CN111939166B - 七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。从中药娑罗子中获得的七叶皂苷具有清热、止血、消炎、散瘀等作用，对溃疡性结肠炎引发的腹痛、腹泻、黏液脓血便等症状具有显著的预防和治疗作用。

Description

七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途
技术领域
本发明公开了一种中药提取物的用途，具体涉及七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症疾病，属自身免疫性疾病(autoimmune diseases)范畴。UC难治愈、易复发、恶化和癌变，已被世界卫生组织(WHO)列为现代难治疾病之一。UC是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层。病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。病程漫长，常反复发作。本病见于任何年龄，但20～30岁最多见。腹泻型溃疡性结肠炎可用中药治疗，效果比较理想。同时应注意饮食以及生活习惯。至今，针对UC的治疗药物主要包括传统的氨基水杨酸类、类固醇激素类、免疫抑制剂类以及新型生物制剂类等。传统治疗药物的治疗效果有限，停药后复发率较高。因此，对于有效成分明确、质量可控及安全高效的中药有效部位在研制UC等免疫性炎症的治疗药物方面，具有诱人的市场前景和开发价值。
娑罗子(Aesculi Semen)，别名苏罗子、棱罗子。现行中国药典一部收载其为七叶树科植物七叶树(Aesculus chinensis Bge.)、浙江七叶树(Aesculus chinensisBge.var.chekiangensis(Hu et Fang)Fang)或天师栗(Aesculus wilsonii Rehd.)的干燥成熟种子。性温、味甘，归肝、胃经。具有理气宽中、和胃止痛的功效。娑罗子中含脂肪油31.8％，主要化学成分包括七叶皂苷、黄酮，油酸及硬脂酸甘油酯、多糖、蛋白质等。娑罗子中富含皂苷类成分，其中七叶皂苷是其主要活性成分。临床主要以β-七叶皂苷钠盐形式应用，具有抗炎、消肿、抗渗出、保护血管、降低血粘度等作用。我们采用一定的提取方法从娑罗子种子中提取制备出了在抗溃疡性结肠炎活性方面的有效成分七叶皂苷(Aescin)，迄今为止尚未发现有关该有效成分治疗或改善UC等免疫性炎症的文献报道。
目前已报道的七叶皂苷类化合物就有100余种，包括七叶皂苷A(aescin A)、七叶皂苷B(aescin B)、七叶皂苷C(aescin C)、七叶皂苷D(aescin D)等。七叶皂苷由原七叶皂苷元和玉蕊精醇C皂苷元衍生而来，其苷元的C-16、C-21、C-22和C-28位多为连接酰基的酯键，C-3位连有糖基。根据酰基类型、连接位置以及糖基的差异，五环三萜类皂苷可分为七叶皂苷、异七叶皂苷等。七叶树属的多羟基三萜皂苷共同之处是在C-3位置上均有一个寡糖链，其差异是这些寡糖的成分和连接顺序不同，不同七叶皂苷类化合物的详细信息见表1。七叶皂苷母核结构和基团如下所示：
Figure BDA0002664711190000021
表1七叶皂苷类化合物详细信息
Figure BDA0002664711190000022
发明内容
发明目的：本发明的目的是公开七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。技术方案：本发明所述的七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。
所述的用途，七叶皂苷是娑罗子总皂苷提取物的主要成分，其含量为70％～95％。所述的用途，所述七叶皂苷为主要包含七叶皂苷A、B、C、D的组合物。
所述的用途，所述七叶皂苷是通过以下方法制得：
(1)取娑罗子，先用乙醇超声提取，从中提取粗七叶皂苷；
(2)以D101大孔吸附树脂分离纯化(1)中得到的粗七叶皂苷；
(3)将(2)中所得产物用硅胶柱层析精制获得七叶皂苷。
所述的用途，所述组合物由七叶皂苷添加药学上可接受的辅料制备成制剂。
所述的用途，所述制剂为口服制剂。
所述的用途，所述口服制剂为口服液、冲剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂和汤剂。
有益效果：与现有的技术相比，本发明具有如下显著的特点：(1)本发明的药物原料易从市场上获得。(2)以七叶皂苷为主要组成成分的中药提取物，进一步拓展了娑罗子的综合开发和应用，本发明的提取物具有清热、止血、消炎、散瘀等作用，对溃疡性结肠炎引发的腹痛、腹泻、黏液脓血便等症状具有显著的预防和治疗作用。
附图说明
图1为本发明实例1中七叶皂苷的HPLC色谱图；
图2为本发明实例2中药物对UC模型小鼠体重的影响；
图3为本发明实例2中药物对UC模型小鼠结肠长度的影响；
图4为本发明实例2中结肠后段组织学观察；(a)为正常对照组，(b)为模型组，(c)为阳性药SASP组，(d)为七叶皂苷低剂量组，(e)为七叶皂苷高剂量组。
具体实施方式
实验所用的柳氮磺吡啶是购自上海福达制药有限公司。
七叶皂苷是通过以下方法制得的：
(1)取娑罗子，先用乙醇超声提取，从中提取粗七叶皂苷；
(2)以D101大孔吸附树脂分离纯化(1)中得到的粗七叶皂苷；
(3)将(2)中所得产物用硅胶柱层析精制获得七叶皂苷。
具体的提取方法参考文献：陈新艳，牛泱平，浙江七叶树种子中七叶皂苷的分离纯化，中药新药与临床药理，2010，21(03)：307-311。
实施例1
本发明抗溃疡性结肠炎药物成分检测
一、实验方法
对七叶皂苷药物主成分含量进行测定，使用HPLC进行检测，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent 5HC-C18，4.6*250mm，5.0μm；
柱温：30℃；
紫外检测波长：220nm；
流速：1.0ml/min；
流动相：A，0.1％磷酸水溶液；B，乙腈；
等度洗脱：B：42％。
二、实验结果
主要成分的HPLC色谱图见图1和含量见图2。七叶皂苷的HPLC色谱图及各成分的色谱峰信息表所示。其中七叶皂苷中主要成分七叶皂苷A的含量占总含量的30.42％，七叶皂苷B的含量占总含量的15.38％，七叶皂苷C的含量占总含量的25.80％，七叶皂苷D的含量占总含量的11.87％。
实施例2
本发明抗溃疡性结肠炎药物对小鼠UC模型的影响
一、试验材料
1.1药物及剂量
实验药物包括1种受试药物和柳氮磺吡啶作为阳性对照药物，具体给药剂量见表2
表2.受试药物及给药剂量
Figure BDA0002664711190000041
1.2受试动物
C57小鼠，雄性，扬州大学比较医学中心，许可证号为：SCXK(苏)2017-0007。
1.3试验仪器
超纯水制备系统；普通冰箱；超低温冰箱；碎冰机；电子天平。
1.4溶液配制
(1)2.5％DSS(w/v)溶液：称取2.5g DSS粉剂，溶解于100ml去离子水中，充分溶解至体系透明。
(2)0.01M PBS溶液：称取0.2g KCl，7.9g NaCl，1.44g Na2HPO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml去离子水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后使用去离子水至1L，冷藏备用。
(3)4％多聚甲醛(w/v)溶液：称取4g多聚甲醛，溶解于100ml去离子水中，过夜搅拌，充分溶解至体系透明。
二、试验方法与结果
2.1DSS诱导的急性UC小鼠模型的建立
将小鼠适应性喂养5天后，随即分为正常对照组，模型组，药物组(柳氮磺吡啶、总皂苷高低剂量给药组)，每组10只。正常对照组1～10天正常饲养；模型组1～7天自由饮用DSS，8～10天自由饮水；药物组1～7天自由饮用DSS+药物，8～10天只饮用药物。
2.2急性UC小鼠模型观察
在实验期间，每日称量小鼠的体重，观察小鼠的粪便性状及便隐血情况。
2.3急性UC小鼠模型病理组织学观察
第10天处死小鼠，新鲜肠管纵行切开，弃去肠内容物并用生理盐水冲洗干净，截取自肛门以上1cm处至盲肠下端的肠组织，用滤纸吸去肠壁水分，测量结肠长度。截取肛门以上2cm处的肠组织，清除内容物，4％甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色，光镜下观察上皮损伤和溃疡形成、溃疡深度、炎性细胞浸润、炎细胞浸润深度、隐窝破坏、等病变严重程度。
2.4统计学处理
使用SPSS软件进行统计学分析，两个独立样本比较采用t检验，采用平均数±标准差(X±SD)表示，#p<0.05表示空白组与模型组差异显著，##p<0.01表示空白组与模型组差异极显著；*p<0.05表示给药组与模型组差异显著，**p<0.01表示给药组与模型组差异极显著。
三、试验结果
3.1急性UC小鼠模型的体重变化
整个实验过程中，正常对照组小鼠基本维持稳定，饮食饮水量均正常，粪便正常为棕黄色成型软便。而模型组小鼠在饮用2.5％DSS的前三天，体重呈现缓慢下降趋势。第四天时小鼠体重出现明显下降，且开始出现便血，粪便呈稀状。体重下降情况和便血情况随着时间增加而更加严重，小鼠后期的肛门出现了粘附的粘液状粪便。停止饮用2.5％DSS后，模型组小鼠的体重仍保持下降趋势，至第十天时，与正常对照组相比，体重变化有显著性差异，表明UC小鼠模型的建立成功。阳性药组和七叶皂苷给药组小鼠虽然同样出现体重下降，但体重下降幅度较模型组小，表明高剂量七叶皂苷、低剂量七叶皂苷能够降低结肠炎小鼠体重下降比例。
3.2急性UC小鼠模型的结肠长度变化
七叶皂苷高低剂量及阳性药对DSS诱导的UC小鼠结肠长度影响如图3所示，正常对照组的小鼠结肠长度、外观正常，并且粪便为干硬的球形。模型组小鼠出现结肠腔内出血、血便、粪便不成形、恶臭，结肠长度明显变短。阳性药组的小鼠结肠外观和粪便形状与对照组相似，结肠长度与模型组具有显著差异。七叶皂苷灌胃给药之后，小鼠结肠外观及长度恢复明显，小鼠结肠红肿、充血现象得到明显的改善，结肠长度与模型组具有显著差异。
3.3急性UC小鼠模型的病理组织学观察
DSS诱导的急性溃疡性结肠炎，结肠前段有不同程度的病理变化，主要病变体现在结肠的中后段，通过显微镜下观察受试药物及阳性药对DSS诱导的UC小鼠结肠末端的组织学变化影响如图4所示。
正常对照组小鼠结肠黏膜上皮细胞完整并且可见许多杯状细胞，固有层腺体形态正常且排列整齐，粘膜下层无水肿，未见炎性细胞浸润，无变形坏死。模型组小鼠结肠组织表现为严重的病变，出现大面积的结肠黏膜上皮缺损，黏膜上皮细胞严重坏死脱落形成糜烂，几乎不可见杯状细胞，大量的炎性细胞浸润，固有层腺体完全不成型。给药组灌胃给药之后，小鼠结肠恢复明显，不仅黏膜上皮恢复完整并且可见许多杯状细胞，固有层腺体形态恢复正常，炎性细胞浸润现象消失，无变形坏死。
四、试验结论
阳性药、受试药物干预对DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎起到不同程度的改善作用。体重都有所上升，小鼠结肠长度、外观、便型也出现不同程度的改善。阳性药、受试药物干预之后，小鼠结肠长度变化两项评价指数与模型组相比差异极显著(p<0.01)；总皂苷低剂量组小鼠体重变化与模型组相比差异显著(p<0.05)，其余给药组小鼠体重变化评价指数与模型组相比差异极显著(p<0.01)。小鼠结肠长度病理组织学观察表明：阳性药、受试药物干预之后，小鼠结肠、结肠黏膜上皮细胞、杯状细胞、固有层腺体等出现不同程度的恢复，其中七叶皂苷高剂量组灌胃给药之后，小鼠结肠恢复最为明显，不仅黏膜上皮恢复完整并且可见许多杯状细胞，不仅结肠黏膜上皮细胞、杯状细胞、固有层腺体得到明显恢复，炎性细胞浸润现象消失，无变形坏死。因此，七叶皂苷高剂量组的治疗效果优于七叶皂苷低剂量组。
实施例3
七叶皂苷100mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂。
七叶皂苷50mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。
七叶皂苷100mg，与淀粉50mg、滑石粉5mg混合采用常规技术制成散剂。
七叶皂苷100mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂。
七叶皂苷100g，与1000g水采用传统煎煮法煎煮两次，合并煎液制成汤剂。

Claims (5)

1.七叶皂苷提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途，其特征在于，所述七叶皂苷提取物是通过以下方法制得：
（1）取娑罗子，先用乙醇超声提取，从中提取粗七叶皂苷；
（2）以D101大孔吸附树脂分离纯化（1）中得到的粗七叶皂苷；
（3）将（2）中所得产物用硅胶柱层析精制获得七叶皂苷提取物，其中七叶皂苷的含量为70％~95％。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述七叶皂苷提取物主要包含七叶皂苷A、B、C、D。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述七叶皂苷提取物添加药学上可接受的辅料制备成制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述制剂为口服制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述口服制剂为口服液、冲剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂和汤剂。
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