60(m,8H),1.45–1.32(m,8H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝180.08,39.08,33.95,28.96,28.54,,28.03,24.49.
下述N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇可根据现有技术合成制得，下面提供其制备方法，包括以下步骤：
将3-氨基苄醇(80mmol)溶于甲醇(250mL)，0℃下依次加入三乙胺(98mmol)和碳酸二叔丁酯(98mmol)，搅拌至25℃，继续反应12h；旋干后加入200mL二氯甲烷溶解，用5％的盐酸水溶液(100mL×2)洗两次，饱和食盐水(100mL×2)洗两次；有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤并旋干后得黄白色固体；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.28(s,1H),7.48(s,1H),7.27(d,J＝8.1,1H),7.17(t,J＝7.8,1H),6.90(d,J＝7.4,1H),4.43(s,2H),1.47(s,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝153.26,143.53,139.83,128.68,120.60,117.04,116.70,79.33,63.45,28.60.
下面通过实施例来具体说明上述聚合物前药胶束的制备方法。
实施例1
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002656033770000111
S1、1H-咪唑-1-甲酸-N-叔丁氧羰基-3-氨基苄酯的制备；
将N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇(1.5mmol)溶于四氢呋喃(1.5mL)，滴加溶于四氢呋喃(4.5mL)的羰基二咪唑(5mmol)，25℃反应12h；旋干后加入10mL乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤(10mL×2)两次；无水硫酸钠干燥有机相，抽滤并旋干后得到黄色油状物；图1给出了所得产物的1H NMR核磁图。
S2、碳酸二-N-叔丁氧基-3-氨基苯甲酯的制备；
将化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇(35mmol)加入三口瓶中，加入四氢呋喃(70mL)，0℃下，加入氢化钠(35mmol)并搅拌1h，然后滴入化合物1H-咪唑-1-甲酸-N-叔丁氧羰基-3-氨基苄酯(40mmol)的四氢呋喃溶液，升温至25℃继续反应12h，旋干后加入100mL乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤(100mL×2)两次，无水硫酸钠干燥有机相，旋干得到黄色油状物；图2给出了所得产物的1H NMR核磁图；
S3、碳酸二-3-氨基苯甲酯的制备；
化合物碳酸二-N-叔丁氧基-3-氨基苯甲酯(5mmol)投入反应瓶中，N2保护下依次注入二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸5mL，0℃下反应1h；旋干溶剂加入10mL乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗涤(10mL×2)两次；无水硫酸钠干燥有机相，抽滤并旋干后得黄色油状物；图3给出了所得产物的1H NMR核磁图。
S4、聚合物HOOC-mMAP12-COOH的制备；
反应单体7-7’-二硫代二庚酸(0.2mmol)和碳酸二-3-氨基苯甲酯(0.2mmol)溶于NMP(0.5mL)，置于微波反应管中，分批加入HOAT(0.4mmol)，HATU(0.4mmol)和DIEA(0.4mmol)，起始物质比例为1:1:2:2:2；将反应管置于微波反应器中，设置温度为40℃，时间为5min；反应结束后，向微波反应管中加入0.2mL7-7’-二硫代二庚酸的NMP(0.04mmol)溶液，继续于40℃反应15min；将反应液在DMSO中透析72h，随后在去离子水中继续透析48h；将透析液冻干得到性状为白色固体的聚合产物；
S5、前药聚合物mPEG2000-mMAP12-mPEG2000的制备；
将聚合物HOOC-mMAP12-COOH(1mmol)和氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2，Mw＝2.0KDa)(2.5mmol)溶于10mL NMP中，加入HOAT(4mmol)和HATU(4mmol)，N2保护下于室温反应48h，然后将反应液在DMSO中透析72h，随后在水中继续透析48h，将透析液冻干后得到聚合物mPEG2000-mMAP12-mPEG2000白色固体；
S6、聚合物前药mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束的制备；
将1mL mPEG2000-mMAP12-mPEG2000的DMSO(20mg/mL)溶液在40℃、滴加到10mL去离子水中，使聚合物在水相中发生自组装形成胶束；滴加完毕后继续搅拌并使温度恢复至室温；将胶束溶液转入截留分子量为7.0KDa的透析袋中，在去离子水中透析24h以除去DMSO；透析结束后，取0.2mL聚合物溶液冻干后称重，计算胶束溶液的质量浓度。
实施例2
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP26-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例1，不同之处在于：
S1、20℃反应20h，N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇和羰基二咪唑的摩尔比为1：2；
S2、20℃反应10h，1H-咪唑-1-甲酸-N-叔丁氧羰基-3-氨基苄酯：N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇：氢化钠为1：0.5：0.5；
S4、反应时间设定为10min；
S5、将HOOC-mMAP12-COOH替换为HOOC-mMAP26-COOH，20℃反应24h，HOOC-mMAP26-COOH：mPEG-NH2：HOAT：HATU为1:2:3:3；
S6、将mPEG2000-mMAP12-mPEG2000替换为mPEG2000-mMAP26-mPEG2000。
实施例3
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP38-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例1，不同之处在于：
S1、40℃反应10h，N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇和羰基二咪唑的摩尔比为1：4；
S2、40℃反应20h，1H-咪唑-1-甲酸-N-叔丁氧羰基-3-氨基苄酯：N-叔丁氧羰基-3-氨基苄醇：氢化钠为1：1.5：1.5；
S4、反应时间设定为30min；
S5、将HOOC-mMAP12-COOH替换为HOOC-mMAP38-COOH，40℃反应72h；HOOC-mMAP26-COOH：mPEG-NH2：HOAT：HATU为1:4:6:6；
S6、将mPEG2000-mMAP12-mPEG2000替换为mPEG2000-mMAP38-mPEG2000。
实施例4
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例1，不同之处在于：
S4、反应时间设定为60min；
S5、将HOOC-mMAP12-COOH替换为HOOC-mMAP46-COOH；
S6、将mPEG2000-mMAP12-mPEG2000替换为mPEG2000-mMAP46-mPEG2000。
实施例5
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP26-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例2，不同之处在于：
S4、7-7’-二硫代二庚酸：碳酸二-3-氨基苯甲酯：HOAT：HATU：DIEA的摩尔比为1：1：3：3：3。
实施例6
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP26-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例2，不同之处在于：
S4、反应温度60℃。
实施例7
一种具有还原响应性的聚合物前药mPEG2000-mMAP26-mPEG2000胶束的制备方法，步骤同实施例2，不同之处在于：
S4、反应温度80℃。
上述实施例中疏水链段HOOC-mMAPn-COOH的分子量计算方法为：聚合物的不同位置的氢原子在核磁氢谱上可以得到准确的归属。如图4所示，从聚合物的结构来看，每个重复单元含有酰胺键相邻碳上的氢原子，而两个末端单元上与之对应的羧基相邻的α位氢原子，这两组氢原子之间存在含量上的关系，即两组氢原子对应的核磁峰面积的比值即为聚合物重复单元的个数x(聚合度)，而HOOC-mMAPn-COOH中的n值应该为聚合度的2倍，即n＝2x；用x乘以重复单元的分子量，再加上末端基团的分子量，即可得到聚合物的绝对分子量(见表1)。
Figure BDA0002656033770000151
其中：Area(l)、Area(L)为酰胺键相邻碳上的氢原子的积分面积；Area(a)为羧基相邻的α氢原子的积分面积；Area(A)为mPEG2000末端甲氧基特征峰的积分面积。
从图4核磁谱图中可计算得到重复单元数x为6，13，19，23，进一步计算得到分子量，并通过GPC(DMSO为流动相)得到聚合物分子量分布(见表1)。
表1不同聚合条件下得到的聚合物HOOC-mMAPn-COOH(n＝2x)结构性质表征数据
Figure BDA0002656033770000161
a.通过核磁共振氢谱计算；b.通过GPC测量。
由表1可得，通过本发明微波辅助的方法，我们在5～60min分别合成了不同分子量的聚合物，通过核磁共振氢谱计算其分子量范围在3.6～14kg/mol之间，结果显示，使用微波聚合法经不同时间得到的聚合物分子量随着反应时间(5～60min)的延长而增加，呈现良好的时间依赖性，证明该微波辅助聚合可以通过调整反应时间的长短来控制聚合物分子量，而传统的聚合方法合成分子量在5.9kg/mol的聚合物，所需要的时间长达24h，显然，本发明方法更加高效，另外，微波辅助聚合得到的聚合物的分子量分布(PDI＝1.7～1.8)相比于常规方法(PDI＝2.00)数值更小，说明微波辅助聚合得到的聚合物分子量更为均一。
对HOOC-mMAP46-COOH和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000进行FT-IR表征：从图5的红外图谱可见，3290cm-1处有N-H键的伸缩振动吸收峰，2851cm-1处羧基OH伸缩振动吸收在聚合物经过PEG化修饰后消失。1661cm-1处为羰基伸缩振动吸收，而1099cm-1处为在PEG化修饰后出现的C-O-C对称伸缩振动吸收。
实施例1～4制得的mPEG2000-mMAPn-mPEG2000胶束性能近似，下面仅以实施例1和实施例4为例，即挑选具有代表性的两种聚合物前药(mPEG2000-mMAP12-mPEG2000和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000)制得的胶束以及进行后续的实验，以此考察聚合物分子量对其自组装性质的影响，以及对胶束理化性质、稳定性以及后续的药物释放、细胞毒性等的影响。
对聚合物前药mPEG2000-mMAPn-mPEG2000胶束进行表征。
使用尼罗红(NR)作为荧光探针，配制浓度分别为2.5，3.75，5.0，12.5，25，37.5，50，125，250，375，500μg/mL的胶束溶液各0.1mL，每组溶液中含有1μg/mL的NR，将混合溶液充分混匀后，进行胶束制备过程，将得到的11份不同浓度的胶束溶液置于37±0.5℃摇床中平衡4h；使用荧光分光光度计测定激发波长577nm下590～700nm范围内的发射光谱(激发，发射狭缝均为5nm)，从而对聚合物胶束mPEG2000-mMAP12-mPEG2000和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000的临界胶束浓度(CMC)进行了测定，结果如图6和表2。
将胶束稀释到合适的浓度(0.5mg/mL)，置于测试皿中，25±0.5℃温度下，使用纳米粒度仪测定胶束的粒径和电位分布(见表2及图7a,图7b)，使用透射电子显微镜来直观的观察聚合物胶束mPEG2000-mMAPn-mPEG2000的纳米级显微结构(见图7c,图7d)。
表2实施例1和实施例4中的聚合物胶束的性质表征
Figure BDA0002656033770000171
Figure BDA0002656033770000181
a.通过荧光探针增溶法测定。b.基于动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)原理测定
由图6可得，聚合物mPEG2000-mMAP12-mPEG2000的CMC值为6.2μg/mL，聚合物mPEG2000-mMAP46-mPEG2000的CMC值为16.8μg/mL(见表2)，说明聚合物具备较强的组装成胶束的能力，适合在体内的进一步应用；图7a,图7b可以直观的比较两种胶束的粒径和PDI(表2)，可以得出，两种聚合物都可以通过自组装形成粒径较为均一的纳米胶束。TEM结果如图7c、图7d所示，mMAP12胶束呈现出较清晰的颗粒状结构，颗粒大小约在50nm左右；而mMAP46胶束的颗粒较大，约在100nm左右；这说明两种不同分子量的聚合物在水中自组装形成的胶束粒径与其分子量相关。
使用含有50％FBS的DMEM培养基与胶束溶液共孵育，在4h，8h，12h，16h，20h，24h时测定粒径分布(见图8)，从图8可以看出，胶束的粒径随时间的变化不明显。mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束(即图中的mMAP12)能够在12小时内维持其粒径的稳定性，没有出现大量沉降和聚集。与mMAP12胶束相比，mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束(即图中的mMAP46)在开始孵育后的4h里出现了粒径下降和波动，4～24h内，粒径有缓慢上升的趋势，但总体来说波动幅度不大。
聚合物前药mPEG2000-mMAPn-mPEG2000胶束的应用。
采用人结肠癌细胞HCT116(购自上海盖宁生物科技有限公司)来评价细胞对胶束的摄取。将两种包载NR胶束(mMAP12 micelle/NR和mMAP46 micelle/NR)分别以终浓度0.1mg/mL与细胞共孵育。为了体现细胞摄取的过程，我们将时间设定为0.5，1，3，6h，分别在这些时刻来观察和检测摄取情况。
结果分析：通过荧光显微镜定性观察HCT116细胞对胶束的摄取，由图9可以看出，HCT116细胞对于两种胶束的摄取都非常迅速，在0.5h后超过90％的细胞均可有效摄取胶束，且随着时间的增加，细胞的总摄取量变化不大。
mMAP的细胞毒性实验
本发明聚合物前药胶束含有S-S键，在肿瘤的还原环境发生裂解，释放活性分子mMAP，结构如上述式(II)所示，从而发挥抑制HDAC以及肿瘤增殖的作用，由于末端巯基的不稳定性，其在常温常压下以二聚体的形式存在；为了检测胶束对HCT116的抑制作用，首先检测胶束裂解释放的活性分子mMAP对于HCT116的抑制作用，由于本发明在合成胶束过程中并没有通过合成mMAP来制备前药聚合物，但为了检测该活性分子mMAP对HCT116的抑制效果，另外合成了mMAP二聚体，步骤如下：
Figure BDA0002656033770000191
将7-7’-二硫代二庚酸(0.6mmol)，3-氨基苄醇(1.5mmol)，HATU(1.3mmol)，HOAT(1.3mmol)置于50mL烧瓶中，N2保护下加入无水DMF(3mL)溶解，0℃搅拌下滴加DIEA(1.3mmol)，25℃下继续反应12h。加入15mL乙酸乙酯溶解，饱和食盐水(10mL×3)洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤后旋干溶剂后得白色固体。
根据细胞的生长情况分别将HCT116细胞接种在96孔板中，密度为5000个/孔，培养24h后进行细胞毒性分析；用培养基将小分子mMAP稀释至不同浓度，以每孔10μL的量加入到6个孔板中，继续培养48h；在避光环境中，将MTT溶液以每孔10μL的量加入到96孔板中，培养4h后移去上清并加入DMSO溶解产生的结晶；然后在570nm的波长下用酶联免疫仪测定每个孔的吸光度。通过得到的吸光度计算HCT116细胞的细胞抑制率。
结果分析：图10显示了小分子mMAP对HCT116细胞的具有明显的抑制作用(IC50＝54μM)；mMAP对HCT116细胞增殖抑制活性的测定，为后续胶束在细胞水平的增抑制实验提供参考。
聚合物前药胶束对HCT116细胞的细胞抑制作用
具体方法同上述mMAPn小分子的细胞毒性实验，不同之处在于，用mMAP12和mMAP46胶束的PBS溶液分别替代小分子mMAP。从图11a可以看出，mMAP12胶束对细胞的增殖有明显的抑制(IC50＝100μM)。如图11b所示，mMAP46胶束对HCT116细胞增殖也有一定的抑制作用；由此可得，上述胶束能够在一定浓度下抑制细胞的增殖，具备自身作为载药胶束治疗肿瘤的潜力；这也证明了，本发明制得的胶束在肿瘤环境中能够裂解，释放出活性分子，从而发挥对HCT-116细胞的抑制作用。
聚合物前药胶束的western blot实验
通过Western Blot法检测组蛋白H3的乙酰化以及p21基因编码蛋白的表达。具体方法：以2×105/mL细胞密度接种于6孔板里，24h后加入单一的mMAP12和mMAP46胶束与细胞共孵育。48h后收集细胞，并用含1％蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞，冰上孵育30min，13000r/min，4±0.5℃，离心15min，保留上清蛋白溶液。蛋白分离采用SDS-PAGE体系，每泳道以30～60μg上样，电转1h至硝酸纤维膜(购自GE Healthcare公司)，5％脱脂牛奶封闭1h后加入不同蛋白的特异性抗体(购自Abcam公司)室温孵育2h，加入HRP标记的二抗室温孵育1h，最后用Kodak X-ray化学发光检测仪显色。每次实验均以Tubulin作为内参校正。
结果分析：从图11c可以看出，mMAP12胶束在100μM的浓度下可以看到明显的乙酰化组蛋白H3条带。随着胶束浓度的升高，条带逐渐加深，体现出明显的剂量依赖关系。p21蛋白表达的上调也与胶束呈现出一定的剂量依赖关系。从图11d可以看出mMAP46胶束在500μM的浓度下有条带出现。
下面将胶束包覆阿霉素(DOX)并检测其性能。
胶束负载DOX的制备，步骤如下：
将0.8mL DOX溶液(1mg/mL)分别与1mL mPEG2000-mMAP12-mPEG2000和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000的DMSO(20mg/mL)均匀混合，40±0.5℃，将混合溶液逐滴滴入20mL超纯水中，滴加完毕后继续搅拌10min，搅拌速度1000r/min，将胶束溶液置于截留分子量为7.0KDa的透析袋中，于去离子水中透析24h，分别得到mPEG2000-mMAP12-mPEG2000@DOX胶束和mPEG2000-mMAP46-mPEG2000@DOX胶束。
mPEG2000-mMAPn-mPEG2000@DOX(n＝12,46)胶束中DOX的包载量测定：将胶束溶液在12000rpm下离心30min，取上清并冻干后利用高效液相色谱确定未包载的DOX含量，从而计算DOX的包载量(LC)，计算公式如下：
Figure BDA0002656033770000221
其中：WDOX为DOX的总质量；WfreeDOX为未包载的DOX的质量；WloadedDOX为包载的DOX的质量；Wpolymer为PEG2K-mMAPn-PEG2K(n＝12,46)的质量。
另外，利用马尔文粒径仪测定胶束的粒径和粒径分布；结果如表3所示：
表3包载DOX胶束中DOX的百分含量
Figure BDA0002656033770000222
结果分析：从表3与表2的结果比较来看，mPEG2000-mMAP12-mPEG2000@DOX胶束(表3中的mMAP12/DOX)与未包载DOX的mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束相比，平均粒径差别不大，而粒径分布有所增大；mPEG2000-mMAP46-mPEG2000@DOX胶束(表3中的mMAP46/DOX)与未包载DOX的mPEG2000-mMAP46-mPEG2000胶束相比，平均粒径变小，而粒径分布有所增大。
下面以mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束分别包载不同含量的DOX(包载量为4％和1％)，配成不同溶度的溶液，利用MTT实验，分别检测其对HCT116细胞的抑制效果，结果如图12所示：
结果分析：从图12a、图12b可以看出，mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束、DOX和mPEG2000-mMAP12-mPEG2000@DOX胶束对HCT116的增殖抑制作用随浓度的升高细胞存活率逐渐降低，呈现剂量依赖关系。mMAP12/4％DOX和mMAP12/1％DOX组细胞的存活率均低于mPEG2000-mMAP12-mPEG2000胶束组和DOX组细胞的存活率，表现出两药协同或相加作用。
综上所述，本发明以7-7’-二硫代二庚酸和碳酸二-3-氨基苯甲酯为原料，1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂，N,N-二异丙基乙胺为催化剂，利用微波技术实现缩聚，通过聚乙二醇化后制备了一种新的聚合物前药胶束，制得的胶束稳定，且与常规缩聚方法相比，缩短了反应时间，提高了反应效率，且制得的聚合物分子量更为均一；胶束中含有二硫键，能在肿瘤环境中快速断裂，释放活性分子mMAP，其结构如上述式(II)所示，从而对人结肠癌细胞具有抑制效果；另外，该胶束也可作为载体用于包覆药物，实现了HDACi和抗癌药物联合使用，有效地提高了对人结肠癌细胞抑制效果；本发明制备工艺快速简便，绿色环保，具有批量生产的潜力，具有广阔的应用前景。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选实施例及其效果，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种具有还原响应性的聚合物前药胶束，其特征在于，应用如下前药聚合物制备而成，所述前药聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构：
Figure FDA0002656033760000011
其中，x＝6～23。
2.根据权利要求1所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束，其特征在于，所述聚合物前药胶束在还原环境中裂解生成式(II)化合物：
Figure FDA0002656033760000012
3.根据权利要求1所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、式(Ⅸ)化合物与羰基二咪唑通过取代反应生成式(Ⅹ)化合物；
S2、将式(Ⅸ)化合物溶于溶剂，0℃下加入氢化钠，再加入式(Ⅹ)化合物，通过取代反应生成式(Ⅺ)化合物；
S3、保护气体氛围下，式(Ⅺ)化合物通过Boc脱保护反应生成式(Ⅻ)化合物；
S4、保护气体氛围下，将式(Ⅷ)化合物和式(Ⅻ)化合物溶于N-甲基吡咯烷酮，置于微波反应管中，加入1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺，通过微波辅助的缩聚方法制备式(XIII)化合物；
S5、保护气体氛围下，式(XIII)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚、1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯反应，制得式(Ⅰ)化合物，将式(Ⅰ)化合物在水溶液中自组装，制得聚合物前药胶束；
其合成路线如下：
Figure FDA0002656033760000021
4.根据权利要求3所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，S1中，溶剂为四氢呋喃；反应温度为20～40℃，反应时间为10～20h；式(Ⅸ)化合物和羰基二咪唑的摩尔比为1：2～4。
5.根据权利要求3所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，S2中，溶剂为四氢呋喃；反应温度为20～40℃，反应时间为10～20h；式(Ⅹ)化合物：式(Ⅸ)化合物：氢化钠的摩尔比为1：0.5～1.5：0.5～1.5。
6.根据权利要求3所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，S4中，反应温度为40～80℃，反应时间为5～60min；
式(Ⅷ)化合物：式(Ⅻ)化合物：1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯：N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1：2～5：2～4：2～5，式(Ⅷ)化合物：N-甲基吡咯烷酮的用量比为0.2mmol：0.5mL。
7.根据权利要求3所述的具有还原响应性的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，S5中，溶剂为N-甲基吡咯烷酮；反应温度为20～40℃，反应时间为24～72h；氨基聚乙二醇单甲醚的Mw＝2.0KDa；
式(XIII)化合物：氨基聚乙二醇单甲醚：1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯摩尔比为1：2～4：3～6：3～6。
8.一种组蛋白去乙酰化酶抑制药物，包括活性成分，其特征在于，所述活性成分为权利要求1所述的前药聚合物。
9.一种组蛋白去乙酰化酶抑制药物，包括活性成分，其特征在于，所述活性成分为权利要求1所述的聚合物前药胶束和包覆在所述聚合物前药胶束内的抗癌药物。
10.根据权利要求8或9所述的组蛋白去乙酰化酶抑制药物在制备人结肠癌细胞增殖抑制剂方面的应用。
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