CN111937887B - 5-氟-2’-脱氧尿苷在抑制和/或防治螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了5‑氟‑2'‑脱氧尿苷在抑制轮虫孵化中的应用，具体利用化学药物5‑氟‑2'‑脱氧尿苷抑制轮虫非混交卵孵化的特性，提供一种控制螺旋藻(Spirulina)生产中有害生物‑褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)的控制方法。本发明通过在轮虫生殖前期向培养液中添加5‑氟‑2'‑脱氧尿苷，可显著降低轮虫产卵量，当其浓度为110μg/L‑260μg/L时，能显著抑制轮虫孵化的效果，进而降低螺旋藻生产池中褶皱臂尾轮虫数量，减少螺旋藻生产过程轮虫种群爆发带来的生产减产和危害。本发明方法安全、有效、使用剂量少，同时对螺旋藻的生长无明显的副作用。

Description

5-氟-2’-脱氧尿苷在抑制和/或防治螺旋藻规模化生产中褶 皱臂尾轮虫的应用

技术领域

本发明涉及轮虫的抑制和防治，具体涉及5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/或防治轮虫中的应用，特别是5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/或防治螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫的应用。

背景技术

螺旋藻(Spirulina)属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖藻目、颤藻科、螺旋藻属，是一种低等原核水生植物，因其为单细胞或多细胞组成的螺旋丝状体而得名(又称节旋藻)，广泛分布于热带、亚热带地区的淡水或盐碱湖中。螺旋藻粉的蛋白质含量为60％-70％，远远高于目前动植物可食用蛋白质含量，且螺旋藻蛋白质全部为水溶性，利于人体吸收，是一种理想的高蛋白来源；藻细胞还富含碳水化合物、藻类多糖、不饱和脂肪酸、微量元素以及高含量的藻蓝蛋白、β-胡萝卜素和γ-亚麻酸等，具有良好的保健和药理作用，并能调节血糖、血脂、增强免疫力，在抗辐射、抗衰老、抗疲劳和抗癌方面亦具有重要价值。并被联合国粮食及农业组织推荐为21世纪最优秀的绿色食品之一，因此，螺旋藻养殖产业，对于丰富人类的食品和蛋白质供应以及增进人类的健康，都有着非常重要的意义。

目前，随着人们对螺旋藻保健及医疗作用的认识及需求，螺旋藻产品有着广阔的市场空间。规模化养殖螺旋藻、开发螺旋藻资源可获得人类大量需求的高附加值生物活性物质，同时也是获得再生生物能源的理想途径。但是，随着培养规模的逐步扩大，养殖过程中滤食性微型动物的出现(尤其是轮虫)，严重影响了螺旋藻的产量和产品质量。在胁迫螺旋藻生长的逆境因素中，有些因素对生产而言甚至是毁灭性的，轮虫危害即是其中之一。

轮虫主要以微型浮游生物(藻类、原生动物等)、细菌、有机碎屑等为食，体长大多在500μm左右，生活史具有世代交替现象，环境条件适合时以孤雌生殖为主，繁殖速度极快。褶皱臂尾轮虫一直是螺旋藻等其他微藻规模化生产上的主要敌害生物。同时，由于轮虫和螺旋藻的生长条件诸如温度、光照等环境因素有一定的重叠性，且轮虫抗逆性极强，在遭遇不利环境时会形成休眠卵，抗寒耐旱，因此轮虫一旦爆发则很难控制。

在螺旋藻培养中轮虫污染控制技术一直是悬而未决的技术难题，由于螺旋藻主要是作为食品管控，所以在杀灭轮虫时药物的选择必须谨慎，选择药品的前提条件就是既要杀灭养殖池中的轮虫、对螺旋藻的伤害较低或者无害，更要求对人体无毒、无害。已报道的一些轮虫防治方法：一是通过物理方法过滤，前期虽有一定的效果，过滤掉一些体型较大的个体，种群短暂下降，但对于轮虫幼体和卵却是无用的，无法根除轮虫污染。二是使用杀虫剂，往往在杀灭轮虫的同时也极大损害了藻类的生长，得不偿失。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制轮虫孵化中的应用，具体为5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫中的应用。本发明提出了一种5-氟-2′-脱氧尿苷的全新的应用，解决了现有的轮虫防治的缺陷，如物理防治方法对于轮虫幼体和卵是无用的，无法根除轮虫污染；使用化学杀虫剂，往往在杀灭轮虫的同时也极大损害了藻类的生长，得不偿失。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/ 或防治轮虫中的应用。

作为优选，所述5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制轮虫孵化中的应用。

进一步地，所述5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制轮虫非混交卵孵化中的应用。

其中，所述应用为通过在轮虫生殖前期将5-氟-2′-脱氧尿苷作用于轮虫，以达到轮虫孵化的抑制作用。

作为优选，所述-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫中的应用。

更进一步地，所述-氟-2′-脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫种群中的应用。

其中，所述应用为在轮虫生殖前期向培养液中添加5-氟-2′-脱氧尿苷，当其浓度为110μg/L-260μg/L时，即可达到抑制和/或防治褶皱臂尾轮虫卵孵化的效果。

本发明所述用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫的抑制和/或防治的方法，包括如下步骤：在轮虫生殖前期向培养液中添加5-氟-2′-脱氧尿苷，当其浓度为110μg/L-260μg/L时，即可达到抑制和/或防治轮虫卵孵化的效果。

本发明所述抑制和/或防治轮虫卵孵化的药物或者试剂，其含有5-氟-2′-脱氧尿苷作为有效成分以及用于合成药物或者试剂的辅料。

本发明所述用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫的抑制和/或防治的药物或者试剂，其含有5-氟-2′-脱氧尿苷作为有效成分以及用于合成药物或者试剂的辅料。

本发明提供了一种5-氟-2′-脱氧尿苷在在抑制和/或防治轮虫中的新用途，尤其是抑制轮虫卵的孵化中的新用途，该用途为防治轮虫提供了一种新的思路和方向。

本发明中的药品5-氟-2′-脱氧尿苷购自上海沃凯化学试剂有限公司，化学药剂，纯度99％。将药品溶解于蒸馏水中，得到母液，母液放置于4℃低温环境中，避光密封保存，备用。

将上述母液加入到被轮虫污染的螺旋藻藻液中，通过减少轮虫产卵量及抑制轮虫卵的孵化，即可有效控制住轮虫种群。

实验时，在体视显微镜下观察实验轮虫，挑选新生儿幼体(<2h)作为实验对象。直接将5-氟-2′-脱氧尿苷作用于新生儿幼体(<2h)，每隔24h更换一次新鲜培养液。

本发明的作用机理主要包括：

5-氟-2′-脱氧尿苷在被细胞摄取后，通过细胞的酶如(脱氧)胞苷激酶(DCK)、胸苷激酶(TK)和/或核苷(酸)激酶磷酸化。这些抗代谢物随后可以干扰DNA/ RNA前体的从头合成而最终抑制DNA/RNA合成，导致细胞毒性/抑制活性。

本发明中所用药物5-氟-2′-脱氧尿苷为美国食品药品管理局(Food and DrugAdministration FDA)允许使用的，本添加物的使用剂量对人体无毒无害符合 FDA监管要求。

本发明利用5-氟-2′-脱氧尿苷抑制细胞增殖的机理，切断轮虫子代DNA复制，从而阻断其后代的产生，以达到我们期待的效果。经过多次实验验证，药品使用剂量小，在此剂量下，轮虫后代明显减少、个体生殖力受到抑制、种群繁殖速度大幅下降，且不会对螺旋藻的生长产生影响，是目前看来较为安全有效的方法。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提出了5-氟-2′-脱氧尿苷在抑制轮虫孵化中的应用，具体为5-氟-2′- 脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫中的应用。本发明试验药品5-氟-2′-脱氧尿苷较普通的物理化学方法有其独特优势，避免了使用其他化学制剂产生的毒性大、消灭轮虫不彻底、污染生产水质、影响螺旋藻产量的缺点；同时也避免了物理方法，无法根除轮虫污染的问题。本发明通过切断轮虫子代的DNA复制，抑制轮虫的孵化，阻断其后代的快速生长，以达到防治轮虫的效果。经过多次实验验证，药品使用剂量小，符合FDA规定的食品添加规格。在此使用剂量下，轮虫后代明显减少、个体生殖力受到抑制、种群繁殖速度大幅下降。同时，在该剂量下不会对螺旋藻的生长产生影响。

本发明的5-氟-2′-脱氧尿苷可以用于制备新型轮虫卵孵化的生物药物或者试剂，安全环保，尤其是针对螺旋藻培养中褶皱臂尾轮虫污染的药物或者试剂，并且不会对螺旋藻的生长产生影响。

附图说明

图1为5-氟-2′-脱氧尿苷对褶皱臂尾轮虫产卵量的影响示意图。

图2为5-氟-2′-脱氧尿苷作用下褶皱臂尾轮虫种群增长率随时间的变化情况示意图。

图3为随培养天数5-氟-2′-脱氧尿苷对螺旋藻生长的影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中，轮虫为取自江苏省东台市的褶皱臂尾轮虫，螺旋藻来源于中国科学院淡水藻种库。

5-氟-2′-脱氧尿苷购自上海沃凯化学试剂有限公司，化学药剂，纯度99％。

实施例1

5-氟-2′-脱氧尿苷对褶皱臂尾轮虫产卵量的影响。

轮虫为取自江苏省东台市的褶皱臂尾轮虫，实验前挑选携带非混交卵的雌性个体(一般保证不挑到混交雌体即可)，转移到微孔板中培养，25℃、光照4000Lx、光暗比12h：12h。在体视显微镜下随机挑取进行实验，然后从中挑选由非混交母体孵出的<2h的幼体，置于24孔细胞培养板中。每孔随机置入1只大小基本相同的轮虫，加入由改良的人工海水(NaCl 24.54g/L、KBr 0.1g/L、KCl 0.7 g/L、H₃BO₃ 0.003g/L、Na₂SO₄ 4.09、NaHCO₃ 0.185g/L、NaF 0.003g/L、 CaCl₂·2H₂O 1.54g/L、MgCl₂·6H₂O 11.1g/L、SrCl₂·6H₂O 0.017g/L) 、螺旋藻及5-氟-2′-脱氧尿苷组成的混合培养液1mL，其中螺旋藻的密度为 OD₅₆₀＝0.1，共设置5个5-氟-2′-脱氧尿苷梯度(0、60、110、160、210、260μg/L) 和一个对照组(未添加5-氟-2′-脱氧尿苷)，每个浓度分别设置12组平行。5-氟 -2′-脱氧尿苷为提前配制好的母液，低温避光密封保存。每12h观察并记录每只轮虫的产卵及孵化情况，每隔24h更换一次新鲜培养液。结果如图1所示：实验组轮虫产卵量显著少于未添加药品的对照组，且随5-氟-2′-脱氧尿苷的浓度从60 μg/L逐渐增加到260μg/L，轮虫产卵能力逐渐降低。轮虫产卵量得到抑制，随着母体的自然死亡，轮虫种群可以得到很好的控制。

实施例2

5-氟-2′-脱氧尿苷对褶皱臂尾轮虫种群的影响。

轮虫为取自江苏省东台市的褶皱臂尾轮虫，实验前挑选携带非混交卵的雌性个体，转移到微孔板中培养，25℃、光照4000Lx、光暗比12h：12h。在体式显微镜下随机挑取进行实验，然后从中挑选由非混交母体孵出的<2h的幼体，置于 6孔细胞培养板中。每孔随机置入5只大小基本相同的轮虫，加入5mL由改良人工海水、螺旋藻及5-氟-2′-脱氧尿苷组成的混合培养液，其中螺旋藻的密度为 OD₅₆₀＝0.1，共设置5个5-氟-2′-脱氧尿苷梯度(0、60、110、160、210、260μg/L) 和一个对照组(未添加5-氟-2′-脱氧尿苷)，每个浓度分别设置6组平行。5-氟-2′- 脱氧尿苷为提前配制好的母液，低温避光密封保存。每24h观察并记录每孔轮虫的种群数量，同时更换一次新鲜培养液。结果如图2所示：实验组轮虫药品浓度为60μg/L时，种群增长率已显著低于对照组，其中260μg/L的5-氟-2′-脱氧尿苷抑制效果最好，种群基本无增长，维持在较低水平，第4天种群即开始下降。

实施例3

5-氟-2′-脱氧尿苷对螺旋藻生长的影响。

将螺旋藻藻种提前放在适宜光照温度(3000LX，25℃)下活化，实验共设置6个5-氟-2′-脱氧尿苷浓度(0、60、110、160、210、260μg/L)，每个浓度设置3组平行。准备250ml锥形瓶，每瓶接种等量的处于指数增长期的螺旋藻藻种，培养基为Zarrouk培养基。每瓶藻液分别加入5-氟-2′-脱氧尿苷，使其最终浓度分别为0、60、110、160、210、260μg/L。每隔24h在超净台中取样1ml，使用分光光度计(ULTRSPEC2100)测量每瓶螺旋藻的光密度值。螺旋藻生长光密度随培养天数的变化，如图3。结果显示，在实验所用5-氟-2′-脱氧尿苷浓度下，其对螺旋藻的生长无明显抑制作用，可用于防治轮虫。

综上所述，本发明在轮虫生殖前期向培养液中添加5-氟-2′-脱氧尿苷，可显著降低轮虫产卵量，当其浓度为110μg/L-260μg/L时，能起到显著抑制轮虫孵化的效果，进而降低螺旋藻生产池中轮虫数量，减少螺旋藻生产过程轮虫种群爆发带来的生产减产和危害，安全、有效、使用剂量少，同时对螺旋藻的生长无明显的副作用。

Claims (8)

1.5-氟-2'-脱氧尿苷在用于螺旋藻规模化生产中抑制和/或防治轮虫中的应用，所述5-氟-2'-脱氧尿苷浓度为60μg/L-260μg/L。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述5-氟-2'-脱氧尿苷在抑制轮虫孵化中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述5-氟-2'-脱氧尿苷在抑制轮虫非混交卵孵化中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为通过在轮虫生殖前期将5-氟-2'-脱氧尿苷作用于轮虫，以达到轮虫孵化的抑制作用。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述5-氟-2'-脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫中的应用。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述5-氟-2'-脱氧尿苷在抑制和/或防治用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫种群中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用优选为在轮虫生殖前期向培养液中添加5-氟-2'-脱氧尿苷，当其浓度为110μg/L-260μg/L时，即可达到抑制和/或防治褶皱臂尾轮虫卵孵化的效果。

8.一种用于螺旋藻规模化生产中褶皱臂尾轮虫的抑制和/或防治的方法，其特征在于，包括如下步骤：在轮虫生殖前期向培养液中添加5-氟-2'-脱氧尿苷，当其浓度为110μg/L-260μg/L时，即可达到抑制和/或防治轮虫卵孵化的效果。

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