CN111936857A - 预测对疗法的反应的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于预测对疗法的反应的方法和试剂。更具体地，本公开涉及用于检测癌细胞中不同形式的程序性死亡配体‑1(PD‑L1)的方法和试剂，这些方法和试剂可用于检测PD‑L1在癌细胞的细胞区室(例如细胞核、细胞质、细胞膜)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(包括免疫疗法)有反应的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法的反应者或对疗法的无反应者、用于管理癌症患者的治疗、以及用于预测临床结果。

Description

预测对疗法的反应的试剂和方法
技术领域
本申请要求于2018年1月15日提交的澳大利亚临时申请号2018900108名称为“蛋白分子及其用途”，以及于2018年2月8日提交的澳大利亚临时申请号2018900392名称为“用于预测对疗法的反应的试剂和方法”的优先权，其各自的内容通过引用整体并入本文。
本发明整体上涉及用于预测对疗法的反应的方法和试剂。更具体地，本发明涉及用于检测癌细胞中不同形式的程序性死亡配体-1(PD-L1)的方法和试剂，其可用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核，细胞质、细胞膜)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(包括免疫疗法)反应的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法的反应者或无反应者、用于管理癌症患者的治疗、以及用于预测临床结果。
背景技术
癌症是全世界发病率和死亡率的重要原因。这些年来，尽管许多不同类型癌症的护理标准已大大改善，但当前的护理标准仍无法满足对改善癌症治疗的有效疗法的需求。靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1(PD-1)及其配体PD-L1的免疫肿瘤试剂的临床应用，已使得对治疗多种类型癌症的标准护理得到改善。尽管这些检查点抑制剂在某些癌症中产生了改善的临床反应，但持久性临床反应仅发生在大约10-45％的患者中。此外，大量的肿瘤或者是具有耐受性的、或者是变成难治性的。例如，大约20-50％的黑色素瘤和肺癌将对免疫疗法产生显著反应，而其他则不会。因此，从健康护理和患者生活质量的角度来看，确定哪些受试者是更好的免疫疗法候选者是非常有利的。
PD-L1是一种细胞表面糖蛋白，是PD-1的两个已知配体之一。已经在各种免疫细胞的表面上观察到PD-L1的表达，并且PD-L1 mRNA在非淋巴组织中表达，包括在血管内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞中表达，以及在扁桃体和胎盘组织中表达。还已经在多种人类癌症中观察到PD-L1表达，并且肿瘤细胞表达的PD-L1与PD-1的相互作用可以诱导对肿瘤特异性T细胞的抑制或凋亡。已经表明，在包括例如卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌和肝癌以及黑色素瘤在内的若干癌症中，PD-L1的表达与不良的预后和降低的总生存期相关，无论后续治疗如何。已经表明，阻断PD-L1与PD-1结合的抗PD-1单克隆抗体(mAb)具有针对多种类型肿瘤的抗肿瘤活性，早期的人临床数据表明，肿瘤表达PD-L1的患者更有可能对抗PD-1疗法有反应，如在例如国际专利申请公开号WO2014/165422中所公开的。
尽管已经报道，在肿瘤细胞上对PD-L1的免疫染色与临床试验中的反应相关，但在一项临床研究中，PD-L1染色的总体准确性仅约为62％(Topalian等人，2012，N Engl.J Med366(26)：2443-2454)，具有不完美的阴性和阳性预测值(Weber等人，2013.J Clin Oncol31(34)：4311-4318)。
因此，在本领域中仍然需要以改善的准确性帮助预测对疗法(包括免疫疗法)的反应的方法和试剂。
发明内容
本发明部分源于以下确定：癌细胞中不同的PD-L1的翻译后修饰导致该糖蛋白定位于不同的细胞区室，这可显著影响癌细胞对疗法的敏感性或耐受性，所述疗法包括细胞毒性疗法和免疫疗法。特别地，本发明人已经发现PD-L1的核定位序列(NLS)中的赖氨酸(即，PD-L1-263K)的不同翻译后修饰控制PD-L1是定位在细胞核还是细胞质/细胞膜上。尤其是，发现PD-L1-263K的甲基化(即，PD-L1-263KMe)基本上将PD-L1定位于癌细胞的细胞质和/或细胞膜，这与癌细胞对疗法的敏感性相关。但是，还发现PD-L1-263K的乙酰化(即，PD-L1-263KAc)主要将PD-L1定位于细胞核，这与上皮向间充质转化(EMT)和/或癌细胞的干性相关，并与对疗法的耐受性相关。实际上，已经确定核PD-L1的表达导致化学耐受性、干性和/或疾病进展的生物标志物的显著上调，包括C-C基序趋化因子配体5(CCL5，也称为RANTES)和NODAL。另外，本发明人已经发现，这些PD-L1-263KAc和PD-L1-263KMe生物标志物(在本文中也称为“对疗法的反应”生物标志物)可以任选地与一种或多种间充质和/或干性生物标志物组合使用，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关，例如prominin-1(CD133)、醛脱氢酶1家族成员A1(ALDH1A)、E1A结合蛋白300kDa(P300)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1(DNMT1)、SET结构域分叉1(SET Domain Bifurcated 1，SETDB1)和ATP结合盒亚家族B成员5(ABCB5)，用于监测对疗法的反应以及用于预测治疗结果和临床结果。这些发现已被简化为方法和试剂的实践中，所述方法和试剂用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置、用于检测不同形式的PD-L1以预测和/或监测对疗法的反应、用于根据癌细胞中表达的PD-L1的形式对患者进行分层、用于根据分层来管理患者的治疗、以及用于预测临床结果，如下文所述。
因此，一方面，本发明提供了用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1的核定位序列中的翻译后修饰，从而确定PD-L1所在的癌细胞的细胞区室。在一些实施方案中，该方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263的乙酰化(本文也称为“PD-L1-K263Ac”)，从而确定细胞区室是细胞核。在这种类型的代表性的示例中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，正常细胞或上皮癌细胞)，检测到癌细胞中的PD-L1-K263Ac的水平升高，这指示细胞区室是细胞核。在一些实施方案中，方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263的甲基化(本文也称为“PD-L1-K263Me”)，从而确定细胞区室是细胞质和/或细胞膜。在这种类型的说明性示例中，方法包括相对于合适的对照(例如，间充质癌细胞)检测到癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平升高，这指示细胞区室是细胞质和/或细胞膜。
本发明的另一方面提供了用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1的核定位序列的翻译后修饰，从而预测癌细胞对疗法有反应的可能性。在一些实施方案中，方法包括检测癌细胞中PD-L1-K263的乙酰化(在本文中也称为“PD-L1-K263Ac”)，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。在一些实施方案中，方法包括检测癌细胞中PD-L1-K263的甲基化(在本文中也称为“PD-L1-K263Me”)，从而确定癌细胞对疗法的敏感性的可能性增加。
在相关方面，本发明提供了用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1-K263Ac的存在，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。在这种类型的代表性示例中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，正常细胞或上皮癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，这指示癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
在一些相同和其他实施方案中，方法包括使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
在其他相关方面，本发明提供了用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性的方法。这些所述方法一般地包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1-K263Me的存在，从而确定癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。在这种类型的说明性示例中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，间充质癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，这指示癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
在一些相同和其他实施方案中，方法包括使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而确定癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
在其他相关方面，本发明提供了用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性的方法。这些方法一般地包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：测量癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平、测量癌细胞中PD-L1-K263Me的水平；比较癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平和PD-L1-K263Me的水平；和根据比较预测癌细胞对疗法的反应，其中癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平高于PD-L1-K263Me的水平，表明癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加，并且其中癌细胞中PD-L1-K263Me的水平高于PD-L1-K263Ac的水平，表明癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
在一些实施方案中，方法包括：使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平、以及包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较预测癌细胞对疗法有反应的可能性，其中样本中所述第一复合物的水平高于所述第二复合物的水平，表明癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加，并且其中样本中所述第二复合物的水平更高，表明癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
在预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应(例如，敏感性或耐受性)的可能性的方法的一些实施方案中，所述方法适合用于监测对疗法的反应。在这种类型的非限制性示例中，方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测对疗法的反应和/或疾病负担。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示癌细胞可能对疗法无反应。在一些实施方案中，方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示癌细胞可能对疗法无反应。在其他实施方案中，方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示癌细胞可能对疗法有反应。
在预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应(例如，敏感性或耐受性)的可能性的方法的一些实施方案中，所述方法适合用于监测对疗法的反应。在这种类型的非限制性示例中，该方法包括检测癌细胞中PD-L1-K263Me和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物合适地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测对疗法的反应和/或疾病负担。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平不变，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示癌细胞可能对疗法无反应。在一些实施方案中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示癌细胞可能对疗法有反应。在其他实施方案中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示癌细胞可能对疗法有反应。
在另一方面，本发明提供了将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或对疗法的无反应者的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而将患者分层为可能对疗法的反应者或对疗法的无反应者。在一些实施方案中，该方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac，和将患者分层为可能对疗法的无反应者。在这种类型的说明性示例中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的无反应者。在一些实施方案中，该方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和将患者分层为可能对疗法的反应者。在这种类型的非限制性示例中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的反应者。在其他实施方案中，该方法包括：使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较将患者分层为可能的反应者或无反应者，其中当样本中第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则将患者分层为可能的无反应者，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则将患者分层为可能的反应者。
上面和本文其他地方广泛描述的预测和分层方法为临床医生或医师提供了有关对癌症疗法治疗的反应可能性的信息。根据这些方法的结果，临床医生或医师可以：(i)根据受试者可能对疗法有反应，使用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗受试者；(ii)根据受试者可能不对疗法有反应，避免使用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗受试者；(iii)使受试者参加新疗法的临床试验；(iv)用替代疗法(例如刺激癌细胞的间充质向上皮转化的疗法)，治疗不对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的受试者；和/或(v)与受试者讨论可能的治疗和结果情况。因此，本发明的另一方面提供了管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的方法，这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：根据患者是可能对疗法的反应者，选择用疗法治疗的癌症患者，或根据患者是可能对疗法的无反应者，选择不用疗法治疗的癌症患者，以及根据选择，用疗法治疗或不用疗法治疗患者，其中所述选择根据分层方法，所述分层方法包括从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而将所述患者分层为可能对疗法的反应者或对疗法的无反应者。在一些实施方案中，分层方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和将所述患者分层为可能对疗法的反应者。在这种类型的非限制性示例中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测样本中包含抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的反应者。在一些实施方案中，分层方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac，和将所述患者分层为可能对疗法的无反应者。在这种类型的说明性示例中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测样本中包含抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的无反应者。在其他实施方案中，该方法包括：使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；以及根据比较将患者分层为可能的反应者或无反应者，其中当样本中第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则将患者分层为可能的无反应者，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则将患者分层为可能的反应者。
在用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或对疗法的无反应者、以及用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的的方法的一些实施方案中，该方法进一步包括检测癌细胞中PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，这些方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，表达PD-L1-K263Ac的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能不变。在其他实施方案中，这些方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能增加。在其他实施方案中，该方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者可能对疗法有反应和/或患者的疾病负担可能降低。
在用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或对疗法的无反应者、以及用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的方法的一些实施方案中，该方法进一步包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，这些方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者可能对疗法有反应和/或患者的疾病负担可能降低。在其他实施方案中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能增加。
本发明的另一方面提供了用于预测用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而预测患者的治疗结果。在一些实施方案中，该方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和预测阴性治疗结果。在这种类型的说明性示例中，阴性治疗结果是进行性疾病。在一些相同和其他实施方案中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而预测患者的阴性治疗结果。在一些实施方案中，该方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和预测阳性治疗结果。在这种类型的说明性示例中，所述阳性治疗结果选自对疗法有部分或完全反应和稳定的疾病。在一些相同和其他实施方案中，该方法包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而预测患者的阳性治疗结果。在其他实施方案中，该方法包括：使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较预测患者的治疗结果，其中当所述样本中的第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则预测治疗结果为阴性治疗结果，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则预测治疗结果为阳性治疗结果。
在预测用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗的癌症患者的治疗结果的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而预测患者的治疗结果。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，这些方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，表达PD-L1-K263Ac的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变或升高，这指示患者的治疗结果为阴性。在其他实施方案中，该方法包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，患者的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者的治疗结果为阳性。
在用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、以及用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的方法的一些实施方案中，该方法还包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。至少一种间充质和/或干性生物标志物的非限制性示例包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
在一些实施方案中，这些方法包括相对于合适的对照(例如，暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者的治疗结果为阳性。在其他实施方案中，所述方法包括相对于合适的对照(例如，暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示患者的治疗结果为阴性。
在用于预测治疗结果的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括根据预测的治疗结果来预测癌症患者的临床结果。临床结果的非限制性示例包括肿瘤反应(TR)、总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无疾病生存期、到肿瘤复发的时间(TTR)、到肿瘤进展的时间(TTP)、相对风险(RR)、毒性或副作用。
本发明的另一方面提供了用于治疗癌症患者的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：根据将癌症患者分层为可能对治疗剂的反应者，向该癌症患者施用有效量的治疗剂(例如，细胞毒性剂或免疫治疗剂)，其中分层是通过上文和本文其他地方广泛描述的分层方法进行的。
在另一方面，本发明提供了特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子，其适用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核)中的位置，所述抗原结合分子用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗。
在相关方面，本发明提供了包含PD-L1-K263Ac和特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子的复合物。
在另一方面，本发明提供了特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子，其适用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞质和/或细胞膜)中的位置，所述抗原结合分子用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗。
在相关方面，本发明提供了包含PD-L1-K263Me和特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子的复合物。
在相关方面，本发明提供了试剂盒，其用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核、细胞质和/或细胞膜)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗，所述试剂盒包含特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子和/或特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子。任选地，试剂盒可以包含一个或多个对照，所述对照包括阳性和阴性对照。在这种类型的说明性示例中，阳性对照可以选自PD-L1-K263Ac多肽或PD-L1-K263Me多肽。在一些实施方案中，试剂盒包含用于执行上文和本文其他地方广泛描述的一种或多种方法的指导材料。
在以上和本文其他地方公开的任何方面的特定实施方案中，抗原结合分子(例如，抗PD-L1-K263Ac抗原结合分子和/或抗PD-L1-K263Me抗原结合分子)与可检测的标记或报告分子直接或间接结合。
本发明还公开了PD-L1结合赖氨酸乙酰转移酶P300和甲基转移酶DNMT1和SETDB1(它们是化学耐受性、干性和/或疾病进展的生物标志物)，形成复合物，刺激癌细胞的EMT形成和/或干性、以及对疗法的耐受性，或者与癌细胞的EMT形成和/或干性、以及对疗法的耐受性相关。本发明人提出PD-L1和这些结合配偶体的复合物也可以用于上文和本文其他地方所述的方法中。因此，本发明的另一方面提供了方法，其用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置、预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗、和/或预测通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(i)从癌症患者获得样本，其中所述样本包含癌细胞；(ii)使样本与特异性结合所述样本中的PD-L1的第一抗原结合分子和特异性结合所述样本中的PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子接触，所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)当与样本中的包含PD-L1和PD-L1-结合配偶体的复合物结合时，检测第一和第二结合的抗原结合分子，其中样本中检测到的复合物水平相对于在对照样本(例如，包含正常细胞或上皮癌细胞的样本)中检测到的复合物水平升高时，表明PD-L1的细胞区室是细胞核、癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加、癌症患者可能对疗法是无反应者、选择癌症患者不使用疗法治疗、和/或预测对患者的治疗结果可能是阴性治疗结果。
在另一方面，本发明提供了方法，其用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置、预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗、和/或预测通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(i)从癌症患者获得样本，其中所述样本包含癌细胞；(ii)使样本与特异性结合所述样本中的PD-L1的第一抗原结合分子和特异性结合所述样本中的PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子接触，所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)当与样本中的包含PD-L1和PD-L1-结合配偶体的复合物结合时，检测第一和第二结合的抗原结合分子，其中样本中检测到的复合物水平相对于在对照样本(例如，包含正常细胞或上皮癌细胞的样本)中检测到的复合物水平不变或降低时，表明PD-L1的细胞区室是细胞质和/或细胞膜、癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加、癌症患者可能对疗法是反应者、选择癌症患者使用疗法治疗、和/或预测对患者的治疗结果可能是阳性治疗结果。
在相关方面，本发明提供了试剂盒，其用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗，所述试剂盒包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗原结合分子，(ii)特异性结合PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子，所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)结合第一和第二抗原结合分子的第三抗原结合分子。在特定的实施方案中，第三抗原结合分子包含可检测的标记。
在相关方面，本发明提供了一种复合物，其包含PD-L1和选自P300、DNMT1和SETDB1的PD-L1-结合配偶体、特异性结合复合物中PD-L1的第一抗原结合分子、与复合物中PD-L1-结合配偶体结合的第二抗原结合分子、和(iii)与复合物中第一和第二抗原结合分子中每一个结合的第三抗原结合分子。在一些实施方案中，PD-L1—PD-L1-结合配偶体复合物位于癌细胞中。在特定的实施方案中，第三抗原结合分子包含可检测的标记。
在另一方面，本发明提供了一种癌细胞，其包含复合物，所述复合物包含PD-L1和选自P300、DNMT1和SETDB1的PD-L1-结合配偶体、特异性结合复合物中PD-L1的第一抗原结合分子、与复合物中PD-L1-结合配偶体结合的第二抗原结合分子、和(iii)与复合物中第一和第二抗原结合分子中每一个结合的第三抗原结合分子。在特定的实施方案中，第三抗原结合分子包含可检测的标记。
在上文和本文其他地方描述的任何方面和实施方案中，治疗合适地是免疫疗法，例如但不限于免疫检查点抑制剂，包括特异性结合免疫检查点分子的拮抗性抗原结合分子(例如抗体)。在这种类型的代表性示例中，拮抗性抗原结合分子(例如抗体)特异性结合选自PD-1和CTLA4的免疫检查点分子。在其他实施方案中，所述疗法是细胞毒性疗法，合适地是采用化学治疗剂的细胞毒性疗法。
附图说明
图1是图形和照片表示，其显示分离自几种转移性癌症的间充质CTC中和化学耐受性癌细胞中的广泛的PD-L1，以及PD-L1与活性标志物H3k27ac和H3k4me3的共定位。(A)用兔抗PD-L1抗体探测MDA-MB-231或MCF7细胞，并使用ImageJ软件(ImageJ，NIH，Bethesda，MD，美国)分析数字图像，以确定总细胞核荧光强度(TNFI)或总细胞质荧光强度(TCFI)(n>20个细胞/样本)。(B)使用兔抗PD-L1抗体探测白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)/多西他赛(Docetaxel)异种移植模型分离自原发肿瘤的癌细胞，并使用ImageJ软件(ImageJ，NIH，Bethesda，MD，美国)分析数字图像，以确定TNFI和TCFI(n>20个细胞/样本)。另外描述的是每个治疗组中肿瘤体积的变化。(C)用兔抗PD-L1抗体和小鼠抗H3K27ac抗体、H3k4me3抗体或H3k9me3抗体探测MDA-MB-231或MCF7细胞，并用与Alexa Fluor 488缀合的驴抗兔二抗或与Alexa Fluor 568缀合的驴抗小鼠二抗标记。使用具有自动阈值的ImageJ软件并手动选择细胞核特定的感兴趣区域(ROI)，来计算每对抗体(n>20个细胞/样本)的皮尔逊系数相关性(Pearson’s co-efficient correlation，PCC)。
图2是示意图、照片和图形表示，其显示预测的PD-L1的乙酰化/甲基化基序的野生型和突变形式，以及它们对上皮癌细胞中的PD-L1的定位的影响。(A)PD-L1的3D示意图，显示了PD-L1野生型序列以及靶标残基K263周围甲基化和乙酰化的重要的保守基序。该区域是柔性C-末端区域的一部分，与假定的NLS结构域重叠或包含在其中。构建了三个PD-L1质粒：一个具有野生型规范序列和2个突变体，其中突变体1(Mutl)在263位具有赖氨酸到谷氨酰胺取代，并且被设计为模拟PD-L1的乙酰化形式；突变体2(Mut2)在相同位置具有赖氨酸到精氨酸的取代，并且被设计为模拟PD-L1的非乙酰化形式。设计这些质粒以测试该预测的乙酰化/甲基化基序对PD-L1核定位的重要性。(B)分析了在用质粒构建体转染的MCF7上皮乳腺癌细胞系中PD-L1的定位。在细胞上进行了免疫荧光显微镜检查，所述细胞被固定并用针对PD-L1的一抗进行探测。图形代表使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染的细胞中PD-L1的TNFI、TCFI和细胞核/细胞质荧光比率(Fn/c)(n>20个细胞/样本)。
图3是照片和图形表示，其显示了Mut1导致间充质、化学耐受性和/或干性生物标志物的表达增加。(A)分析了用图2所示的质粒构建体转染的MCF7上皮乳腺癌细胞系中CSV(EMT生物标志物)的表达。固定细胞并对其进行免疫荧光显微镜检查，用针对CSV的一抗进行探测。该图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染的细胞中的TCFI(n>20个细胞/样本)。(B)分析了用相同构建体转染的MCF7上皮乳腺癌细胞系中的CD133、EGFR和SNAIL(干性和/或间充质生物标志物)的表达。固定细胞并在其上进行免疫荧光显微镜检查，并用针对CD133、EGFR和SNAIL的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染的细胞中的TCFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。(C)使用WTS-1增殖测定法检查用图2所示的质粒构建体转染MCF7上皮乳腺癌细胞系对细胞增殖的影响，分别在用WST-1孵育2、3和4小时后的第24小时和第48小时。
图4是照片和图形表示，其显示PD-L1(核PD-L1)的乙酰化形式在细胞核中与表观遗传酶SETDB1和DMNT1共定位。(A)分析了用图2所示的质粒构建体转染的MCF7上皮乳腺癌细胞系中EHTM2、DMNTI和SETDB1(表观遗传酶)的表达。固定细胞并对其进行免疫荧光显微镜检查，用针对EHTM2、DMNTI和SETDB1的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染细胞中的TCFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。使用具有自动阈值的ImageJ软件并手动选择细胞核特定的感兴趣区域(ROI)来计算每对抗体的PCC，以便量化PD-L1和表观遗传酶的共定位。(B)分析了在4T1转移性小鼠癌症模型中EHTM2、DMNTI和SETDB1(表观遗传酶)的表达(A组＝对照组，B组＝白蛋白结合型紫杉醇治疗)。固定细胞并对其进行免疫荧光显微镜检查，用针对EHTM2、DMNTI和SETDB1的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染细胞中的TCFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。使用具有自动阈值的ImageJ软件并手动选择细胞核特定的感兴趣区域(ROI)来计算每对抗体的PCC。
图5是照片和图形表示，其显示核PD-L1增加上皮乳腺癌细胞中的DNA甲基化(5-mC)和药物耐受性生物标志物ABCB5。(A)用图2所示的质粒构建体转染MCF7上皮乳腺癌细胞系。固定细胞并对其进行免疫荧光显微镜检查，并用针对H3k9me3和ABCB5的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染细胞中的TFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。(B)用图2所示的质粒构建体转染MCF7上皮乳腺癌细胞系。固定细胞并对其进行免疫荧光显微镜检查，用针对5-mC和ABCB5的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的、转染细胞中的TFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。
图6是图形表示，其显示兔多克隆抗体对PD-L1-K263Ac或PD-L1-K263Me的特异性的ELISA分析。(A)具有未修饰的K263的PD-L1，(B)在K263具有乙酰基的PD-L1(B)和(C)在K263具有甲基(尤其是三甲基，Me3)的PD-L1。
图7是照片和图形表示，其显示了PD-L1-K263-Ac(PDL1Ac)保留在并限于细胞核中，而PD-L1-K263-Me(PDL1Me3)限于MDA-MB-231细胞的细胞质/细胞膜上。(A)使固定的MDA-MB-231s细胞透化，并对这些细胞进行免疫荧光显微镜检查，用兔抗PD-L1-WT、兔抗PD-L1-K263-Ac、兔抗PD-L1-K263-Me探测，市售的PD-L1抗体作为对照。图形表示Fn/c，其使用以下方程式：Fn/c＝(Fn-Fb)/(Fc-Fb)，其中Fn是细胞核荧光，Fc是细胞质荧光，Fb是背景荧光，使用ImageJ选择核减去背景(n＝>20个细胞/样本)。(B)固定的MDA-MB-231s细胞，黑色素瘤CTC(来自对免疫疗法的反应者和对免疫疗法的无反应者)没有被透化，对这些细胞进行免疫荧光显微镜检查，用兔抗PD-L1-WT、兔抗PD-L1-K263-Ac、兔抗PD-L1-K263-Me和抗CSV抗体进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景的TCFI或TNFI(n>20个细胞/样本)。
图8是照片和图形表示，其显示使用图2所示的质粒构建体转染的MCF7上皮乳腺癌细胞系中干性和药物耐受性生物标志物(CD133、ABCB5)的分析，使用兔抗PD-L1-WT、兔抗PD-L1-K263-Ac、兔抗PD-L1-K263-Me共标记。固定细胞，并对这些细胞进行免疫荧光显微镜检查，用针对CD133、ABCB5、PD-L1-WT、PD-L1-K263-Ac和PD-L1-K263-Me的一抗进行探测。图形表示使用ImageJ选择核减去背景测量的转染细胞中的TCFI(n>20个细胞/样本)。
图9是照片和图形表示，显示PD-L1 K263-Ac在较高的疾病负担中增加。(A)用对PD-L1 K263-Ac和间充质/药物耐受性生物标志物CD133和ABCB5特异性的抗体筛选黑色素瘤血液中分离的CTC，黑色素瘤血液来自根据RECIST 1.1的完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定的疾病(SD)或进行性疾病(PD)。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对CD133、PD-L1 K263-Ac和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测，DAPI是与DNA中富含A-T的区域牢固结合的荧光染料。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PDL1的TNFI和ABCB5的TFI(n＝每组5位患者)。(B)在多个时间点追踪从两名患者中分离的CTC：患者A(对免疫疗法具有耐受性)和患者B(免疫疗法的反应者)(每3个月取一个样本)，使用与(A)中所述的相同抗体组(panel)。固定细胞，并用针对CD133、PD-L1-K263-Ac(T53p)和ABCB5的一抗探测和DAPI进行免疫荧光显微镜检查。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PDL1的TNFI和ABCB5的TFI。
图10是图形和照片表示，其显示在CTC中PD-L1-263KAc的低水平表达与反应表型相关，而PD-L1-263KAc的高水平表达与无反应或耐受性CTC表型相关。(A)用PD-L1 K263-Ac和间充质/药物耐受性生物标志物CD133和ABCB5特异性的抗体组筛选从黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST 1.1定义的耐受性群或反应群。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对CD133、PD-L1-K263-Ac和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PD-L1-K263-Ac的TNFI和ABCB5的TFI(n＝每组5位患者)。根据PD-L1-Ac的表达，将源自液体活检的黑色素瘤CTC分为3个标识。标识3是低表达：在750以下，标识2是在1500以下的中等表达，标识1是在超过1500的高表达。(B)在源自液体活检的黑色素瘤CTC中发现的3个标识中的每一个所计数的总细胞群的百分比。然后将每个标识的群体百分比进一步分为耐受性、反应者和有前景的群体，如RECIST 1.1所确定的。
图11是照片和图形表示，其显示与反应者CTC样本相比，在无反应者或耐受性CTC样本中PD-L1 K263-Me减少。(A)用对PD-L1 K263-Me和间充质/药物耐受性生物标志物CD133和ABCB5特异性的抗体筛选黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST 1.1对免疫疗法的反应者或耐受性群。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对CD133、PD-L1 K263-Me和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PD-L1 K263-Me的TCFI和ABCB5的TFI(n＝每组5位患者)。(B)用对PD-L1 K263-Ac和间充质/药物耐受性生物标志物CD133和ABCB5特异性的抗体组筛选从晚期结直肠癌(CRC)或肺癌血液中分离的CTC。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，用针对CD133、PDL1-263k-me3和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PD-L1 K263-Ac的TCFI和ABCB5的TFI值(n＝每组5位患者)。
图12是照片和图形表示，其显示PD-L1-K236-Ac在药物耐受性转移性乳腺癌(MBC)细胞系和MBC患者样本中上调。(A)用对PD-L1 K263-Ac和间充质/药物耐受性生物标志物CD133和ABCB5特异性的抗体组筛选药物耐受性MBC细胞系。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对CD133、PD-L1 K263-Ac和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PD-L1 K263-Ac的TNFI和ABCB5的TFI(n＝20个细胞)。(B)固定从IV期MBC患者中分离的CTC，并进行免疫荧光显微镜检查，用针对CD133、PD-L1 K263-Ac(T53p)和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的CD133的TCFI值、PD-L1 K263-Ac的TNFI和ABCB5的TFI。
图13是照片和图形表示，其显示PD-L1-236KAc在化学耐受性细胞系和IV期MBC患者来源的CTC中均上调。(A)用对PD-L1 K263-Ac和间充质/药物耐受性生物标志物P300和ABCB5特异性的抗体组筛选黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST1.1的完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定的疾病(SD)或进行性疾病(PD)。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对P300、PDL1-263k-Ac和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的P300的TNFI值、PD-L1K263-Ac的TNFI和ABCB5的TFI(n＝每组5位患者)。确定了P300与PD-L1 K263-Ac的PCC。PCC表示至少20个独立细胞的两个荧光染料信号之间的关系强度±SE。
图14是照片和图形表示，其描绘了在药物耐受性MBC细胞系中P300与PD-L1-236KAc的强共定位以及两者的高表达。固定药物耐受性MBC细胞系并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对P300、PD-L1-236KAc和抗ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的P300的TNFI值、PD-L1-236KAc的TNFI和ABCB5的TFI(n＝每组5位患者)。确定了P300与PD-L1-236KAc的PCC。PCC表示至少20个独立细胞的两个荧光染料信号之间的关系强度±SE。
图15是照片和图形表示，其显示用P300抑制剂处理MDA-MB-231三阴性MBC细胞降低了PD-L1 K263-Ac并增加了PD-L1 K263-Me。用递增浓度的P300抑制剂处理MDA-MB-231三阴性细胞系，并用针对间充质、耐受性标识(由P300，PD-L1-K263-Ac和ABCB5组成)的抗体组进行筛选。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对P300、PD-L1-K263-Ac和ABCB5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示使用ImageJ减去背景测量的P300的TNFI值、PD-L1 K263-Ac的TNFI和ABCB5的TFI(n＝20个细胞)。确定了P300与PD-L1 K263-Ac的PCC。PCC表示至少20个独立细胞的两个荧光染料信号之间的关系强度±SE。
图16是潜在的PD-L1标识基因靶标的列表。已经在来自转移性黑色素瘤患者的样本中验证了来自上述标记有*的标识的关键蛋白。令人惊讶的是，几乎所有的基因靶标都参与转移、复发和药物耐受性。
图17是照片和图形表示，其显示PD-L1的过表达导致化学耐受性、干性和/或疾病进展性生物标志物NODAL和CCL5的上调。使用一组由CSV、NODAL或CSV和CCL5组成的间充质、耐受性标识筛选从黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST 1.1的对免疫疗法的反应者或耐受性(无反应者)群。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查，使用针对CSV、NODAL或CSV和CCL5的一抗以及DAPI进行探测。显示了每个数据组的代表性图像。图形表示CSV的TCFI值、CCL5的TCFI、和NODAL的TNFI、TCFI或细胞核/细胞质荧光比(Fn/c)，其使用以下公式：Fn/c＝(Fn-Fb)/(Fc-Fb)，其中Fn是细胞核荧光，Fc是细胞质荧光，Fb是背景荧光，使用ImageJ减去背景测得。
图18是图形表示，其显示提出的细胞核PD-L1的机制。在这种机制中，PD-L1-K263-Ac在细胞核中既具有抑制作用，又具有活化作用，其中PD-L1-K263-Ac与标志物(例如DMNTI和SETDB1)一起形成抑制复合物的一部分。除此之外，PD-L1-K263-Ac还与增强子/活化组蛋白PTM(例如H3k27ac)以及间充质转录因子(如SNAI1)和HAT蛋白(如P300，其也将PD-L1乙酰化)形成强的复合物。
图19是图形表示，其显示PD-L1-K263Ac、CD133和ABCB5的表达随疾病负担的增加而增加。(A)使用一组由CSV、PDL1-263k-Ac和ABCB5组成的间充质、耐受性标识筛选从黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST 1.1的完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定的疾病(SD)或进行性疾病(PD)。固定细胞，并用抗CD133、抗PDL1-263k-Ac和抗ABCB5的一抗与DAPI的标记样本。使用用于高通量IF显微镜的多路免疫荧光样本的ASI的mIF系统通用扫描和分析系统定量细胞数量和IF信号强度，对标记的CTC的总％群体变化进行定量。曲线图代表PDL1+CTC的总％变化，其中CD133和ABCB5标志物用于间充质、化学耐受性标识。图表示％群体(n＝每组40个患者样本)。(B)从与(A)相同的样本中计算强度表达，并且曲线图表示CD133的平均FI值、PDL1的平均NFI和ABCB5的平均FI(n＝每组40个患者样本)，使用用于高通量IF显微镜的多路免疫荧光样本的ASI的mIF系统通用扫描和分析系统进行测量，定量细胞数量和IF信号强度。
一些图形和文字包含颜色表示或实体。彩色插图可根据请求从申请人或从适当的专利局获得。如果从专利局获得费用，则可能要收费。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语在下文中定义。
冠词“一种”(“a”和“an”)在本文中用来指代一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“一种元件”是指一个元件或多于一个的元件。
如本文中所用的术语“约”是指该技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”某值或某参数的提及包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
术语“同时施用”或“同时施用”或“共同施用”等是指包含两种或更多种活性物质的单一组合物的施用，或者每种活性物质在使得有效结果等同于当所有这些活性物质作为单一组合物施用所获得效果的足够短的时间段内，同期或同时或相继地作为分开的组合物和/或通过分开的途径递送来施用。“同时”是指活性剂基本上同时地、并且期望地是以同一制剂施用。“同期”是指活性剂在时间上密集施用，例如，一种活性剂在另一种之前或之后的大约一分钟内至大约一天内施用。任何同期时间是可用的。然而，通常的情况是，在非同时施用时，试剂将在大约一分钟内至大约八小时内并且适宜地是在少于大约一小时至大约四小时内施用。当同期施用时，试剂适宜地是在受试者上的同一部位处施用。术语“同一部位”包括确切位置，但可以在约0.5至约15厘米之内，优选在约0.5至约5厘米之内。如本文中所用的术语“分开地”是指以一定间隔例如以大约一天至数周或数月的间隔来施用试剂。可以以任意顺序施用活性剂。如本文中所用的术语“相继地”是指例如以数分钟、数小时、数天或数周的一个或多个间隔顺序地施用活性剂。如果合适，可以以定期的重复周期施用活性剂。
术语“试剂”是指任何诊断、治疗或预防试剂。术语“试剂”并非要被狭义解读，而是延伸到小分子、蛋白类分子(例如肽、多肽和蛋白)以及遗传分子(例如RNA、DNA及其模拟物和化学类似物)以及细胞试剂。术语“试剂”包括能够产生和分泌本文所指的多肽的细胞，以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“试剂”还延伸至核酸构建体(包括载体例如病毒或非病毒载体、用于在多种细胞中表达和分泌的表达载体和质粒)。
如本文中所用的“扩增”总体是指产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”是指至少两拷贝。“拷贝”并不一定意味着与模板序列具有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，例如脱氧肌苷、有意的序列改变(例如通过包含与模板可杂交但不互补的序列的引物而引入的序列改变)、和/或在扩增过程中发生的序列错误。
生物标志物的“量”或“水平”是样本中可检测的水平或量。可以通过本领域技术人员已知的方法和在本文中公开的方法来测量这些量和水平。这些术语包括定量的量或水平(例如，重量或摩尔)、半定量的量或水平、相对的量或水平(例如，类别内的重量％或摩尔％)、浓度等。因此，这些术语涵盖样本中生物标志物的绝对或相对的量或水平或浓度。所评估的生物标志物的表达水平或量可用于确定对治疗的反应。
如本文中所使用的“和/或”是指并且涵盖相关所列项目中一者或多者的任何和所有可能的组合，当以替代方式(或)中解读时则不包含组合。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指预防、阻断、抑制、中和或降低另一种分子(例如受体)的生物学活性或作用的物质。
术语“拮抗剂抗体”是指与靶标结合并预防或降低该靶标的生物学作用的抗体。在一些实施方案中，该术语可以表示预防其所结合的靶标(例如PD-1，CTLA4等)执行生物学功能的抗体。
如本文所用，“抗免疫检查点分子拮抗剂抗体”是指能够抑制由免疫检查点分子介导的生物学活性和/或下游事件的抗体。抗免疫检查点分子拮抗剂抗体包括(以任何程度，包括显著地)阻断、拮抗、抑制或降低免疫检查点分子生物学活性的抗体，所述分子生物学活性包括通过免疫检查点分子的抑制性信号转导和由免疫检查点分子介导的下游事件，例如免疫检查点分子结合配偶体与免疫检查点分子的结合和下游信号传导、抑制细胞增殖，包括肿瘤增殖、抑制T细胞增殖、抑制T细胞活化、抑制细胞因子分泌和抑制抗肿瘤免疫反应。为了本发明的目的，将明确地理解术语“抗免疫检查点分子拮抗剂抗体”(可互换地称为“拮抗剂免疫检查点分子抗体”、“拮抗剂抗免疫检查点分子抗体”或“免疫检查点分子拮抗剂抗体”)涵盖了所有先前确定的术语、标题、功能状态和特征，从而使免疫检查点分子本身、免疫检查点分子的生物学活性或生物学活性的后果基本无效、减少或以任何有意义的程度消除。
本文中术语“抗体”以最广义使用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和单可变结构域抗体，只要它们呈现所需的生物学活性即可。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，以及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(可以缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(可以缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可以根据两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。术语“抗体”的范围内包括任何种类的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定种类。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
可以通过在非抗体蛋白支架上排列一个或多个CDR来提供“抗原结合片段”。如本文所用，“蛋白支架”包括但不限于免疫球蛋白(Ig)支架，例如IgG支架，其可以是四链或两链抗体，或者可以仅包含抗体的Fc区，或它们可以包含来自抗体的一个或多个恒定区，该恒定区可以是人或灵长类动物来源的，或者可以是人和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。蛋白支架可以是Ig支架，例如IgG或IgA支架。IgG支架可包含抗体的一些或全部结构域(即，CH1、CH2、CH3、VH、VL)。抗原结合蛋白可包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG支架。例如，支架可以是IgG1。支架可以由抗体的Fc区或其一部分组成，或包含抗体的Fc区或其一部分。抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基或受限制的FR3-CDR3-FR4肽组成的最小识别单元。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR接枝的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包括在本文所用的表述“抗原结合片段”内。抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个CDR，其与一个或多个框架序列相邻或与其在框内。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以相对于彼此以任何合适的排列定位。例如，可变区可以是二聚体并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2，(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上面列出的任何示例性构型，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过全部或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，其非共价彼此结合和/或具有一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过一个或多个二硫键)。与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，任何多特异性抗原结合分子形式，包括本文公开的示例性双特异性抗原结合分子形式，都可以适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况。
如本文中使用，术语“抗原”及其语法上等同的表述(例如“抗原的”)是指可以由特异性体液免疫或细胞免疫的产物(如抗体分子或T细胞受体)所特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，例如包括半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如，寡糖)、脂质和激素以及大分子如复杂碳水化合物(例如，多糖)、磷脂和蛋白。常见类别的抗原包括但不限于病毒性抗原、细菌性抗原、真菌性抗原、原虫和其他寄生虫性抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫疾病、过敏和移植排异的抗原、毒素和其他杂项抗原。
“抗原结合分子”是指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语扩展到表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白框架。在本发明的实践中有用的代表性抗原结合分子包括抗体和抗原结合片段。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指一类细胞，其能够以肽-MHC复合物的形式呈递一种或多种抗原，可以被免疫系统的特定效应细胞(在本文中也称为“免疫效应细胞”)识别，从而调节(例如，刺激/增强或减少/耐受/使无反应)对被呈递的一种或多种抗原的免疫反应。在本发明的特定实施方案中，APC能够活化免疫效应细胞，例如T淋巴细胞，包括例如CD8+和/或CD4+淋巴细胞。在体内具有作为APC发挥作用的潜力的细胞不仅包括专门的APC(例如树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞、单核细胞和B细胞)，而且还包括非专门的APC，其说明性示例包括活化的上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、胰岛β细胞和血管内皮细胞以及癌细胞。许多类型的细胞能够在其细胞表面呈递抗原，用于免疫效应细胞(包括T细胞)的识别。
如本文所用，术语“抗原特异性”是指细胞群的性质，使得特定抗原或抗原片段的提供导致特异性细胞增殖，合适地例如，合适地针对受损细胞、恶性肿瘤或感染的以T细胞(例如，CTL和/或辅助T细胞)活化为特征的T细胞增殖。
如本文中使用，术语“结合”、“特异性结合”或“对……特异性的”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其确定在异质分子(包括生物学分子)群体存在下靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标(其可以是表位)的抗体是以它结合其他靶标更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合此靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体结合无关靶标的程度小于抗体对靶标的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白上在来自不同物种的蛋白间保守的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不必须是排他性结合。
本文所用的术语“生物标志物”是指可以在样本中检测到的指示物，例如预测、诊断和/或预后性的指示物。生物标志物可以用作特征在于某些分子、病理、组织学和/或临床特征的疾病或病症(例如，癌症)的特定亚型的指示物、和/或可以用作特定细胞类型或状态(例如上皮、间充质等)的指示物、和/或对疗法的反应。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。生物标志物可以存在于从生理或病理生理状态(例如，原发癌、转移性癌症等)发作之前的受试者获得的样本中，所述生理或病理生理状态包括其症状(例如，对疗法的反应)。因此，从受试者获得的样本中生物标志物的存在可以指示受试者将发生生理或病理生理状态或其症状的风险增加。替代地，或此外，生物标志物可以在个体中正常表达，但是在生理或病理生理状态(包括其症状)发作之前，其表达可以改变(即，其表达增加(上调；过表达)或降低(下调；表达不足)。因此，生物标志物水平的改变可以指示受试者将发生生理或病理生理状态或其症状的风险增加。替代地，或此外，生物标志物水平的变化可以反映受试者中特定生理或病理生理状态或其症状的变化，从而允许在一段时间内追踪生理或病理生理状态或其症状的性质(例如，严重性)。例如，该方法可用于监测治疗方案，以评估其在受试者中的有效性(或其他效果)。如本文所述，提及生物标志物的水平包括生物标志物的浓度、或生物标志物的表达水平、或生物标志物的活性。
术语“生物标志物标识”、“标识”、“生物标志物表达标识”或“表达标识”在本文中可互换地使用并且是指其表达作为例如预防、诊断和/或预后性的指示物的一种生物标志物或生物标志物组合。生物标志物标识可作为特征在于某些分子、病理、组织和/或临床特征的特定疾病或病症亚型(例如，原发癌、转移性癌症等)或其症状(例如，对疗法的反应、药物耐受性、和/或疾病负担)的指示物。在一些实施方案中，生物标志物标识是“基因标识”。术语“基因标识”与“基因表达标识”可互换地使用并且是指其表达作为例如预防性、诊断性和/或预后性的指示物的一种多核苷酸或多核苷酸组合。在一些实施方案中，生物标志物标识是“蛋白标识”。术语“蛋白标识”与“蛋白表达标识”可互换地使用并且是指其表达作为例如预防性、诊断性和/或预后性的指示物的一种多肽或多肽组合。生物标志物标识可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个或更多个生物标志物。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述受试者中通常特征在于细胞生长失控、有可能局部侵袭和/或扩散到身体的其他部位(转移)的生理状态。术语“癌症”在本文中通常可与“肿瘤”互换使用(除非肿瘤被具体称为“良性”肿瘤，这是一种缺乏侵袭邻近组织或转移能力的异常的细胞团)，并且涵盖恶性实体瘤(例如癌、肉瘤)和其中可能没有可检测到的实体瘤块的恶性生长(例如某些血液系统恶性肿瘤)。癌症的非限制性示例包括但不限于，癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。这些癌症的更具体示例包括但不限于，鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌和胃肠道间充质癌的胃部或胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，泌尿道癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏癌或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑色素瘤，浅表扩散性黑色素瘤，雀斑恶性黑色素瘤，肢端雀斑样黑色素瘤，结节性黑色素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低分级的/滤泡性的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL、中间分级/滤泡性的NHL；中间分级的弥漫性NHL；高分级的免疫母细胞性NHL；高分级的成淋巴细胞NHL；高分级的小无裂细胞NHL；大包块病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血病)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如脑肿瘤相关的)，梅格斯综合征，脑、以及头颈癌，以及相关的转移。在某些实施方案中，适合通过本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌。而在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移形式。在具体的实施方案中，癌症是黑色素瘤或肺癌，适宜地是转移性黑色素瘤或转移性肺癌。
术语“细胞区室”包括细胞的一部分，包括细胞器(例如线粒体、高尔基体、内质网、核糖体等)、细胞核、细胞质(任选地包括细胞器)、细胞核膜、细胞膜和其他细胞区域。
术语“化学疗法”是指用一种或多种化学治疗剂对人或动物进行的疗法，该化学治疗剂抑制或消除细胞生长和细胞分裂，即该疗法被视为细胞增殖抑制剂或用于诱导细胞死亡(细胞凋亡)。与正常细胞相比，癌细胞不受控制地生长和分裂，因此化学疗法对癌细胞应更有效。
术语“化学治疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化合物。化学治疗剂的示例包括厄洛替尼(erlotinib)(
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Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(
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Millennium Pharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐孢子酰胺A(salinosporamide A)、卡非佐米(carfilzomib)、17-AAG(格尔德霉素)、根赤壳菌素(radicicol)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(
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AstraZeneca)、sunitib(
Figure BDA0002680645610000244
Pfizer/Sugen)、来曲唑(
Figure BDA0002680645610000245
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
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Novartis)、芬那酯(finasunate)(
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Novartis)、奥沙利铂(
Figure BDA0002680645610000248
Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、雷帕霉素(Sirolimus，
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Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA00026806456100002410
GSK572016，Glaxo SmithKline)、洛纳米布(Lonafamib)(SCH66336)、索拉非尼(
Figure BDA00026806456100002411
Bayer Labs)、吉非替尼(
Figure BDA00026806456100002412
AstraZeneca)、AG1478、烷化剂如噻替哌和
Figure BDA00026806456100002413
环磷酰胺；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷如苯并二氮(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)和乌多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲三聚氰胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；产乙酸素(acetogenins)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括托泊替康和伊立替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质甾类(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶，包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、丙戊酸、莫西司他多拉司丁(mocetinostat dolastatin)；阿地白介素(aldesleukin)、滑石多米卡新(talcduocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、氯苯哌嗪(chlomaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧化二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(AngewChem.Intl.Ed.Engl.1994 33：183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波毒素(esperamicin)；以及新抑癌素(neocarzinostatin)生色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、丁香霉素(carabicin)、卡米霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、嗜铬菌素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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(多柔比星)、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和去氧多柔比星)，表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；比桑丁(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲酯(edatraxate)；去氧胺(defofamine)；地美可辛；亚丝醌(diaziquone)；依托咪嗪(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱如美登素和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫匹丹醇(mopidamnol)；硝胺(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素；西呋喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙基胺；单端孢霉烯毒素(trichothecenes)(特别是T-2毒素，维拉库林A(verracurin A)，漆斑菌素A和蛇形毒素(anguidine))；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如，TAXOL(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，
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(无克列莫佛(Cremophor-free))，紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Ill.)，和
Figure BDA0002680645610000263
(多西紫杉醇(docetaxel)，多西他赛(doxetaxel)；Sanofi-Aventis)；瘤可宁(chloranmbucil)；
Figure BDA0002680645610000264
(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；
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(长春瑞滨)；盐酸米托恩醌(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨
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伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类如维甲酸；和任何上述的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
化学治疗剂还包括(i)作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
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他莫昔芬柠檬酸盐)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、碘氧芬(iodoxyfene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
Figure BDA0002680645610000268
(托瑞米芬柠檬酸盐(toremifinecitrate))；(ii)抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure BDA0002680645610000269
(醋酸甲地孕酮)、
Figure BDA00026806456100002610
(依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA00026806456100002611
(伏罗唑)、
Figure BDA00026806456100002612
(来曲唑；Novartis)和
Figure BDA00026806456100002613
(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素类，例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(tripterelin)、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、普雷马林(premarin)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式视黄酸、芬维A胺(fenretinide)、以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，例如例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0002680645610000271
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，例如基因疗法疫苗，例如
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和
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rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂如
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Figure BDA0002680645610000276
rmRH；和(ix)任何上述的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
化学治疗剂还包括抗体如阿仑单抗(Campath)，贝伐单抗(
Figure BDA0002680645610000277
Genentech)；西妥昔单抗(
Figure BDA0002680645610000278
Imclone)；帕尼单抗(
Figure BDA0002680645610000279
Amgen)，利妥昔单抗(
Figure BDA00026806456100002710
Genentech/Biogen Idec)，帕妥珠单抗(
Figure BDA00026806456100002711
2C4，Genentech)，曲妥珠单抗(
Figure BDA00026806456100002712
Genentech)，托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin，
Figure BDA00026806456100002713
Wyeth)。作为与本发明化合物组合的试剂的具有治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括：、阿波珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托西珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)、西地珠单抗(cedelizumab)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西德古他珠单抗(cidfusituzumab)、西妥珠单抗(cidtuzumab)、达克珠单抗(daclizumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕妥珠单抗(epratuzumab)、埃利珠单抗(erlizumab)、费珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、伊珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫妥珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺洛珠单抗(nolovizumab)、努马珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、培非他珠单抗(pecfusituzumab)、帕妥珠单抗(pectuzumab)、培派珠单抗(pexelizumab)、雷利珠单抗(ralivizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞丝利维珠单抗(reslivizumab)、瑞丝利珠单抗(reslizumab)、瑞昔维珠单抗(resyvizumab)、罗维利珠单抗(rovelizumab)、鲁普利珠单抗(ruplizumab)、西罗妥珠单抗(sibrotuzumab)、西普利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、四曲妥他克珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非巴珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、曲妥珠单抗西莫白介素(tucotuzumabcelmoleukin)、图克斯妥珠单抗(tucusituzumab)、乌马珠单抗(umavizumab)、乌头克珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)和抗白介素12(ABT-874/J695，Wyeth Research和Abbott Laboratories)，其是一种重组完全人序列的全长IgG1λ抗体，经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白。
化学治疗剂还包括“EGFR抑制剂”，其是指结合EGFR或以其他方式直接与EGFR相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，其另外还称作“EGFR拮抗剂”。此类试剂的示例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的示例包括MAb 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533、Mendelsohn等人)及其变体，例如嵌合化的225(C225或西妥昔单抗；
Figure BDA0002680645610000281
)和重构的人225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体如美国专利No.5,891,996中所记载；和结合EGFR的人抗体，例如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等人Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争对EGFR的结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称作E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3且在美国专利No.6,235,883中记载的全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；以及mAb 806或人源化mAb806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与细胞毒性剂缀合，由此产生免疫缀合物(参见例如EP659439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，例如在美国专利No.5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008、和5,747,498以及以下PCT公开文本：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016、和WO99/24037中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，
Figure BDA0002680645610000282
Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸化物，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼
Figure BDA0002680645610000283
4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4--d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)-；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(-二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂例如拉帕替尼(
Figure BDA0002680645610000284
GSK572016或N-[3-氯-4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2--呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化学治疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，例如可从Takeda获得的TAK165；CP-724，714，一种口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR过表达细胞的双重HER抑制剂，例如EKB-569(可从Wyeth获得)；拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016；可从Glaxo-SmithKline获得)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis获得)；泛HER抑制剂，例如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，例如可从ISIS Pharmaceuticals获得的抑制Raf-1信号传导的反义试剂ISIS-5132；非HER靶向的TK抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0002680645610000291
可得自Glaxo SmithKline)；多靶向的酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼(sunitinib)(
Figure BDA0002680645610000292
可从Pfizer获得)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，例如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584，可从Novartis/Schering AG获得)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉，例如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，例如CGP59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)-酞酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如与编码HER的核酸结合的那些)；喹喔啉(美国专利No.5,804,396)；tryphostins(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，例如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼
Figure BDA0002680645610000293
PKI 166(Novartis)；GW2016(GlaxoSmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；塞马替尼(Semaxinib)(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)，雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA0002680645610000294
)；或任何下列专利公开文本中描述的：美国专利No.5,804,396；WO1999/09016(American Cyanamid)；WO 1998/43960(American Cyanamid)；WO 1997/38983(Warner Lambert)；WO 1999/06378(Warner Lambert)；WO 1999/06396(Warner Lambert)；WO 1996/30347(Pfizer，Inc)；WO 1996/33978(Zeneca)；WO 1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980(Zeneca)。
化学治疗剂还包括地塞米松(dexamethasone)、干扰素、秋水仙碱(colchicine)、氯苯氨啶(metoprine)、环孢霉素(cyclosporine)、两性霉素(amphotericin)、甲硝唑(metronidazole)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利维A酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、氨磷汀(amifostine)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、活的BCG、贝伐珠单抗(bevacuzimab)、贝沙罗汀(bexarotene)、克拉屈滨(cladribine)、里本灵(clofarabine)、达泊汀阿尔法(darbepoetin alfa)、地尼白介素(denileukin)、右雷佐生(dexrazoxane)、阿法依伯汀(epoetin alfa)、厄洛替尼、非格司亭(filgrastim)、醋酸组氨瑞林(histrelin acetate)、替伊莫单抗(ibritumomab)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺(lenalidomide)、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、甲氧沙林(methoxsalen)、诺龙(nandrolone)、奈拉滨(nelarabine)、诺非单抗(nofetumomab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、帕利夫明(palifermin)、帕米膦酸二钠(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、喹纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、沙格司亭(sargramostim)、替莫唑胺(temozolomide)、VM-26、6-TG、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、ATRA、戊柔比星(valrubicin)、唑来膦酸盐(zoledronate)、和唑来膦酸(zoledronic acid)，及其药学上可接受的盐。
化学治疗剂还包括氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、醋酸可的松(cortisone acetate)、特戊酸替可的松(tixocortol pivalate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地奈德(desonide)、氟轻松(fluocinonide)、氟西奈德(fluocinoloneacetonide)、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠、氟可龙(fluocortolone)、氢化可的松-17-丁酸酯(hydrocortisone-17-butyrate)、氢化可的松-17-戊酸酯(hydrocortisone-17-valerate)、二丙酸阿氯米松(aclometasone dipropionate)、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松-17-丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、氯倍他松-17-丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、己酸氟可龙(fluocortolone caproate)、特戊酸氟可龙(fluocortolone pivalate)和醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，例如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体(feG)(IMULAN BioTherapeutics，LLC)；抗风湿药物，例如硫唑嘌呤(azathioprine)、环孢素(环孢霉素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米特米诺环素(leflunomideminocycline)、柳氮磺吡啶、肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂例如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、塞妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、白细胞介素1(IL-1)阻断剂例如阿那白滞素(Kineret)、T细胞共刺激阻断剂例如阿巴西普(Orencia)、白介素6(IL-6)阻断剂例如托珠单抗
Figure BDA0002680645610000301
白介素13(IL-13)阻断剂，例如雷贝珠单抗(lebrikizumab)；干扰素α(IFN)阻断剂，例如罗他珠单抗(Rontalizumab)；β7整合素阻断剂，例如rhuMAb Beta7；IgE通路阻断剂，例如抗-Mi prime；分泌的同源三聚体LTa3和膜结合异源三聚体LTa1/β2阻断剂，例如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；各种研究性试剂，例如硫铂(thioplatin)；PS-341、丁酸苯酯、ET-18-OCH3或法呢基转移酶抑制剂L-739749、L-744832)；多酚类，例如槲皮苷、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechine gallate)、茶黄素、黄烷醇类、原花青素类、桦木酸及其衍生物；自噬抑制剂，例如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(dronabinol，
Figure BDA0002680645610000311
)；β-拉帕醇(beta-lapachone)；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；乙酰喜树碱、司克来亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱；鬼臼毒素；替加氟
Figure BDA0002680645610000312
蓓萨罗丁
Figure BDA0002680645610000313
二膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如
Figure BDA0002680645610000314
或
Figure BDA0002680645610000315
)、依替膦酸盐
Figure BDA0002680645610000316
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐
Figure BDA0002680645610000317
阿仑膦酸盐
Figure BDA0002680645610000318
帕米膦酸盐
Figure BDA0002680645610000319
替鲁膦酸盐
Figure BDA00026806456100003110
或利塞膦酸盐
Figure BDA00026806456100003111
和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如
Figure BDA00026806456100003112
疫苗；哌立福新、COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托昔布)、蛋白酶体抑制剂(例如PS341)；CCI-779；替吡法尼(R11577)；奥拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠(oblimersen sodium)
Figure BDA00026806456100003113
匹克生琼(pixantrone)；法呢基转移酶抑制剂，例如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636，SARASARTM)；和任何上述者的药学可接受的盐、酸或衍生物；及上述两种或更多种的组合，例如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写)；和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸组合治疗方案的缩写)。
化学治疗剂还包括具有镇痛、解热和抗炎作用的非甾体类抗炎药。NSAID包括环氧合酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体示例包括阿司匹林；丙酸衍生物，例如布洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和萘普生；乙酸衍生物，例如吲哚美辛、舒林酸(sulindac)、依托度酸、双氯芬酸；烯醇酸衍生物，例如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康、氯诺昔康和伊索昔康；芬那酸衍生物，例如甲芬那酸(mefenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、氟芬那酸(flufenamic acid)、托芬那酸(tolfenamic acid)；和COX-2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、依托昔布(etoricoxib)、鲁米昔布(lumiracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)和伐地昔布(valdecoxib)。NSAID可用于病况的症状缓解，所述病况为例如类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、赖特综合征(Reiter's syndrome)、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、由于炎症和组织损伤而引起的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛。
术语“临床结果”或“临床终点”是指与患者对疗法的反应有关的任何临床观察或测量结果。临床结果的非限制性示例包括肿瘤反应(TR)、总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)、到肿瘤复发的时间(TTR)、到肿瘤进展的时间(TTP)、相对风险(RR)、毒性或副作用。“总生存期”(OS)旨在与未处理(naive)或未治疗的个体或患者相比，预期寿命延长。“无进展生存期”(PFS)或“到肿瘤进展的时间”(TTP)表示治疗期间和治疗后癌症不生长的时间长度。无进展生存期包括患者经历完全反应或部分反应的时间量、以及患者经历稳定的疾病的时间量。如本文所用并且如美国国家癌症研究所定义的“肿瘤复发”是已经复发(再发)的癌症，通常发生在检测不到癌症的一段时间之后。癌症可以在与原始(原发)肿瘤相同的位置再发，或者在身体的另一位置再发。也称为复发性癌症。“到肿瘤复发的时间”(TTR)定义为从癌症诊断之日到首次复发、死亡之日的时间、或者当患者在最后一次接触时没有任何肿瘤复发，则直到最后一次接触的时间。如果患者未复发，则在死亡或最后一次随访时删截TTR。在统计和数学流行病学中，“相对风险”(RR)指的是事件(或发展为疾病)相对于暴露的风险。相对风险是暴露组与未暴露组之间发生事件的概率之比。
如本文中所用的，术语“复合物”是指彼此直接和/或间接接触的分子(例如，肽、多肽等)的集合或聚集物。在具体的实施方案中，“接触”或更具体地讲“直接接触”是指两个或更多个分子足够接近，使得有吸引力的非共价相互作用，例如范德华力、氢键、离子和疏水相互作用等主导分子的相互作用。在这样的实施方案中，分子的复合物(例如肽和多肽)在使得该复合物热力学上有利的条件下形成(例如，与其组分分子的非聚集或非复合状态相比)。如本文中所用的术语“多肽复合物”或“蛋白复合物”是指三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体或更高阶的低聚物。在具体的实施方案中，通过PD-L1与赖氨酸乙酰基转移酶P300和甲基转移酶DNMT1和SETDB1中的一种或多种结合，形成多肽复合物。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为意指包括所述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。因此，使用术语“包括”等表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且可以存在或可以不存在。“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且不能存在其他要素。“基本上由……组成”是指包括在短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列出的要素的活性或作用，可以存在或可以不存在。
如本文所使用的，术语“相关”或“与...相关”以及类似术语是指两个或更多个事物之间的统计相关性，如事件、特征、结果、数量、数据组等，其可以被称为作为“变量”。将理解，事物可以是不同类型的。通常，变量用数量表示(例如，测量结果、值、可能性、风险)，其中正相关表示一个变量增加时，另一个变量也增加，而负相关(也称为反向相关)意味着一个变量增加时，另一个变量减少。
“对应于”或“对应”是指表现出与参照氨基酸序列有实质性的序列相似性或同一性的氨基酸序列。一般氨基酸序列将表现出与参照氨基酸序列的至少一部分有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至多达100％的序列相似性或同一性。
如本文中所用的术语“细胞毒性剂”是指对细胞有害(例如，导致细胞死亡、抑制增殖或以其他方式阻碍细胞功能)的任何试剂。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂；生长抑制剂；酶及其片段例如溶核酶；和毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。示例性细胞毒性剂可选自抗微管剂、铂配位络合物、烷化剂、抗生素剂、拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导通路抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡剂、LDH-A抑制剂、脂肪酸生物合成抑制剂、细胞周期信号传导抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂和癌症代谢抑制剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂是紫杉烷。在此类型的代表性实施方案中，紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。在一些实施方案中，细胞毒性剂是铂剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是EGFR的拮抗剂。在此类型的代表性实施方案中，EGFR的拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如厄洛替尼)。在一些实施方案中，细胞毒性剂是RAF抑制剂。在此类型的非限制性示例中，RAF抑制剂是BRAF和/或CRAF抑制剂。在其他非限制性示例中，RAF抑制剂是维莫非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是PI3K抑制剂。
如本文中所用的，术语“细胞毒性疗法”是指引起细胞损伤的疗法，包括但不限于放射、化学疗法、光动力疗法、射频消融、抗血管生成疗法及其组合。当应用于细胞时，细胞毒性疗法可能引起DNA损伤。
如本文中所用的，“延缓疾病的进展”或“降低疾病进展速率”意指延迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定化、和/或推迟疾病的发展(例如癌症)。根据疾病史和/或待治疗的个体，这种延缓可以具有不同的时间长度。如对于本领域技术人员显而易见的，足够或显著的延缓事实上可涵盖预防，即个体不发展出该疾病。例如，可以延缓晚期癌症例如转移的发生。
术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
如本文所用，术语“药物”是指在体内具有生物学或可检测活性的任何物质。术语药物意指涵盖细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂(debulking agent)、化学治疗剂、放射治疗剂、靶向抗癌剂、生物反应修饰剂、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。
术语“药物耐受性”是指疾病对一种或多种药物的治疗没有反应的情况。药物耐受性可以是固有的(或原发耐受性)，这意味着疾病从未对所述一种或多种药物反应，或者药物耐受性可以是获得性的，这意味着先前对一种或多种药物反应的疾病不再对该药物反应(继发耐受性)。在某些实施方案中，药物耐受性是固有的。在某些实施方案中，药物耐受性是获得性的。
“有效量”是对于特定病症实现可测量的改善或预防所需的至少最小量。本文的有效量可以根据例如患者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及抗体在个体中引发期望反应的能力而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性使用，有益或期望的结果包括以下结果：例如消除或降低风险、减轻严重性或延缓疾病发作，包括疾病的生化、组织和/或行为症状、其并发症和在疾病的发展过程中呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或期望的结果包括以下临床结果：例如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有疾病的那些人的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，例如通过靶向增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可以具有以下效果：减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减缓或理想地终止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在某种程度上减缓并且理想地终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与癌症或肿瘤相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，有效量的药物、化合物或药物组合物可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他试剂联合可以实现或实现了期望的结果，则可以视为单一试剂以有效量施用。可以通过评估癌症治疗中常用的各种终点来测量治疗的有效量，包括但不限于：延长生存期(包括总生存期(OS)和无进展生存期(PFS))；产生客观反应(包括完全反应(CR)或部分反应(PR))；肿瘤消退、肿瘤重量或大小缩小、到疾病进展的时间更长、存活持续时间延长、PFS更长、OS率改善、反应持续时间延长，生活质量提高和/或癌症体征或症状改善。如本文所用，术语“进行性疾病”(PD)指靶标病变直径的总和增加至少20％，以研究中的最小总和为参考(如果基线总和在研究中最小，则包括基线总和)。除了相对增加20％外，总和还必须显示至少5mm的绝对增加。一个或多个新病变的出现也被视为进展。如本文所用，术语“部分反应”(PR)是指以基线直径总和作为参考，靶标病变的直径总和至少降低30％。如本文所用，术语“完全反应”(CR)指所有非淋巴结靶标病变的消失，其中任何靶标淋巴结的短轴均减小至<10mm。如本文所用，术语“稳定的疾病”(SD)是指以研究中的最小直径总和作为参考，既没有符合PR的足够缩小，也没有符合PD的足够增加。
术语“上皮”、“上皮表型”等等在本领域中是知晓的，并且可以通过形态、分子和/或功能特征来鉴定。例如，上皮细胞通常具有圆形或鹅卵石外观，表达上皮标志物E-钙粘蛋白，快速分裂和/或与间充质细胞相比具有较低水平的运动性、侵袭性和/或非锚定依赖性生长。
如本文中使用的术语“上皮向间充质转换”(EMT)表示从上皮向间充质表型的转换，这是胚胎发育的正常过程。EMT还是这样的过程：其中受损伤的发挥离子和流体运载体的上皮细胞成为基质重构间充质细胞。在癌中，这种转变典型地导致细胞形态改变，间充质蛋白质表达以及侵袭性增加。定义体外EMT的标准涉及上皮细胞极性的损失、分离成单个细胞以及随后在获得细胞移动性后散播(参见Vincent-Salomon等人.，Breast CancerRes.2003；5(2)：101-106)。在EMT期间表达、分布和/或功能发生改变以及因果上所涉及的分子的类别包括生长因子(例如，转化生长因子-β(TGF-β)、wnt)，转录因子(例如Snail、SMAD、LEF和核β-连环蛋白)，细胞间粘接轴分子(钙粘蛋白、连环蛋白)，细胞骨架调节子(Rho家族)和细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶原活化物)(参见Thompson等人，Cancer Research 65，5991-5995，Jul.15，2005)。在具体的实施方案中，EMT是指上皮癌细胞呈现间充质表型的过程，其可与转移相关。这些间充质细胞可表现出降低的粘附性、增加的运动性和侵袭性，并且对免疫治疗剂、化疗剂和/或放射(例如靶向快速分裂的细胞的治疗)具有相对耐受性。
术语“表位”是指能够在一个或多个抗体的抗原结合部分由抗体识别并结合的分子部分。表位通常由分子的表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性或构象的。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构象表位”包含在对表位特异性的抗体所结合的抗原蛋白质内的非邻接多肽(或氨基酸)。一旦确定在抗原上的所需表位，就能够例如使用在本说明书中描述的技术生成针对该表位的抗体。或者，在开发过程期间，抗体的生成和表征可以阐明关于期望表位的信息。根据该信息，随后能够竞争筛选与相同表位结合的抗体。实现这点的方法是进行竞争和交叉竞争研究，以找到彼此竞争或交叉竞争结合靶抗原(例如PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me等)的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。
关于基因序列的术语“表达”是指基因转录以产生RNA转录物(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)，并且适当时，将所得mRNA转录物翻译成蛋白。因此，从上下文中可以清楚地看出，编码序列的表达源自编码序列的转录和翻译。相反，非编码序列的表达源自非编码序列的转录。
如本文所用，关于生物标志物或生物标志物复合物水平的术语“增加”或“增加的”是指与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，生物标志物或生物标志物复合物水平在统计学上显著地且可测量地增加。所述增加优选为增加至少约10％、或增加至少约20％、或增加至少约30％、或增加至少约40％、或增加至少约50％。
如本文所用，关于生物标志物或生物标志物复合物测量结果的术语“更高”是指与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，生物标志物或生物标志物复合物测量结果的水平在统计学上显著地且可测量地不同，其中生物标志物或生物标志物复合物测量结果大于其他生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平。该不同优选为至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％。
如本文所用，关于生物标志物或生物标志物复合物水平的术语“降低”或“降低的”是指与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，生物标志物或生物标志物复合物水平在统计学上显著地且可测量地降低。所述降低优选为降低至少约10％、或降低至少约20％、或降低至少约30％、或降低至少约40％、或降低至少约50％。
如本文所用，关于生物标志物或生物标志物复合物测量结果的术语“更低”是指与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，生物标志物或生物标志物复合物测量结果的水平在统计学上显著地且可测量地不同，其中生物标志物或生物标志物复合物测量结果小于其他生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平。该不同优选为至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，通常是指样本中生物标志物的量。“表达”通常是指将(例如基因编码的和/或表观遗传的)信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以是指转录成多核苷酸、翻译成多肽、或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽、或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工，例如通过蛋白水解。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)然后翻译成多肽的那些，还有转录成RNA但不翻译成多肽的那些(例如转运和核糖体RNA)。因此，“升高的表达”、“升高的表达水平”或“升高的水平”是指相对于对照(例如对疗法有反应或无反应的一个或多个细胞)、或对疗法有反应或无反应的一个或多个个体、或内部对照(例如，管家生物标志物)，细胞或个体中的生物标志物的表达增加或水平升高。“降低的表达”、“降低的表达水平”或“降低的水平”是指相对于对照(例如对疗法有反应或无反应的一个或多个细胞)、或对疗法有反应或无反应的一个或多个个体、或内部对照(例如，管家生物标志物)，个体中的生物标志物的表达降低或水平降低。在一些实施方案中，降低的表达是很少表达或没有表达。在特定的实施方案中，PD-L1-K263Ac的升高的水平是指这样的水平，其大部分与PD-L1的核定位相关，或与细胞核中的定位高于细胞质和/或细胞膜中的定位相关。在其他实施方案中，PD-L1-K263Me的升高的水平是指这样的水平，其大部分与PD-L1细胞质和/或细胞膜定位相关，或与细胞质和/或细胞膜中的定位高于细胞核中的定位相关。
术语“管家生物标志物”是指典型地在全部细胞类型中相似存在的一种生物标志物或一组生物标志物(例如，多核苷酸和/或多肽)。在一些实施方案中，管家生物标志物是“管家基因”。“管家基因”在本文中是指编码蛋白质的一种基因或一组基因，所述蛋白质的活性对于维持细胞功能为必需并且典型地在全部细胞类型中相似地存在。
“生长抑制剂”在本文中使用时是指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是防止或减少表达抗体所结合的抗原的细胞的增殖的生长抑制抗体。在另一实施方案中，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞的百分比的试剂。生长抑制剂的示例包括阻断细胞周期进行(处于S期以外的期)的试剂，例如诱导G1阻滞和M期阻滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷、和拓扑异构酶II抑制剂例如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的试剂也扩展到使S期阻滞，例如DNA烷化剂，例如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多信息可见于Mendelsohn和Israel,编著，The Molecular Basis of Cancer，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami等人(W.B.Saunders，Philadelphia，1995)，例如第13页。紫杉烷(紫杉醇和多西紫杉醇)都是来源于紫杉的抗癌药。多西紫杉醇(
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Rhone-Poulenc Rorer)源自欧洲紫杉，是紫杉醇(
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Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西紫杉醇促进微管蛋白二聚体的微管组装，并通过防止解聚作用稳定微管，从而抑制细胞的有丝分裂。
术语“免疫检查点分子”包括作为免疫检查点发挥作用的受体和配体。免疫检查点代表免疫逃逸机制，可防止免疫系统攻击自身。免疫检查点受体存在于T细胞上，并与在抗原呈递细胞(包括癌细胞)上表达的免疫检查点配体相互作用。T细胞识别MHC分子上呈递的抗原并被活化以产生免疫反应，而与上述并行发生的免疫检查点受体与配体之间的相互作用控制T细胞的活化。免疫检查点受体包括共刺激受体和抑制受体，并且通过这两种受体之间的平衡控制T细胞的活化和免疫反应。可被靶向用于阻断或抑制的示例性免疫检查点分子包括但不限于CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞中表达)、CD160(也称为BY55)和CGEN-15049。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或多种免疫检查点分子的任何试剂、分子、化合物、化学物质、蛋白质、多肽、大分子等。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂，或者可以包括与免疫检查点受体结合并阻断或抑制该免疫检查点受体的抗原结合分子，或者包括与免疫检查点受体配体结合并阻断或抑制该免疫检查点受体配体的抗体。示例性的免疫检查点抑制剂包括抗免疫检查点分子的拮抗剂抗体，例如但不限于杜鲁伐单抗(durvalumab)(抗PD-L1抗体；MEDI4736)、派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1单克隆抗体)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1抗体)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011；人源化抗PD-1单克隆抗体)、AMP224(重组B7-DC-Fc融合蛋白)、BMS-936559(抗PD-L1抗体)、阿妥珠单抗(atezolizumab)(MPLDL3280A；人Fc-优化的抗PD-L1单克隆抗体)、奥维单抗(avuelumab)(MSB0010718C；人抗PD-L1抗体)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4检查点抑制剂)、曲美单抗(tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)和抗OX40。
本发明上下中的术语“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。例如，这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子、杀伤微生物、分泌抗体、识别感染细胞或癌细胞以及任选地清除这样的细胞。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。
术语“免疫反应”是指宿主哺乳动物的免疫系统对特定物质(例如抗原或免疫原)的任何可检测的反应，例如先天性免疫反应(例如，Toll受体信号传导级联的活化)、细胞介导的免疫反应(例如由T细胞(如免疫系统的抗原特异性T细胞和非特异性细胞)介导的反应)和体液免疫反应(例如，由B细胞介导的反应，例如产生和分泌抗体至血浆、淋巴和/或组织液中)。
术语“免疫疗法”是指其中人或动物的免疫系统的一种或多种成分被有意地调节以直接或间接地实现某些治疗益处的任何疗法，所述治疗益处包括全身和/或局部作用、以及预防和/或治疗作用。免疫疗法可涉及通过任何途径(例如，口服、静脉内、经皮、通过注射、通过吸入等)向人或动物受试者单独或以任何组合施用一种或多种免疫治疗剂，系统性地、局部地或二者。免疫疗法可涉及激发、增加、减少、停止、预防、阻断或以其他方式调节细胞因子的产生，和/或活化或失活细胞因子或免疫细胞，和/或调节免疫细胞的水平，和/或向身体的特定位置或向特定类型的细胞或组织递送一种或多种治疗或诊断物质，和/或破坏特定细胞或组织。免疫疗法可用于实现局部作用、全身作用或两者组合。
本文所用的术语“免疫治疗剂”是指间接或直接恢复、增强、刺激或增加身体对癌细胞的免疫反应和/或减少其他抗癌疗法的副作用的任何试剂、化合物或生物制剂。因此，免疫疗法是直接或间接刺激或增强免疫系统对癌细胞的反应和/或减轻可能由其他抗癌剂引起的副作用的疗法。免疫疗法在本领域中也称为免疫疗法、生物疗法、生物反应调节剂疗法和生物疗法。本领域已知的常见免疫治疗剂的示例包括但不限于细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体和非细胞因子佐剂。备选地，免疫疗法治疗可以包括向受试者施用一定量的免疫细胞(T细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞等)。免疫治疗剂可以是非特异性的，即普遍地增强免疫系统，从而使人体在对抗癌细胞的生长和/或扩散方面变得更加有效，或者免疫治疗剂可以是特异性的，即针对癌细胞本身。免疫疗法方案可以结合使用非特异性和特异性免疫治疗剂。非特异性免疫治疗剂是刺激或间接改善免疫系统的物质。非特异性免疫治疗剂已作治疗癌症的主要疗法单独使用，而且，除用作主要疗法以外，非特异性免疫治疗剂可作为佐剂发挥作用，以增强其他疗法(例如癌症疫苗)的有效性。在后一情况下，非特定免疫治疗剂也可以发挥作用，以减少其他疗法的副作用，例如某些化学治疗剂诱导的骨髓抑制。非特异性免疫治疗剂可以作用于关键的免疫系统细胞并引起继发性反应，例如增加细胞因子和免疫球蛋白的产生。可选择地，这些试剂本身可以包含细胞因子。非特异性免疫治疗剂通常被分为细胞因子或非细胞因子佐剂。已经发现许多细胞因子在癌症治疗中的应用，其或者作为一般的非特异性免疫疗法设计用于增强免疫系统，或者作为佐剂与其他疗法共同提供。合适的细胞因子包括但不限于干扰素、白介素和集落刺激因子。本发明考虑的干扰素(IFN)包括常见类型的干扰素：IFN-alpha(IFN-α)、IFN-beta(IFN-β)和IFN-gamma(IFN-γ)。IFN可以直接作用于癌细胞，例如，通过减缓其生长、促进其发育为具有更正常行为的细胞和/或增加其抗原的产生，从而使癌细胞更易于被免疫系统识别和破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如通过减缓血管生成、增强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重组IFN-α可以作为Roferon(Roche Pharmaceuticals)和Intron A(Schering Corporation)商购获得。本发明考虑的白介素包括IL-2、IL-4、IL-11和IL-12。可商购获得的重组白介素的例子包括
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(IL-2；Chiron Corporation)和
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(IL-12；Wyeth Pharmaceuticals)。Zymogenetics，Inc.(Seattle，Wash.)目前正在测试一种IL-21的重组形式，其也被考虑用于本发明的组合中。本发明考虑的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭(filgrastim))、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭(sargramostim))和促红细胞生成素(依泊汀α，达贝泊汀(darbopoietin))。用一种或多种生长因子进行的治疗可以帮助刺激接受传统化学疗法的受试者中生成新的血细胞。因此，用CSF治疗可有助于减少与化学疗法相关的副作用，并可允许使用更高剂量的化学治疗剂。各种重组集落刺激因子可商购获得，例如，
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(G-CSF；Amgen)、Neulasta(pelfilgrastim；Amgen)、Leukine(GM-CSF；Berlex)、Procrit(促红细胞生成素；Ortho Biotech)、Epogen(促红细胞生成素；Amgen)、Aranesp(促红细胞生成素)。除了具有特异性或非特异性靶标外，免疫治疗剂还可以是主动的，即刺激人体自身的免疫反应，包括体液和细胞免疫反应，或者可以是被动的，即包含在体外产生的免疫系统组成，例如抗体、效应免疫细胞、抗原呈递细胞等。在特定的实施方案中，被动免疫疗法涉及使用对存在于癌细胞或免疫细胞表面上的特定抗原具有特异性的、或对特定细胞生长因子具有特异性的一种或多种单克隆抗体。单克隆抗体可以多种方式用于治疗癌症，例如，增强受试者对特定类型癌症的免疫反应、通过靶向特定细胞生长因子(例如参与血管生成的那些细胞生长因子)、或当与试剂(例如化学治疗剂、放射性颗粒或毒素)连接或缀合时，通过增强其他抗癌试剂向癌细胞的递送，来干扰癌细胞的生长。当前用作癌症免疫治疗剂的单克隆抗体包括但不限于阿仑单抗
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贝伐单抗
Figure BDA0002680645610000402
西妥昔单抗
Figure BDA0002680645610000403
帕尼单抗
Figure BDA0002680645610000404
帕妥珠单抗(
Figure BDA0002680645610000405
2C4)、曲妥珠单抗
Figure BDA0002680645610000406
托西莫单抗
Figure BDA0002680645610000407
阿昔单抗
Figure BDA0002680645610000408
阿达木单抗
Figure BDA0002680645610000409
阿波珠单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利西单抗
Figure BDA00026806456100004010
巴威单抗、贝利木单抗
Figure BDA00026806456100004011
briankinumab、康纳单抗
Figure BDA00026806456100004012
西地珠单抗(cedelizumab)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)
Figure BDA00026806456100004013
西德古他珠单抗(cidfusituzumab)、西妥珠单抗(cidtuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克雷珠单抗(crenezumab)、达克珠单抗(daclizumab)
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达洛珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗(denosumab)
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Figure BDA00026806456100004016
依库丽单抗(eculizumab)
Figure BDA00026806456100004017
依法利珠单抗(efalizumab)、依帕妥珠单抗(epratuzumab)、埃利珠单抗(erlizumab)、费珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、、戈利木单抗(golimumab)
Figure BDA00026806456100004018
伊匹单抗(ipilimumab)、伊格单抗(imgatuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA00026806456100004019
拉贝珠单抗(labetuzumab)、左旋单抗(lebrikizumab)、lexatumumab、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡单抗(lucatumumab)、鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马他妥单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、莫加单抗(mogamulizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫妥珠单抗(motovizumab)、莫罗莫那(muronomab)、那他珠单抗(natalizumab)
Figure BDA00026806456100004020
尼珠单抗(necitumumab)
Figure BDA00026806456100004021
尼妥珠单抗(nimotuzumab)
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诺洛珠单抗(nolovizumab)、努马珠单抗(numavizumab)、奥洛珠单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)
Figure BDA00026806456100004023
恩妥珠单抗(onartuzumab)(也称为MetMAb)、帕利珠单抗(palivizumab)
Figure BDA00026806456100004024
帕考珠单抗(pascolizumab)、培非他珠单抗(pecfusituzumab)、帕妥珠单抗(pectuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)
Figure BDA00026806456100004025
派珠单抗(pexelizumab)、普利昔单抗(priliximab)、雷利珠单抗(ralvizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)
Figure BDA0002680645610000415
瑞丝利维珠单抗(reslivizumab)、瑞丝利珠单抗(reslizumab)、瑞昔维珠单抗(resyvizumab)、罗巴单抗(robatumumab)、罗那珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普利珠单抗(ruplizmnab)、sarilumab、苏金单抗(secukinumab)、塞立单抗(seribantumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西罗妥珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)
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西普利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非巴珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)
Figure BDA0002680645610000412
托拉珠单抗(toralizumab)、图克斯妥珠单抗(tucusituzumab)、乌马珠单抗(umavizumab)、乌头克珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)
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维多珠单抗(vedolizumab)
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维西珠单抗(visilizumab)、扎诺莫单抗(zanolimumab)、扎鲁单抗(zalutumumab)。
如本文中所用的，“说明性材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的说明性材料可例如被附加在包含本发明的治疗剂或诊断剂的容器上，或与包含本发明的治疗剂或诊断剂的容器一起运送。
术语“标记”在本文中使用时是指可检测的化合物或组合物。标记通常与试剂例如多核苷酸探针或抗体直接或间接地缀合或融合，并促进与之缀合或融合的试剂的检测。标记可以自身是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，在酶标记的情况下，可催化底物化合物或组合物的化学改变而产生可检测产物。
如本文中所用的术语“白细胞”或“白细胞”是指任何免疫细胞，包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞。
如本文所用，术语“定位”及其语法等同物意指在特定的或限定的空间或区域(例如特定的细胞、组织、细胞器或细胞内区域，例如细胞区室，例如，细胞核、细胞质、细胞核膜、细胞膜等)中积累或局限于此。
如本文中所用的术语“淋巴细胞”是指免疫系统的细胞，其是白细胞的一种。淋巴细胞包括但不限于T细胞(细胞毒性和辅助性T细胞)、B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。如本文中所用的术语“肿瘤浸润性淋巴细胞”是指存在于实体瘤中的淋巴细胞。如本文中所用的术语“循环淋巴细胞”是指存在于循环中(例如，存在于血液中)的淋巴细胞。
术语“间充质”、“间充质表型”等等在本领域中是知晓的，并且可以通过形态、分子和/或功能特征来鉴定。例如，间充质细胞通常具有细长或纺锤形的外观，表达间充质标志物(波形蛋白、纤连蛋白和N-钙粘蛋白)，分裂缓慢或不分裂和/或与上皮细胞相比运动、侵袭性和/或非锚定依赖性生长的水平相对更高。
如本文中所用的术语“间充质向上皮转化”(MET)是可逆的生物学过程，其包括由能动的、多极的或纺锤形的间充质细胞转化为平面阵列的称为上皮细胞的极化细胞。MET是EMT的逆过程。MET在正常发育、癌症转移和诱导多能性干细胞重编程中发生。在具体的实施方案中，MET是指已经经历EMT的细胞的重编程，以恢复一种或多种上皮特征(例如，如上所述)。例如，这样的细胞通常表现出降低的运动性和/或侵袭性和/或快速分裂，并因此可以恢复对免疫治疗剂和/或细胞毒性剂的敏感性。
术语“多重PCR”是指出于在单一反应中扩增两个或更多个DNA序列的目的，使用多于一个的引物组对从单一来源(例如，个体)获得的核酸进行的单一PCR反应。
本文中可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”指的是任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者，对其来说，治疗或预防是期望的。落入本发明范围内的适宜的脊椎动物包括但不限于，任何脊索动物亚门成员，所述脊索动物亚门包括灵长类(例如，人，猴和猿，并且包括猴种，例如来自猕猴(Macaca)属(例如，食蟹猴类，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta))和狒狒(Papioursinus)，以及狨猴(来自狨属(Callithrix)的物种)，松鼠猴(来自松鼠猴(Saimiri)属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴(Saguinus)属的物种)，以及猿物种例如黑猩猩(Pantroglodytes))；啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)；兔类动物(例如，家兔、野兔)；牛类动物(例如，牛)；绵羊类动物(例如，绵羊)；山羊类动物(例如，山羊)；猪类动物(例如，猪)；马类动物(例如，马)；犬科动物(例如，狗)；猫科动物(例如，猫)；禽(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅，陪伴鸟类例如金丝雀、虎皮鹦鹉等)；海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)；爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要癌症治疗(包括通过抑制癌细胞增殖或活力)和/或引发对癌细胞免疫应答(例如具有增强的T细胞活化的免疫应答)的人类。然而，应该理解，上述术语并不意味着症状存在。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指这样的制剂，其形式为允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对将要施以该组合物或制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。这样的制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(载体、添加剂)是可以合理地施用于哺乳动物受试者以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
如本文所用，“药效(PD)活性”可以指疗法(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)对受试者的作用。PD活性的示例可以包括调节至少一种对疗法有反应的生物标志物的定位，以及任选地表达至少一种间充质和/或干性生物标志物，如本文所述。不希望受理论的束缚，认为在检查疗法的临床试验中监测PD活性，例如通过确定至少一种对疗法有反应的生物标志物的定位以及任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的表达，可能是有利的。监测PD活性可以用于例如监测对治疗的反应，毒性等。
术语“预测”及其语法形式通常是指生物标志物或生物标志物标识，其提供了直接或间接地鉴定患者对疗法有反应的可能性、或在对疗法有反应中获得临床结果的手段。
术语“预后”及其语法形式通常是指试剂或方法，其提供了关于个体中疾病或病症的可能进展或严重程度的信息。在一些实施方案中，预后还指证实受试者中的疾病或病症对疗法或其他治疗方案阳性或阴性反应的能力。在一些实施方案中，预后是指预测与疾病/病症相关的症状的存在或减轻的能力。预后试剂或方法可以包括将受试者或从受试者获得的样本分为多种类别之一，其中所述类别与受试者将经历特定结果的不同可能性相关。例如，类别可以是低风险和高风险，其中低风险类别中的受试者经历不良结果的可能性比高风险类别中的受试者低(例如，在给定的时间段(例如5年或10年)内)。不良结果可能是例如疾病进展、疾病复发或可归因于疾病的死亡。
“放射疗法”意指使用直接的γ射线或β射线诱导充分的细胞损伤，从而限制其正常发挥功能的能力或完全破坏细胞。应理解，在本领域中会有许多已知方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型治疗为一次施用，典型剂量的范围为每天10至200单位(Gray)。
如本文中所使用，如果根据一组本领域可接受的客观标准或其合理的修改(包括临床上显著的获益，例如预防症状或减轻症状的严重性、或减缓癌症的进展)，受试者显示出抗癌效果的证据，则认为已经接受疗法治疗的癌症患者对该疗法“反应”、有“反应”、有“阳性反应”或“是反应性的”。将理解的是，关于癌症也可以使用前述术语。用于评估抗癌治疗对癌症的效果的多种不同客观标准是本领域已知的。世界卫生组织(WHO)标准(Miller，AB等人，Cancer 1981；47(1)：207-14)及其修订版本，实体瘤反应评估标准(RECIST)(Therasse P，等人J Natl Cancer Inst 2000；92：205-16)及其修订版本(Eisenhauer EA，New response evaluation criteria in solid tumors：revised RECIST guideline(版本1.1).Eur J Cancer 2009；45(2)：228-47)是客观标准组，其基于对肿瘤病变的大小和数量的成像测量以及对新病变的检测，例如，通过计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或常规放射线照片。所选病变(称为靶标病变)的尺寸用于计算来自不同时间点的图像之间肿瘤负荷的变化。然后，将计算出的反应分为完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定的疾病(SD)或进行性疾病(PD)。CR是肿瘤完全消失(-100％)、PD是增加约20％-25％或更高(取决于特定标准)和/或新病变的出现。PR是肿瘤病变大小的显著降低(至少约30％)(没有新的病变出现)，但反应不完全。SD介于PR和PD之间。(有关详细信息，参见表1和2)。这些标准被广泛用作评估抗癌试剂功效的II期临床试验的主要终点，例如作为总体生存的替代。但是，仅使用WHO、RECIST和RECIST 1.1标准进行的解剖学成像设计用于检测细胞毒性剂的早期效果，并且存在一定的局限性，特别是在评估稳定疾病的较新的癌症疗法的活性方面。使用免疫疗法抗癌试剂或分子靶向抗癌试剂治疗的患者的临床反应模式可能超出细胞毒性剂的范围，并可能在最初的肿瘤负担增加或出现新病变后出现。例如，对免疫检查点抑制剂的有意义的肿瘤反应可能在延迟后发生，在某些情况下是在WHO或RECIST定义的PD之后发生。定义了命名为免疫相关反应标准(irRC)的标准，以试图捕获使用免疫疗法观察到的其他有利的反应模式(Wolchok，J D等人(2009)Guidelines for the evaluation ofimmune therapy activity in solid tumors：immune-related responsecriteria.Clin.Care Res.15，7412-7420)。鉴定了与良好生存相关的四种模式，即基线病变减少而无新病变；持久稳定的疾病；最初的总肿瘤负担增加，但最终反应；以及在新病变出现期间或出现之后总肿瘤负担的降低，其中后两者不同于根据WHO或RECIST标准认为有利的反应模式。irRC包括完全反应(irCR)、部分反应(irPR)、稳定的疾病(irSD)和进行性疾病(irPD)的标准。除此之外，irRC将可测量的新病变纳入“总的肿瘤负担”，并将此变量与基线测量结果进行比较，而不是假设新病变必然代表进行性疾病。总之，根据免疫相关反应标准，irCR是所有病变完全消失，无论是否是可测量的，并且没有新病变；irPR是相对于基线，肿瘤负担减少≥50％；irSD是在没有进行性疾病(irPD)的情况下，不符合irCR或irPR标准的疾病；irPD是相对于最低点(记录的最低肿瘤负担)，肿瘤负担增加了25％以上(.gtoreq.25％)(Wolchok，同上)。irCR、irPR和irPD要求在首次记录之日起至少4周内进行重复、连续的评估确认。irCR、irPR和irSD包括根据WHO标准的所有CR、PR或SD患者，以及从WHO PD转到这些irRC类别的那些患者。但是，有些根据WHO或RECIST标准被归类为PD的患者实际上根据irRC被归类为PR或SD，irRC将其鉴别为可能具有良好的生存。irRC适用于免疫检查点抑制剂和其他免疫治疗剂。本领域普通技术人员将理解，其他反应标准是本领域已知的，这些反应标准考虑各种因素，例如肿瘤动脉增强程度的变化和/或作为肿瘤存活组织指示物的肿瘤密度，其中降低的动脉增强和降低的肿瘤密度是(例如，由于肿瘤坏死引起的)存活肿瘤组织减少的指示物。例如，修订的RECIST标准(mRECIST)考虑到肿瘤动脉增强程度的变化(Lencioni R和Llovet J M.Semin Liver Dis 30：52-60，2010)。Choi标准和修订的Choi标准考虑了CT上肿瘤密度的降低，Choi H等人，J Clin Oncol 25：1753-1759，2007；Nathan P D等人.，Cancer Biol Ther 9：15-19，2010；Smith A D等人，Am JRoentgenol 194：157-165，2010。这样的标准在某些癌症类型和/或使用某些类别的治疗剂中可能特别有用。例如，尽管进行了有效的治疗，但是在例如淋巴瘤、肉瘤、肝瘤、间皮瘤和胃肠道间充质肿瘤的肿瘤中，肿瘤大小的改变可以是最小的。CT肿瘤密度、对比增强或MRI特征似乎比大小更能提供信息。在某些实施方案中，可以使用功能成像，例如使用正电子发射断层扫描(PET)。例如，可以使用实体瘤中的PET反应标准(PERCIST)，其中通过用(18)F-FDG PET成像评估代谢变化，来评估治疗反应，示踪剂摄取减少作为指示物(Wahl R L等人，J Nucl Med 2009；50，Suppl 1：122S-50S)。还应该理解，针对各种特定癌症类型如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌开发的反应标准是本领域已知的。相比之下，如果疗法没有提供临床上显著的受益，例如预防或减轻症状的严重性、或增加癌症的进展速度，那么已经接受过该疗法治疗的癌症患者被认为对疗法“没有反应”、“缺乏反应”、具有“阴性反应”或“无反应”。
为了本公开的目的，如果患者至少根据免疫相关的反应标准具有完全反应、部分反应或稳定的疾病，那么用免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)作为单一疗法或与一种或多种其他活性剂(例如互补抑制剂、其他抗癌剂、或两者)组合治疗的癌症患者被认为对治疗“反应”、有“反应”或“是反应性的”。(还可以根据RECIST、RECIST 1.1、WHO和/或其他标准(例如上述的那些标准)，癌症患者是反应的)。同样，在这种情况下，癌症被称为对治疗“反应”、“是反应性的”或“敏感”。如果癌症患者根据免疫相关的反应标准具有进行性疾病，那么认为该癌症患者对治疗“无反应”、没有“反应”或“无反应性的”。(还可以根据RECIST、RECIST1.1、WHO和/或其他标准(例如上述的那些标准)，癌症患者是没有反应的)。同样，在这种情况下，癌症被称为对治疗“无反应”或“无反应性的”、“不敏感的”或“耐受性的”。(如果癌症最初有反应，但患者随后在治疗存在的情况下表现出进行性疾病，也认为癌症已变成对治疗耐受性的)。因此，例如，对于本文所述的与对癌症治疗的反应相关的方法和产品(例如，预测反应可能性的方法、根据预测的反应对患者进行分类的方法、增加反应可能性的方法)，将反应定义为irCR、irPR或irSD，没有反应定义为irPD，除非另有说明。在某些实施方案中，可以指定任何有用的反应标准。已经表明反应标准与受益相关，所述受益例如增加的总生存期或其他临床上显著的受益。应当理解，将来可能开发出适用于免疫检查点抑制剂或以其他方式使用的现有反应标准的改进或修订，例如包含其他有利的临床活性模式(例如，与增加的总生存期相关)。在某些实施方案中，可以指定任何这样的反应标准以用于本文描述的方法。
如本文所用，术语“样本”包括可以从受试者提取、未经处理的、经处理的、稀释的或浓缩的任何生物样本。样本在其范围内包括从受试者分离的相似流体、细胞或组织(例如，手术切除的肿瘤组织、活组织检查，包括细针抽吸)的集合，以及受试者中存在的流体、细胞或组织。在一些实施方案中，样本是生物流体。生物流体通常是在生理温度下的液体，并且可以包括存在于受试者或生物学源中、从受试者或生物学源中提取、受试者或生物学源中表达或以其他方式提取的天然存在的流体。某些生物流体源自特定的组织、器官或局部区域，并且某些其他生物流体可以更全局地或全身地位于受试者或生物源中。生物流体的例子包括血液、血清和浆液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊性流体、泪液、粪便、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水(例如与非实体瘤相关的腹水)、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其他体腔的流体、通过支气管灌洗收集的流体等。生物流体还可包括与受试者或生物源接触的液体溶液，例如，细胞和器官培养介质(包括细胞或器官的条件介质)、灌洗流体等。如本文所用，术语“样本”涵盖从受试者移除的材料或受试者中存在的材料。
如本文中使用的，“参照样本”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样本”、“对照细胞”或“对照组织”指用于比较目的的样本、细胞、组织、标准、或水平。在一个实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织自同一受试者或个体的健康和/或无疾病身体部位(例如组织或细胞)获得。例如，邻近患病细胞或组织的健康和/或无疾病细胞或组织(例如邻近肿瘤的细胞或组织)。在另一个实施方案中，参照样本自同一受试者或个体的身体的未治疗组织和/或细胞获得。在又一个实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织自个体的健康和/或无疾病身体部位(例如组织或细胞)获得，所述个体不是该受试者或个体。在再一个实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织自个体未治疗的身体组织和/或细胞获得，所述个体不是该受试者或个体。
如本文中使用的“小分子”是指分子量小于3千道尔顿(kDa)并且通常小于1.5千道尔顿、更优选小于约1千道尔顿的化合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。如本领域技术人员将理解的，根据本说明书，庞大的化学和/或生物混合物(通常为真菌、细菌或藻类提取物)库可以用本发明的任何测定法来筛选，以鉴定调控生物活性的化合物。“小有机分子”是分子量小于3千道尔顿、小于1.5千道尔顿或甚至小于约1kDa的有机化合物(或与无机化合物(例如金属)络合的有机化合物)。
本发明的各种方法包括一个步骤，该步骤涉及将值、水平、性质、特征、特性等与“合适的对照”进行比较，所述“合适的对照”在本文中可互换地称为“适当的对照”、“对照样本”或“参照”。“合适的对照”、“适当的对照”、“对照样本”或“参照”是本领域普通技术人员熟悉的可用于比较目的的任何对照或标准。在一些实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是在细胞、器官或患者中确定的值、水平、性质、特征、特性等，例如，对照细胞、细胞群、器官、或患者，其呈现例如特定的生物标志物谱(例如上皮细胞生物标志物谱、间充质细胞生物标志物谱、疗法耐受性癌细胞生物标志物谱、疗法敏感性癌细胞生物标志物谱、正常和/或非癌细胞生物标志物谱)。在其他实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是将癌细胞或包含癌细胞的细胞群暴露于疗法之前确定的值、水平、性质、特征、特性、比例等(例如，与特定生物标志物谱相关的生物标志物水平)。在一些实施方案中，可以在将癌细胞或包含癌细胞的细胞群暴露于疗法之前、期间或之后确定转录率、mRNA水平、翻译率、蛋白水平/比率、生物学活性、细胞特征或特性、基因型、表型等。“合适的对照”可以是一种或多种本发明的生物标志物的水平/比率的模式，其与特定生物标志物谱(例如上皮细胞生物标志物谱、间充质细胞生物标志物谱、疗法耐受性癌细胞生物标志物谱、疗法敏感性癌细胞生物标志物谱、正常和/或非癌细胞生物标志物谱)相关，可以将癌细胞样本与其进行比较。癌细胞样本也可以与阴性对照进行比较。这样的参照水平也可以根据用于测量生物样本中生物标志物水平的特定技术定制(例如LC-MS、GC-MS、ELISA、PCR等)，其中生物标志物的水平可能根据所使用的特定技术而不同。
如本文所用，术语“分层”和“分类”在本文中可互换使用，是指根据特定生理或病理生理状态或状况的特性将受试者分为不同的阶层或类别。例如，根据受试者是否可能对疗法(例如，化学疗法或免疫疗法)反应来对受试者群体进行分层，所述分层包括根据癌细胞中对疗法有反应的生物标志物(包括PD-L1-263KMe和PD-L1-263KAc)、任选地组合至少一种间充质和/或干性生物标志物水平分配受试者，所述至少一种间充质和/或干性生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)。
如本文所用，术语“治疗”是指被设计来改变临床病理过程中被治疗的个体或细胞的自然病程的临床干预。理想的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与癌症相关的一种或多种症状，包括但不限于降低(或破坏)癌细胞的增殖、减少病原体感染、减少疾病导致的症状、增加罹患疾病的人们的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量和/或延长个体的生存，则成功地“治疗”了个体。短语“用疗法治疗”、“用疗法治疗”、“用试剂治疗”、“用试剂治疗”等是指向患者施用有效量的疗法或试剂，包括癌症疗法或试剂(例如细胞毒性剂或免疫治疗剂)，或向患者同时施用有效量的两种或更多种疗法或试剂，包括癌症疗法或试剂(例如，两种或更多种选自细胞毒性剂和免疫治疗剂的试剂)。
如本文所用，“治疗结果”是指预测癌症患者对选择的疗法或治疗的反应，包括患者通过特定治疗将经历阳性或阴性结果的可能性。如本文所用，“指示阳性治疗结果”等指的是患者将从所选治疗中获得有益结果的可能性增加(例如，完全或部分反应、完全或部分缓解、降低的肿瘤大小、稳定的疾病等)。相比之下，“指示阴性治疗结果”等意指在潜在的癌症进展(例如进行性疾病、疾病复发、增加的肿瘤大小等)方面，患者将不会从选择的治疗中受益的可能性增加。
如本文中使用的，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性的还是良性的)以及所有癌前和癌细胞和组织。如本文中提及的术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”、“过度增殖性病症”和“肿瘤”不相互排斥。
如本文中使用的，对基因的名字加下划线或用斜体表示应指示基因，与其蛋白质产物相对而言，蛋白质产物以不存在任何下划线或斜体的基因名称示出。例如，“PD-L1”应意指PD-L1基因，而“PD-L1”应指示从“PD-L1”基因的转录和翻译和/或可变剪接而产生的一种或多种蛋白质产物。
除非另有明确说明，否则本文描述的每个实施方案加以必要变更后适用于每个和各个实施方案。
2.检测、诊断和预后的方法
本发明公开了在PD-L1多肽序列的第263位的赖氨酸的不同的翻译后修饰，其与PD-L1的NLS重叠，或包含在PD-L1的NLS中，刺激或增强PD-L1向细胞核或细胞质/细胞膜的定位。代表性的PD-L1多肽包含以下氨基酸序列：
Figure BDA0002680645610000481
Figure BDA0002680645610000482
其中，在第263位赖氨酸(即263K)以粗体突出显示。
本发明人发现，该赖氨酸的甲基化(即，PD-L1-263KMe)(包括三甲基化(Me3))使PD-L1基本上定位于癌细胞的细胞质和/或细胞膜，并且该赖氨酸的乙酰化(即，PD-L1-263KAc)使PD-L1主要定位于癌细胞的细胞核。值得注意的是，发现PD-L1定位于癌细胞的细胞质和/或细胞膜与癌细胞对疗法的敏感性相关，并且发现PD-L1定位于癌细胞的细胞核与EMT和/或癌细胞的干性以及对疗法(例如化学疗法和/或免疫疗法)的耐受性相关。
还发现这些PD-L1翻译后修饰(PTM)的生物标志物(即，PD-L1-263KAc和PD-L1-263KMe)，在本文中也称为“对疗法有反应的”生物标志物)可以任选地与一种或多种间充质和/或干性生物标志物组合使用，这些间充质和/或干性生物标志物合适地与药物耐受性和/或疾病负担相关，例如CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5，用于监测对疗法的反应和用于预测治疗结果。
因此，根据本发明，PD-L1-263KAc和PD-L1-263KMe可用作确定PD-L1的细胞定位的生物标志物，用于预测癌细胞对疗法有反应的可能性(例如，化学疗法和/或免疫疗法)，包括预测癌细胞对疗法具有耐受性或敏感性的可能性、将癌症患者分层为对疗法的可能的反应者或无反应者、管理通过疗法治疗癌症患者、以及预测用疗法治疗的癌症患者的治疗结果。
可以从任何合适的含癌细胞的患者样本中获得用于实施本发明的癌细胞，其说明性示例包括肿瘤活检组织、循环中的肿瘤细胞、原代细胞培养物或源自肿瘤或表现出肿瘤样特性的细胞系、以及保存的肿瘤样本，例如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样本或冷冻的肿瘤样本。在一些实施方案中，在用疗法治疗之前获得样本。在其他实施方案中，在用疗法治疗后获得样本。在一些实施方案中，样本包括组织样本，其可以是福尔马林固定和石蜡包埋的、存档保存的、新鲜的或冷冻的。在一些实施方案中，样本是全血。在一些实施方案中，全血包含免疫细胞、循环中的肿瘤细胞及其任何组合。
可以根据本领域已知的任何合适的标准定性和/或定量地确定生物标志物(例如，PD-L1-263KAc，PD-L1-263KMe和任选地PD-L1-WT、CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5中的任何一种或多种)的存在和/或水平/量可以，包括但不限于蛋白和蛋白片段。在某些实施方案中，与第二样本中(例如，在用疗法治疗之前)存在/不存在和/或表达水平/量相比，第一样本中的生物标志物的存在和/或表达水平/量增加或升高。在某些实施方案中，与第二样本中的生物标志物的存在和/或水平/量相比，第一样本中生物标志物的存在/不存在和/或水平/量减少或降低。在某些实施方案中，第二样本是参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织。本文描述了确定基因存在/不存在和/或水平/量的其他公开内容。
在任何方法的一些实施方案中，升高的水平是指与参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织相比，通过标准技术领域已知的方法(例如本文所述的那些方法)检测到的生物标志物(例如，蛋白质或核酸)水平总体增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％中的任意或更高。在某些实施方案中，升高的水平是指样本中生物标志物的水平/量的增加，其中所述增加是参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织中相应的生物标志物的水平/量的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75x或100倍中的任意。在一些实施方案中，升高的水平是指与参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞、对照组织或内部对照(例如，管家基因)相比，总体增加大于约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍、或约3.25倍。
在任何方法的一些实施方案中，降低的水平是指与参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织相比，通过标准技术领域已知的方法(例如本文所述的那些方法)检测到的生物标志物(例如，蛋白质或核酸(如基因或mRNA))水平总体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％中的任意或更高。在某些实施方案中，降低的水平是指样本中生物标志物的水平/量的降低，其中所述降低是参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织中相应的生物标志物的水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、或0.01倍中的任意。
样本中各种生物标志物的存在和/或水平/量可以通过多种方法进行分析，其中许多方法是本领域已知的并且是技术人员所理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、蛋白印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光活化的细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白组学、基于血液定量的测定法(例如，血清ELISA)、生化酶活性测定法、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“PCR”)，包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法，例如，分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱分析和/或基因表达的系列分析(“SAGE”)、以及可以通过蛋白、基因和/或组织阵列分析进行的多种分析中的任何一种。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于，例如，Ausubel等人，编辑，1995，Current Protocols In MolecularBiology，第2单元(Northern印记)，第4单元(Southern印记)，第15单元(免疫印迹)和第18单元(PCR分析)。也可以使用多重免疫测定法，例如可从Rules Based Medicine或MesoScale Discovery(“MSD”)获得的那些免疫测定法。
在一些实施方案中，使用以下方法确定生物标志物的存在和/或水平/量，特别是确定非PTM生物标志物(例如，本文公开的间充质和/或干性生物标志物)的存在和/或水平/量，所述方法包括：(a)在样本(例如受试者癌症样本)上进行基因表达谱分析、PCR(例如，RT-PCR或qRT-PCR)、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术或FISH；和b)确定样本中生物标志物的存在和/或表达水平/量。在一些实施方案中，微阵列方法包括使用微阵列芯片，所述微阵列芯片具有一种或多种可在严格条件下与编码上述基因的核酸分子杂交的核酸分子，或者所述微阵列芯片具有可与上述基因编码的一种或多种蛋白质结合的一种或多种多肽(例如肽或抗体)。在一个实施方案中，PCR方法是qRT-PCR。在一个实施方案中，PCR方法是多重PCR。在一些实施方案中，通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中，通过qRT-PCR测量基因表达。在一些实施方案中，通过多重PCR测量表达。
评估细胞中mRNA的方法是众所周知的，并且包括，例如，使用互补DNA探针的杂交测定法(例如，使用对一个或多个基因具有特异性的标记核糖探针进行的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(例如，使用对一个或多个基因具有特异性的互补引物进行的RT-PCR，以及其他扩增类型检测方法，例如，分支DNA、SISBA、TMA等)。
可以使用Northern、斑点印迹或PCR分析方便地对来自哺乳动物的样本测定mRNA。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其使得能够测定生物学样本中靶mRNA的水平(例如通过同时检查“管家”基因(例如肌动蛋白家族成员)比较性对照mRNA序列的水平)。任选地，可测定所扩增的靶cDNA的序列。
任选方法包括通过微阵列技术在组织或细胞样本中检查或检测mRNA(例如，靶标mRNA)的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样本的测试和对照mRNA样本逆转录并标记以生成cDNA探针。然后，将探针与固定于固体支持物上的核酸阵列杂交。阵列配置为使得阵列每个成员的序列和位置是已知的。例如，可将其表达与增加或降低的疗法临床受益相关的基因选择在固体支持物上排成阵列。标记探针与特定阵列成员的杂交指示得到该探针的样本表达该基因。
在优选的实施方案中，通过观察蛋白水平来测量存在和/或水平/量。在某些实施方案中，该方法包括在允许结合一种或多种生物标志物的条件下，使生物样本与针对至少一个对疗法有反应的生物标志物(例如，PD-L1-263KAc和/或PD-L1-263KMe)的抗体、任选地组合有针对至少一种间充质和/或干性生物标志物(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和/或ABCB5)的抗体接触，并检测一种或多种抗体与生物标志物之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，一种或多种抗生物标志物抗体用于选择适合于疗法(例如细胞毒性疗法或免疫疗法)的受试者。
在某些实施方案中，使用IHC和染色方案来检查样本中生物标志物蛋白的存在和/或表达水平/量。已显示对组织切片的IHC染色是一种确定或检测样本中蛋白质的存在的可靠方法。在一些实施方案中，在来自个体的样本中，对疗法有反应的生物标志物(例如，PD-L1-263KAc和/或PD-L1-263KMe)和/或间充质和/或干性生物标志物的水平是升高的水平，以及在其他实施方案中，该水平是使用IHC测定的。在一个实施方案中，使用以下方法来测定生物标志物的水平，所述方法包括：(a)用抗体对样本(例如受试者癌症样本)进行IHC分析；和(b)测定样本中生物标志物的水平。在一些实施方案中，IHC染色强度是相对于参照确定的。在一些实施方案中，参照为参照值。在一些实施方案中，参照为参照样本(例如对照细胞系染色样本或来自非癌症患者的组织样本)。
在一些实施方案中，对肿瘤或肿瘤样本评估至少一种对疗法有反应的生物标志物(例如，PD-L1-263KAc和/或PD-L1-263KMe)和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和/或ABCB5)的表达。如本文中所用，肿瘤或肿瘤样本可涵盖被肿瘤细胞占据的部分或全部肿瘤区域。在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤样本可以进一步涵盖肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质(例如，毗邻的肿瘤周围促结缔组织增生性基质)所占据的肿瘤区域。肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质可包括紧邻主要肿瘤块和/或与主要肿瘤块毗邻的免疫浸润区域(例如，本文所述的肿瘤浸润性免疫细胞)。在一些实施方案中，对肿瘤细胞评估对疗法有反应的生物标志物表达和任选地间充质和/或干性生物标志物表达。
在可选方法中，可使样本与特异于所述生物标志物的抗体在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下接触，然后检测该复合物。可以许多方法来检测生物标志物的存在，如通过蛋白印迹和ELISA步骤，其用于测定多种组织和样本，包括血浆或血清。可获得大量使用这类测定形式的免疫测定技术，参见例如美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争型的单位点和双位点二者或“夹心式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法还包括标记抗体对靶标生物标志物的直接结合。
在某些实施方案中，针对测定的生物标志物的量中的差异和使用的样本质量中的变异性以及测定法轮数之间的变异性，将样本标准化。这类标准化可通过检测并纳入某些标准化生物标志物(包括公知的管家基因的表达产物)的表达来实现。或者，标准化可基于所有测定基因或其大的子集的均值或中值信号(全局标准化方法)。在逐个基因的基础上，将测量的受试者肿瘤mRNA或蛋白质的经标准化的量与在参照集中发现的量相比较。每受试者每测试肿瘤的各mRNA或蛋白质的标准化表达水平可表示为参照集中所测量的表达水平的百分数。在要分析的特定受试者样本中测量的存在和/或表达水平/量将落在该范围内的某个百分位处，这可通过本领域中公知的方法来测定。
在一个实施方案中，样本是临床样本。在一些实施方案中，样本从原发性或转移性肿瘤获得。经常使用组织活检来获得代表性的肿瘤组织块。或者，可以以已知或认为含有感兴趣肿瘤细胞的组织或流体的形式间接获得肿瘤细胞。例如，可通过切除、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰、胸膜液或血液获得肺癌病变的样本。可从癌症或肿瘤组织或从其他身体样本如尿液、痰、血清或血浆检测基因或基因产物。上文论述的用于检测癌性样本中靶基因或基因产物的相同技术可应用于其他身体样本。癌细胞可能从癌病变处脱落并出现在这类身体样本中。通过筛选这类身体样本，可实现对这些癌症的简单的早期诊断。另外，通过测试这类身体样本中的靶基因或基因产物能更容易地监测治疗的进展。
在某些实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自同一受试者或个体的单一样本或组合的多重样本，其在不同于获得测试样本时的时间点的一个或多个时间点获得。例如，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织在早于获得测试样本时的时间点的时间点上从同一受试者或个体获得。如果参照样本在癌症的初始诊断期间获得而测试样本在癌症变成转移性时的更晚时候获得，那么这类参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织可以是有用的。
在某些实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者或个体的一个或多个健康个体的多重样本组合。在某些实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者或个体的患有疾病或病症(例如癌症)的一个或多个个体的多重样本组合。在某些实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者或个体的一个或多个个体的正常组织的合并RNA样本或合并的血浆或血清样本。在某些实施方案中，参照样本、参照细胞、参照组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者或个体的患有疾病或病症(例如癌症)的一个或多个个体的肿瘤组织的合并RNA样本或合并的血浆或血清样本。
在一些实施方案中，样本为来自个体的组织样本。在一些实施方案中，组织样本为肿瘤组织样本(例如活检组织)。在一些实施方案中，组织样本为肺组织。在一些实施方案中，组织样本为肾组织。在一些实施方案中，组织样本为皮肤组织。在一些实施方案中，组织样本为胰腺组织。在一些实施方案中，组织样本为胃组织。在一些实施方案中，组织样本为膀胱组织。在一些实施方案中，组织样本为食道组织。在一些实施方案中，组织样本为间皮组织。在一些实施方案中，组织样本为乳腺组织。在一些实施方案中，组织样本为甲状腺组织。在一些实施方案中，组织样本为结直肠组织。在一些实施方案中，组织样本为头和颈组织。在一些实施方案中，组织样本为骨肉瘤组织。在一些实施方案中，组织样本为前列腺组织。在一些实施方案中，组织样本为卵巢组织、HCC(肝)、血细胞、淋巴结、和/或骨/骨髓组织。在一些实施方案中，组织样本为结肠组织。在一些实施方案中，组织样本为子宫内膜组织。在一些实施方案中，组织样本为脑组织(例如成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤，例如此类)。
在一些实施方案中，肿瘤组织样本(术语“肿瘤样本”在本文中可互换使用)可涵盖被肿瘤细胞占据的部分或全部肿瘤区域。在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤样本可进一步涵盖肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质(例如，连续的肿瘤周围促结缔组织增生性基质)所占据的肿瘤区域。肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质可包括紧邻主要肿瘤块和/或与主要肿瘤块毗邻的免疫浸润区域。
在一些实施方案中，肿瘤细胞染色表示为显示任何强度的染色(例如，细胞膜、细胞质或细胞核染色)的所有肿瘤细胞的百分比。浸润性免疫细胞染色可以表示为被显示任何强度的染色的免疫细胞占据的总肿瘤面积的百分比。总肿瘤面积涵盖恶性细胞以及肿瘤相关基质，包括紧邻主要肿瘤块和与主要肿瘤块毗邻的免疫浸润的面积。另外，浸润性免疫细胞染色可以表示为所有肿瘤浸润性免疫细胞的百分比。
在一些实施方案中，肿瘤为恶性癌性肿瘤(即癌症)。在一些实施方案中，肿瘤和/或癌症为实体瘤或非实体或软组织肿瘤。软组织肿瘤的示例包括白血病(例如慢性髓性白血病、急性髓性白血病、成人急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、成熟B-细胞急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、幼淋巴细胞白血病、或毛细胞性白血病)或淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、或霍奇金氏病)。实体瘤包括除血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的和非上皮细胞起源的。上皮细胞实体瘤的示例包括胃肠道、结肠、结直肠(例如基底细胞样结直肠癌)、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢(例如子宫内膜样卵巢癌)、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官(例如尿路上皮癌、发育异常尿路上皮癌、移行细胞癌)、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，癌症为二线或三线局部晚期或转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症为腺癌。在一些实施方案中，癌症为鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(CRC)、或肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症为原发性肿瘤。在一些实施方案中，癌症为自任何上述类型癌症衍生的第二部位处的转移性肿瘤。
在一些实施方案中，使用选自以下的方法检测样本中至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物：FACS、蛋白印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组化、免疫荧光、放射免疫测定法、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、和FISH，及其组合。在一些实施方案中，使用FACS分析检测至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物。在一些实施方案中，检测血液样本中的至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物。在一些实施方案中，检测血液样本中的循环肿瘤细胞中的至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物。可以使用任何合适的方法来分离/富集这种细胞群，包括但不限于细胞分选。在一些实施方案中，在来自对疗法(适当地，免疫疗法(例如，包括抗免疫检查点分子抗体的免疫疗法，所述抗免疫检查点分子抗体的说明性示例包括抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体))治疗反应的个体的样本中，PD-L1-263KAc表达降低。在一些实施方案中，在来自对疗法(适当地，免疫疗法(例如，包括抗免疫检查点分子抗体的免疫疗法，所述抗免疫检查点分子抗体的说明性示例包括抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体))治疗无反应或弱反应的个体的样本中，PD-L1-263KAc表达升高。在一些实施方案中，在来自对疗法(适当地，免疫疗法(例如，包括抗免疫检查点分子抗体的免疫疗法，所述抗免疫检查点分子抗体的说明性示例包括抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体))治疗无反应或弱反应的个体的样本中，PD-L1-263Me表达降低。在一些实施方案中，在来自对疗法(适当地，免疫疗法(例如，包括抗免疫检查点分子抗体的免疫疗法，所述抗免疫检查点分子抗体的说明性示例包括抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体))治疗反应的个体的样本中，PD-L1-263KMe表达升高。
本文还提供了预测/预后方法和试剂盒，这些方法和试剂盒基于以下确定：PD-L1-263KAc与PD-L1-结合配偶体(选自P300、DNMT1和SETDB1)在细胞核中共定位，并且这种共定位至少部分导致癌细胞的EMT以及对疗法的耐受性或无反应性。适当地，所述诊断方法包括：(i)从受试者获得样本，其中所述样本包含癌细胞(例如，CTC)；(ii)使样本与结合样本中的PD-L1-263KAc的第一抗原结合分子和结合样本中的PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子接触；和(iii)检测第一和第二抗原结合分子在癌细胞核中的定位，其中第一和第二抗原结合分子在癌细胞核中的定位指示癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加，癌症患者可能是对疗法无反应者，选择癌症患者不接受该疗法治疗，和/或预测对患者的治疗结果为可能是阴性治疗结果。
可以使用任何合适的定位技术进行PD-L1-263KAc和PD-L1-结合配偶体在癌细胞核中的定位，例如，通常使用抗PD-L1-263KAc抗体通过IHC进行，所述抗PD-L1-263KAc抗体与抗PD-L1-结合配偶体抗体具有不同的可检测部分或标记。在一些实施方案中，采用空间邻近测定法(也称为“邻近测定法”)，其可用于评估PD-L1-263KAc与PD-L1-结合配偶体之间复合物的形成。邻近测定法依赖于“邻近探测”原理，其中，通过同时结合多种(即，两种或更多种，通常是两种、三种或四种)结合剂或探针来检测分析物(通常是抗原)，所述多种结合剂或探针在通过与分析物结合而邻近时(因此是“邻近探针”)，允许产生信号。
在一些实施方案中，邻近探针中的至少一个包含与探针的分析物结合结构域(或部分)连接的核酸结构域(或部分)，并且信号的产生涉及核酸部分和/或由其他探针携带的其他功能性部分之间的相互作用。因此，信号产生取决于探针之间的相互作用(更具体地，取决于探针所携带的核酸或其他功能性部分/结构域)，因此仅当两个(或更多个)必须的探针都结合于分析物时才出现信号，从而向检测系统提供改善的特异性。近年来发展了邻近探测的概念，现在基于该原理的许多测定法在本领域是熟知的。
邻近测定法通常用于评价两个特定蛋白或其部分是否紧密邻近，例如彼此结合的蛋白、融合蛋白、和/或紧密邻近定位的蛋白。一种被称为邻近连接测定法(PLA)、并在本发明的一些实施方案中使用的这种测定法的特征在于与感兴趣靶标结合的两个抗体(在不同物种中产生)(参见Nature Methods 3，995-1000(2006))。然后作为具有连接的独特寡核苷酸链的物种特异性二抗的PLA探针与适当的一抗结合。在靶标密切邻近的情况下，PLA探针的寡核苷酸链可与额外的ssDNA和DNA连接酶相互作用，使得它们可以环化并经由滚环循环扩增(RCA)扩增。当使用高度加工性的DNA聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶时，环状DNA模板可以复制长达数百至数千倍，结果产生长度为几百纳米至微米的ssDNA分子(参见AngewandteChemie International Edition，2008，47，6330-6337)。扩增后，可以经由检测系统检测复制的DNA。因此，可见信号指示感兴趣靶标是紧密邻近的。这些测定法的特征在于使用若干种DNA-抗体缀合物以及酶(例如DNA连接酶和DNA聚合酶)。
在其他实施方案中，采用双重结合剂(DB)测定法，其利用由两个Fab片段组成的双特异性检测剂，所述两个Fab片段具有通过柔性接头连接的快速解离速率动力学(Vandieck等人，2014 Chemistry&Biology Vol.21(3)：357-368)。在原理上，因为双重结合剂包含具有快速解离速率动力学的Fab片段，所以如果仅Fab片段之一与其表位结合，则双重结合剂被洗掉(双重结合剂的两个Fab片段的同时协同结合防止双重结合剂的解离，并导致阳性染色/可见性)。
根据国际公开WO2014/139980中公开的另一种方法(其在实践本发明时被包含)，描述了邻近测定法和工具，其采用生物素连接酶底物和酶以执行邻近测定法。该方法提供了靶标分子和邻近度的检测，同时维持样本的细胞环境。使用生物素连接酶(例如来自大肠杆菌的酶)和肽底物(例如用于该酶的氨基酸底物)，提供了FFPE样本中的蛋白-蛋白相互作用的敏感性和特异性的检测。因为生物素连接酶可以在生物素存在的情况下有效地将适当的肽底物生物素化，并且仅当酶与肽底物物理接触时才可发生反应，所以生物素连接酶和底物可以分别与分别识别感兴趣靶标的两种抗体缀合。
本文还提供了用于监测疗法(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)的药效学活性的方法，所述方法通过以下进行：如本文所述，确定从受试者获得的包含癌细胞的样本中的PD-L1的区室位置和/或确定至少一种对疗法有反应的生物标志物(例如，PD-L1-K263Ac和/或PD-L1-K263Me)和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)的水平或量，其中所述受试者已经接受了该疗法治疗，和根据与参照比较，从受试者获得的样本中的至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的表达水平，确定该治疗表现出药效学活性，其中：(1)与合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，表达PD-L1-K263Ac的患者癌细胞)相比，癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，并且至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，表明疗法没有药效学活性或者有弱的药效学活性，(2)与合适的对照(例如，在暴露于疗法之前患者的癌细胞)相比，癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，并且至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，表明疗法没有药效学活性或者有弱的药效学活性，(3)与合适的对照(例如，在暴露于疗法之前患者的癌细胞)相比，癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，并且至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，表明疗法有显著的或强的药效学活性，(4)与合适的对照(例如，在暴露于疗法之前患者的癌细胞)相比，癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，并且至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，表明疗法有显著的或强的药效学活性，和(5)与合适的对照(例如，在暴露于疗法之前患者的癌细胞)相比，癌细胞中PD-L1-K263Me的水平降低，并且至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，表明疗法没有药效学活性或者有弱的药效学活性。可以通过本文所述的一种或多种方法来测量生物标志物和/或细胞组成的表达水平。
在一些实施方案中，可以将一种或多种生物标志物基因、蛋白和/或细胞组成的表达水平与参照进行比较，所述参照可以包括来自未接受疗法(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)的受试者的样本。在一些实施方案中，参照可包括来自相同受试者在接受疗法(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)之前的样本。在一些实施方案中，参照可以包括来自接受疗法(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)的其他受试者的一个或多个样本的参照值。例如，可以治疗患者群体，并且可以从作为整体的该群体中产生至少一种对疗法有反应的生物标志物和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的表达水平的平均值、平均值或中值。可以研究从群体中具有共同特征(例如，相同的癌症类型和/或阶段，或暴露于共同疗法)的癌症获得的一组样本，例如进行临床结果研究。可以使用该组衍生出参照，例如，参照数量，可以使该参照数量与受试者的样本进行比较。本文所述的任何参照都可以用作监测PD活性的参照。
本公开的某些方面涉及测量样本中一种或多种生物标志物(例如基因表达产物，包括mRNA和蛋白质)的表达水平。在一些实施方案中，样本可包括癌细胞。在一些实施方案中，样本可以是外周血样本(例如，来自肿瘤患者)。在一些实施方案中，样本是肿瘤样本。肿瘤样本可包括癌细胞、淋巴细胞、白细胞、基质、血管、结缔组织、基底层以及任何与肿瘤相关的其他细胞类型。在一些实施方案中，样本是含有肿瘤浸润性白细胞的肿瘤组织样本。在一些实施方案中，可以处理样本以分开或分离一种或多种细胞类型(例如，白细胞)。在一些实施方案中，可以在不分开或分离细胞类型的情况下使用样本。
可以通过本领域已知的任何方法自受试者获得肿瘤样本，包括但不限于活检、内窥镜检查术、或手术程序。在一些实施方案中，可以通过例如冷冻、固定(例如通过使用福尔马林或类似固定剂)、和/或包埋于石蜡中的方法来制备肿瘤样本。在一些实施方案中，可以将肿瘤样本切片。在一些实施方案中，可以使用新鲜的肿瘤样本(即尚未通过上文描述的方法制备的肿瘤样本)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育以保持mRNA和/或蛋白质完整性来制备肿瘤样本。
在一些实施方案中，样本可以是外周血样本。外周血样本可以包括白细胞、PBMC，等等。可以使用本领域已知的任何技术自外周血样本分离白细胞。例如，可以采集血液样本，可以裂解红细胞，并且可以分离白细胞沉淀，并用作样本。在另一示例中，使用密度梯度分离将白细胞(例如PBMC)与红细胞分开。在一些实施方案中，可以使用新鲜外周血样本(即尚未通过上文所述方法制备的外周血样本)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育以保持mRNA和/或蛋白质完整性来制备外周血样本。
在一些实施方案中，对疗法的反应可以指下述任一项或多项：延长的生存期(包括总生存期和无进展生存期)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。在一些实施方案中，反应性可以指依照RECIST指南用于测定癌症患者中的肿瘤状态(即反应、稳定、或进展)的公开内容，一项或多项因素的改善。关于这些指南的更加详细的讨论，参见Eisenhauer等人(2009 Eur J Cancer 45：228-47)，Topalian等人(2012 NEngl J Med 366：2443-54)，Wolchok等人(2009 Clin Can Res 15：7412-20)和Therasse等人(2000 J.Natl.Cancer Inst.92：205-16)。反应的受试者可以指其癌症显示改善的受试者，例如根据基于RECIST标准的一种或多种因素。无反应的受试者可以指其癌症未显示改善的受试者，例如根据基于RECIST标准的一种或多种因素。
常规反应标准可能不适合表征本发明的治疗剂的抗肿瘤活性，该治疗剂可能产生延迟的反应，在这种反应之前可能有初始明显的放射学进展，包括出现新的病变。因此，已开发了修订的反应标准，其考虑了可能出现新病变且容许在后续评估时确认放射学进展。因而，在一些实施方案中，反应性可以指依照免疫相关反应标准(irRC)的一项或多项因素的改善。参见例如Wolchok等人(2009，同上)。在一些实施方案中，将新的病变加入限定的肿瘤负担中，并且在后续评估时跟踪用于例如放射学进展。在一些实施方案中，将非靶病变的出现纳入到完全反应的评估中，而不纳入到放射学进展的评估中。在一些实施方案中，可以只基于可测量疾病确定放射学进展，和/或可以通过自第一次记录日起≥4周的连贯评估来确认放射学进展。
在一些实施方案中，反应性可以包括免疫激活。在一些实施方案中，反应性可以包括治疗功效。在一些实施方案中，反应性可以包括免疫激活和治疗功效。
3.生物标志物组
本发明的生物标志物可以用于预测和/或预后测试中，以评估、确定和/或限定(在本文中可互换使用)患者中对疗法有反应的标识状态，因此指导对患者的治疗。短语“对疗法有反应的标识状态”包括对疗法高反应的标识(RT高)和对疗法低反应的标识(RT低)。基于此状态，可以指示进一步的程序，包括额外的测试或治疗程序或方案。
本文公开了这些和其他生物标志物，并且应当理解，当公开这些生物标志物的组合、亚组、相互作用、组等时，尽管具体提及这些化合物的各种单独的和集体的组合和排列可能未明确公开，但是每种都在本文中被特别考虑和描述。因此，如果公开了一组生物标志物A、B和C以及一类生物标志物D、E和F，并且公开了组合的A-D组的示例，那么即使每个生物标志物没有单独列举，其各自也被单独地和共同地考虑为有意义的组合，认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了其任何亚组或组合。因此，例如，认为公开了A-E、B-F和C-E的亚组。这个概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于使用所公开的生物标志物的方法中的步骤。因此，如果有多种可以执行的附加步骤，则应理解，可以通过所公开的方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合来执行这些附加步骤中的每个步骤。
对疗法有反应的标识组适当地包括PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me中的一种或多种，以及至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述间充质和/或干性生物标志物合适地与药物耐受性和/或疾病负担相关，选自CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5。这些标识的非限制性示例包括PD-L1-K263Ac和PD-L1-K263me中的一个或两者，以及至少一种选自以下生物标志物组合的间充质和/或干性生物标志物：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5和(u)ABCB5。
通常将测定法正确预测对疗法的反应的能力作为测定法的敏感性、测定法的特异性或接受者工作特征(“ROC”)曲线下面积测量。敏感性是通过测试预测为阳性的真阳性百分比，而特异性是通过测试预测为阴性的真阴性百分比。ROC曲线提供了测试的敏感性作为1-特异性的函数。ROC曲线下的面积越大，测试的预测值越有效。测试效用的其他有用的测量值是阳性预测值和阴性预测值。阳性预测值是测试阳性的人实际为阳性的百分比。阴性预测值是测试阴性的人实际为阴性的百分比。
在特定的实施方案中，本发明的生物标志物标识可以在对疗法状态的不同反应中显示出至少p<0.05、p<10-2、p<10-3、p<10-4或p<10-5的统计学差异。使用这些生物标志物的预测或预后测试可显示至少0.6、至少约0.7、至少约0.8或至少约0.9的ROC。
在某些实施方案中，使用本文描述的方法在患者样本中测量生物标志物，并计算对疗法有反应的标识状态。在特定实施方案中，然后可将测量结果与相关预测或预后量、截止值、或多元模型评分进行比较，区分对疗法高反应的标识(RT高)状态与对疗法低反应的标识(RT低)状态。预测或预后量表示测量的生物标志物的量，在其上或其下，患者被分类为具有特定的疗法反应标识状态。如本领域众所周知的，通过调整测定法中使用的特定的预测或预后截止值，人们可以根据技术人员的偏好来增加测定法的敏感性或特异性。在特定的实施方案中，例如，通过测量来自患者的统计学上显著数量的样本中生物标志物的水平或量(所述患者具有不同的对疗法有反应的标识状态)、和提取适应所需的特异性和敏感性水平的截止值，来确定特定的预测或预后截止值。
此外，在某些实施方案中，在数学上组合生物标志物组的生物标志物的测量值，并且将组合的值与对疗法高反应或低反应的标识的潜在预测或预后问题相关。可以通过本领域已知的任何合适的数学方法来组合生物标志物值。使生物标志物组合与疾病状态关联的众所周知的数学方法采用以下方法：例如判别分析(DA)(例如，线性DA、二次DA、规整化DA)，判别功能分析(DFA)、内核方法(例如，SVM)、多维标度(MDS)、非参数方法(例如，k最近邻分类器)、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(例如，逻辑回归、CART、随机森林方法、增强/装袋方法)、通用线性模型(例如，逻辑回归)、基于主成分的方法(例如，SIMCA)、广义加性模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员在选择合适的方法以评价本发明的生物标志物组合方面不会有问题。在一个实施方案中，用于关联本发明的生物标志物组合的方法选自DA(例如，线性判别分析、二次判别分析、规整化判别分析)、DFA、内核方法(例如，SVM)、MDS、非参数方法(例如，k最近邻分类器)、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(例如，逻辑回归、CART、随机森林方法、增强方法)或通用线性模型(例如，逻辑回归)和主成分分析。在以下参考文献中找到与这些统计方法相关的细节：Ruczinski等人，12 J.OFCOMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475-511(2003)；Friedman，J.H.，84 J.OFTHE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165-75(1989)；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Seriesin Statistics(2001)；Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.Classification and regression trees，California：Wadsworth(1984)；Breiman，L.，45 MACHINE LEARNING 5-32(2001)；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation ofMedical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical ScienceSeries，28(2003)；和Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，Pattern Classification，WileyInterscience，第2版(2001)。
4.生成用于限定对疗法有反应的标识状态的分类算法
在一些实施方案中，使用样本(例如“已知样本”)生成的数据而后可以用于“训练”分类模型。“已知样本”是已经被预先分类的样本。用于形成分类模型的数据可以称为“训练数据组”。用于形成分类模型的训练数据组可以包括原始数据或预先处理的数据。被训练后，分类模型可以鉴定使用未知样本生成的数据中的模式。然后可以使用分类模型对未知样本分类。例如，这可能在预测特定生物样本是否与特定生物状况相关时是有用的。
可以使用任何合适的统计分类或学习方法来形成分类模型，这些方法尝试根据数据中存在的客观参数将数据主体分为几类。分类方法可以是监督的，也可以是无监督的。监督和无监督的分类方法的示例描述在Jain,“Statistical Pattern Recognition：AReview”，IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence，第22卷，第1号，2000年1月，其教导通过引用并入本文。
在监督分类中，将包含已知类别示例的训练数据提供给学习机制，该学习机制学习一组或多组定义每种已知类别的关系。然后可以将新数据应用于学习机制，该学习机制随后使用所学习的关系对新数据进行分类。监督分类方法的示例包括线性回归方法(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归和主成分回归(PCR))、二元决策树(例如，递归划分方法，例如CART)、人工神经网络，例如反向传播网络、判别分析(例如，贝叶斯分类器或菲舍尔分析)、逻辑分类器和支持向量分类器(支持向量机)。
另一种监督分类方法是递归划分方法。递归划分方法使用递归划分树对源自未知样本的数据进行分类。在Paulse等人的美国专利申请号2002 0138208A1，“Method foranalyzing mass spectra”中提供了关于递归划分方法的更多细节。
在其他实施方案中，可以使用无监督学习方法来形成所创建的分类模型。无监督分类尝试基于训练数据组中的相似性来学习分类，而不预先分类从中得出训练数据组的谱。无监督学习方法包括聚类分析。聚类分析尝试将数据分为“集群”或组，理想情况下，这些集群或组应具有彼此非常相似的成员，而这些成员与其他集群的成员非常不同。然后使用某种距离度量来测量相似性，该距离度量测量数据项之间的距离，并将彼此比较邻近的数据项聚类在一起。聚类技术包括MacQueen的K-means算法(MacQueen’s K-meansalgorithm)和Kohonen的自组织映射算法(Kohonen’s Self-Organizing Map algorithm)。
被声称用于对生物信息进行分类的学习算法在例如PCT国际公开号WO 01/31580(Barnhill等人“Methods and devices for identifying patterns in biologicalsystems and methods of use thereof”)、美国专利申请公开号2002/0193950(Gavin等人“Method or analyzing mass spectra”)、美国专利申请公开号2003/0004402(Hitt等人“Process for discriminating between biological states based on hiddenpatterns from biological data”)和美国专利申请公开号2003/0055615(Zhang和Zhang，“Systems and methods for processing biological expression data”)中描述了。
分类模型可以在任何合适的数字计算机上形成并在其上使用。合适的数字计算机包括使用任何标准或专用操作系统(例如，基于Unix、
Figure BDA0002680645610000611
或LinuxTM的操作系统)的微型、小型或大型计算机。在利用质谱仪的实施方案中，所使用的数字计算机可以与用于产生感兴趣谱的质谱仪物理上分开，或者可以与质谱仪连接。
根据本发明实施方案的训练数据组和分类模型可以由数字计算机执行或使用的计算机代码来体现。可以将计算机代码存储在任何适当的计算机可读介质上，包括光盘或磁盘、棒、磁带等，并且可以用任何适当的计算机编程语言来编写，包括R、C、C++、visualbasic等。
上述学习算法对于开发用于已经发现的生物标志物的分类算法、以及发现新的生物标志物的分类算法都是有用的。反过来，分类算法通过提供单独使用或组合使用的生物标志物的诊断值(例如，截止点)，又形成了诊断测试的基础。
在一些实施方案中，本文公开的任何分类方法可以至少部分地由一个或多个计算机执行和/或可以被存储在非暂时性计算机介质上的数据库中。在一些实施方案中，本文公开的任何分类方法可以至少部分地体现在或存储在计算机可读介质上，在该计算机可读介质上具有计算机可执行的指令。在一些实施方案中，计算机可读介质包括任何非暂时性和/或有形计算机可读介质。
5.抗体和细胞系
本发明公开了使用特异性结合这些生物标志物的抗原结合分子，定位、检测和定量PTM生物标志物，特别是PD-L1-K263Ac和PD-L1-K263Me。这样的抗原结合分子通常是分离的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子，仅当K263被乙酰化或甲基化时，这些位点特异性抗原结合分子才分别特异性结合PD-L1。可以使用本文提供的乙酰化和甲基化位点序列信息，通过标准抗体产生方法，例如抗肽抗体方法，来产生此类抗原结合分子，例如，如实施例中所述。例如，可以通过用肽抗原免疫动物来产生特异性结合PD-L1-K263Ac或PD-L1-K263Me的抗体，所述肽抗原包含全部或部分包含相应的乙酰化或甲基化残基的氨基酸序列(例如，包含如SEQ ID NO：3或4所示的序列(其在PD-L1第263位包含乙酰化或甲基化的赖氨酸(适当地，三甲基赖氨酸)的肽抗原)，以产生仅在该位点被乙酰化或甲基化时，才结合PD-L1的抗体。
可以根据标准技术通过以下产生本发明的多克隆抗体：用对应于感兴趣蛋白的乙酰化或甲基化位点的肽抗原免疫合适的动物(例如，兔、山羊等)、从动物中收集免疫血清、和按照标准程序从免疫血清中分离多克隆抗体。如果期望仅当263K被乙酰化或甲基化时才结合PD-L1的抗体，则肽抗原包括赖氨酸的乙酰化或甲基化形式(例如，分别为K(Ac)或K(Me3))。相反，如果期望仅当263K没有被乙酰化或甲基化时才结合PD-L1的抗体，则肽抗原包括赖氨酸的非乙酰化形式或非甲基化的常规形式。
可以根据熟知的技术设计、构建和使用适合于产生本发明的抗体的肽抗原。参见，例如，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，第5章，第75-76页，Harlow&Lane Eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)；Czernik，Methods In Enzymology，201：264-283(1991)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：21-49(1962))。
本领域技术人员将理解，可以采用更长或更短的乙酰基肽或甲基肽抗原。例如，肽抗原可包含SEQ ID NO：3或4所示的氨基酸序列，或可包含位于该序列两侧的另外的氨基酸，或可仅包含所公开的紧接可乙酰化或可甲基化的赖氨酸的序列的一部分。通常，期望的肽抗原将包含四个或更多个氨基酸，其侧接可乙酰化或可甲基化氨基酸的每一侧并包括所述可乙酰化或可甲基化氨基酸。如本文所述产生的多克隆抗体可以如下进一步筛选。
根据众所周知的Kohler和Milstein的技术，可以在杂交瘤细胞系中产生本发明的单克隆抗体。参见Nature 265：495-97(1975)；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；还参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等人编辑(1989)。如此产生的单克隆抗体是高度特异性的，并且提高了本发明提供的诊断测定方法的选择性和特异性。例如，可以将含有适当抗原的溶液注射到小鼠或其他物种中，并在足够的时间后(与常规技术保持一致)，处死动物并获得脾细胞。然后通常在聚乙二醇存在下，使脾细胞与骨髓瘤细胞融合来使脾细胞永生化，以产生杂交瘤细胞。例如，兔融合杂交瘤可以如美国专利号5,675,063，C.Knight发行于1997年10月7日中所述产生。然后使杂交瘤细胞在合适的选择介质(如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT))中生长，并如下所述筛选上清液中具有期望特异性的单克隆抗体。可以通过常规方法(例如沉淀、离子交换或亲和色谱法等)从组织培养上清液中回收分泌的抗体。
也可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中产生单克隆Fab片段。参见，例如，W.Huse，Science 246：1275-81(1989)；Mullinax等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.87：8095(1990)。如果对于特定应用，优选一种同种型的单克隆抗体，则可以通过从最初融合体中选择来直接制备特定的同种型，或者通过从分泌不同同种型单克隆抗体的亲本杂交瘤中进行二次制备，使用sib选择技术分离类别转换的变体(Steplewski等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.，82：8653(1985)；Spira等人，J.Immunol.Methods，74：307(1984))。
本发明的乙酰化位点特异性抗体或甲基化位点特异性抗体的优选表位是基本上由约8至17个氨基酸组成的肽片段，其包括可乙酰化或可甲基化的赖氨酸，其中约3至8个氨基酸位于可乙酰化赖氨酸的每一侧，因此，本发明的抗体特异性结合包含此类表位序列的翻译后修饰的PD-L1多肽。与本发明的抗体结合的特别优选的表位包含全部或部分可乙酰化或可甲基化的位点序列，包括可乙酰化或可甲基化的氨基酸。
等同的非抗体分子(例如抗原结合片段)包括在本发明的范围内，它们以乙酰基或甲基特异性的方式，结合与本发明乙酰基或甲基特异性抗原结合分子所结合的可乙酰化或可甲基化的表位基本上相同的表位。参见，例如，Neuberger等人，Nature 312：604(1984)。这样的等同非抗体试剂可以适当地用于下文进一步描述的本发明的方法中。
本发明考虑的抗原结合分子可以是任何类型的包括免疫球蛋白的抗体，其包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE及其抗原结合片段。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以是任何物种起源，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人，或者可以是嵌合抗体。参见，例如，M.Walker等人，Molec.Immunol.26：403-11(1989)；Morrision等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.81：6851(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604(1984))。抗体可以是根据美国专利号4,474,893(Reading)或美国专利号4,816,567(Cabilly等人)所述的方法生产的重组单克隆抗体。抗体也可以是由根据美国专利号4,676,980(Segel等人)公开的方法制备的特异性抗体化学构建的。
本发明还提供了产生本发明抗体的永生细胞系。例如，还提供了如上所述构建的杂交瘤克隆，其产生针对本文公开的PD-L1乙酰化或甲基化位点的单克隆抗体的。类似地，本发明包括产生本发明抗体的重组细胞，该细胞可以通过众所周知的技术构建；例如，单克隆抗体的抗原组合位点可以通过PCR克隆，并且单链抗体可以作为噬菌体展示的重组抗体产生、或作为在大肠杆菌中的可溶性抗体产生(参见，例如，ANTIBODY ENGINEERINGPROTOCOLS，1995，Humana Press，Sudhir Paul编辑)。
可以根据标准技术筛选本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗体(无论是多克隆，还是单克隆抗体)的表位和乙酰基或甲基特异性。参见，例如Czemik等人，Methods inEnzymology，201：264-283(1991)。例如，可以通过ELISA筛选针对乙酰基和非乙酰基肽文库的抗体，以确保对期望抗原的特异性以及仅对抗原的乙酰化或甲基化(或非乙酰化、非甲基化)形式的反应性。可以进行肽竞争测定法，以确认与给定蛋白乙酰化信号传导蛋白上的其他乙酰基表位没有反应性。还可以通过对包含信号传导蛋白的细胞制备物(例如过表达靶标蛋白的细胞系)进行蛋白印迹来测试抗体，以确认与期望乙酰化表位/靶标的反应性。
还可以通过构建在期望表位以外的位置上(已知这些位置是被乙酰化的)缺乏可乙酰化或可甲基化残基的突变体、或通过突变期望的乙酰基或甲基表位并确认反应性的缺乏，来检查针对期望的乙酰化或甲基化表位的特异性。本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子可以表现出与非靶标蛋白中相关表位的有限的交叉反应性。这并不意外，因为大多数抗原结合分子表现出一定程度的交叉反应性，并且抗肽抗体通常会与与免疫肽具有高度同源性的表位发生交叉反应。参见，例如Czemik同上。与非靶标蛋白的交叉反应性易于通过蛋白印迹与已知分子量的标志物进行表征。可以检查交叉反应蛋白的氨基酸序列，以鉴定与PD-L1-263K高度同源的位点，本发明的抗原结合分子对所述PD-L1-263K具有特异性。
在某些情况下，多克隆抗血清可能表现出与乙酰基赖氨酸或甲基赖氨酸(合适地，三甲基赖氨酸)本身一些不期望的一般交叉反应性，这可以通过进一步纯化抗血清(例如在乙酰酪胺或甲基酪胺柱上纯化)而除去。本发明的抗原结合分子仅在263K被乙酰化时或仅在263K被甲基化时(或视情况而定，仅在未被乙酰化和未被甲基化时)特异性结合PD-L1，并且(基本上)不结合另一种形式(与抗原结合分子特异的形式相比)。
可以使用正常和患病细胞或组织、通过IHC染色进一步表征抗原结合分子，以检查PD-L1的乙酰化或甲基化以及患病细胞或组织对疗法的反应。可以根据公知技术进行IHC。参见，例如ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL第10章，Harlow&Lane Eds.，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)。简而言之，通过以下步骤制备石蜡包埋的组织(例如肿瘤组织)用于免疫组织化学染色：用二甲苯随后用乙醇对组织切片进行脱石蜡；在水中然后在PBS中水合；通过在柠檬酸钠缓冲液中加热玻片来暴露抗原；在过氧化氢中孵育切片；在阻断溶液中的阻断；在一抗和二抗中孵育玻片；最后根据制造商的说明使用ABC亲和素/生物素方法进行检测。
可以通过根据标准方法进行的流式细胞术进一步表征抗原结合分子。参见Chow等人，Cytometry(Communications in Clinical Cytometry)46：7205-238(2001)。简要地并且举例来说，可以采用以下用于细胞计数分析的方案：可以在Ficoll梯度上离心样本以去除红细胞，然后可以在37℃下用2％多聚甲醛将细胞固定10分钟，接着在冰上在90％甲醇中透化30分钟。然后可以用本发明的第一乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子(分别检测PD-L1-K263Ac或PD-L1-K263Me)染色细胞，洗涤并用荧光标记的二抗标记。此时还可以添加其他与荧光染料缀合的生物标志物抗体(例如CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，以帮助鉴定细胞的间充质和/或干性状态。然后可以根据所用仪器的特定方案在流式细胞仪(例如，Beckman Coulter FC500)上分析细胞。
抗原结合分子可以有利地与荧光染料(例如Alexa Fluor 488)缀合，与抗间充质和/或干性生物标志物抗体一起用于多参数分析。
仅当在公开的位点(263K)处被乙酰化或甲基化时，本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子才特异性结合人PD-L1多肽，而且不仅限于结合人物种本身。本发明包括的抗原结合分子，除了结合人的乙酰化或甲基化位点以外，还结合来自其他物种(例如，小鼠、大鼠、猴子、酵母)的相应PTM PD-L1蛋白的保守且高度同源或相同的乙酰化或甲基化位点。通过与本文公开的人PD-L1乙酰化和甲基化位点进行的标准序列比较(例如，使用BLAST)，可以容易地鉴定在其他物种中保守的高度同源或相同的位点。
6.试剂盒
在本发明还涉及用于确定生物标志物(包括本公开的对疗法有反应的以及任选地间充质和/或干性生物标志物)的表达的试剂盒，所述试剂盒包含允许对生物标志物检测和/或定量的试剂。这些试剂包括，例如允许对生物标志物定量的化合物或材料、或者化合物或材料的组。在具体的实施方案中，化合物、材料、或者化合物或材料的组使得可以确定基因(例如，间充质和/或干性生物标志物基因)的表达水平，包括但不限于RNA物质提取、对应RNA的水平的确定等，用于合成对应cDNA的引物、用于扩增DNA的引物、和/或能够与基因编码的RNA(或对应的cDNA)特异性杂交的探针、TaqMan探针、邻近测定法探针、连接酶、抗体等。
试剂盒还可任选地包含用于检测标志物的适当试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲剂等。例如，基于核酸的检测试剂盒可以包含(i)间充质和/或干性生物标志物多核苷酸(其可以用作阳性对照)，(ii)引物或探针，其与间充质和/或干性生物标志物多核苷酸特异性杂交。还可以包含适于扩增核酸的酶、脱氧核苷酸和缓冲液，以提供用于扩增的必要的反应混合物，所述扩增核酸的酶包括多种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTM、DNA连接酶等，取决于采用的核酸扩增技术)。此类试剂盒通常还将以合适的方式包含用于各单独的试剂和酶以及用于各引物或探针的不同的容器。或者，基于蛋白的检测试剂盒可以包含(i)至少一种PD-L1多肽，其适当地选自PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me、包含K263Ac的PD-L1-K263Ac的片段或包含K263Me的PD-L1-K263Me的片段、和没有被乙酰化或甲基化的PD-L1多肽(其可以用作阳性对照)，(ii)一种或多种特异性结合PD-L1多肽的抗原结合分子，所述PD-L1多肽适当地选自PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me、和没有被乙酰化或甲基化的PD-L1多肽(iii)至少一种间充质和/或干性生物标志物多肽，其选自CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5，或其片段，和/或(iv)一种或多种特异性结合间充质和/或干性生物标志物多肽的抗原结合分子，所述间充质和/或干性生物标志物选自CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5。抗原结合分子适当地是可检测标记的。试剂盒的特征还在于多种装置(例如，一个或多个)和试剂(例如，一种或多种)，用于进行本文所述测定法中的一种；和/或用于使用试剂盒定量T细胞功能生物标志物基因的表达的印刷的说明材料。本文所述试剂(任选地可与可检测标记相关)可以以以下的形式呈现：微流体卡、芯片或室、微阵列或试剂盒，以适用于实施例或下文中描述的测定法(例如，本文描述的RT-PCR或Q PCR技术)。
适于包装诊断试剂盒的组分的材料可包括晶体、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶、小瓶、纸、包封层(envelope)等。另外，本发明的试剂盒可以包含用于同时、相继或分开使用包含在试剂盒中的不同组分的说明材料。说明材料可以呈印刷材料的形式或呈能够储存说明使得它们能够被受试者阅读的电子承载物形式，诸如电子储存介质(磁盘、磁带等)、光学介质(CD-ROM、DVD)等。可选地或另外，介质可以包含提供说明材料的因特网地址。
7.患者分类和治疗管理
本发明涉及选择或鉴定适合作为用治疗癌症的疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)治疗的候选者的个体的方法。这样的个体包括被预测对疗法有反应的患者，因此相对于具有不同特征(例如，对疗法无反应性)的其他患者，这样的个体从疗法的施用中受益的可能性增加。在某些实施方案中，合适的候选者是合理地可能从治疗受益或至少充分可能受益的个体，考虑到其风险和副作用，以证明施用治疗的合理性。本发明还包括选择或鉴定不适合作为用治疗癌症的疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)治疗的候选者的个体的方法。这样的个体包括预测对疗法无反应或弱反应的患者，因此相对于具有不同特征(例如，对疗法具有反应性)的其他患者，这样的个体从疗法的施用中受益的可能性降低，或从这种治疗受益的可能性很小或几乎没有，因此可能希望使用不同的治疗或额外的治疗。在一些实施方案中，基于以下测定确定受试者是否是适合用疗法进行治疗的合适的候选者：测定受试者中或从受试者获得的样本中至少一种对疗法有反应的生物标志物以及任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物。
在一些方面中，本文描述了确定需要针对癌症治疗的受试者将对疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)治疗反应的可能性、和/或鉴定和/或选择接受这样的治疗的受试者的方法，例如基于测定至少一种对疗法有反应的生物标志物以及任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物。在特定的实施方案中，所述疗法是免疫疗法，适当地是使用抗免疫检查点抑制剂的免疫疗法。短语“用免疫检查点抑制剂治疗”，也称为“免疫检查点抑制剂治疗”、“用免疫检查点抑制剂的疗法”或“免疫检查点抑制剂疗法”，其涵盖涉及用单一免疫检查点抑制剂治疗的实施方案、以及涉及用两种或更多种免疫检查点抑制剂组合治疗的实施方案。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂治疗包括使用单一试剂或使用两种或更多种分开的试剂抑制两个或更多个不同的免疫检查点通路。
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施方案。
实施例
实施例1
核PD-L1与关键的活性组蛋白标记的定位
本发明人使用市售的PD-L1抗体，确定了核PD-L1普遍存在于从转移性结直肠癌、转移性前列腺癌和转移性乳腺癌患者样本中分离的间充质CTC中，以及普遍存在于药物耐受性癌细胞(即，化疗和免疫疗法药物)和几种乳腺癌细胞系中，如图1A，图1B所示。他们还研究了核PD-L1是否与染色质相关，并发现其与活性标记H3k27ac和H3k4me3强共定位，但没有抑制标记H3k9me3(图1C)。
接下来，本发明人研究了翻译后修饰(PTM)是否在将PD-L1定位于细胞核(在本文中也称为核PD-L1)中发挥作用，特别是检查了PD-L1的乙酰化/甲基化基序。该分析表明在残基赖氨酸-263(K263)上存在显著的高分乙酰化/甲基化基序，该残基赖氨酸-263包含规范的核定位序列(NLS)。
基于此分析，设计了用于表达具有NLS区的野生型(WT)版本以及NLS的两种突变形式的LSD1的各个质粒：Mutl包含乙酰化模拟物，其中谷氨酰胺取代了赖氨酸(K263Q)；Mut2包含不能被乙酰化或甲基化的残基，其中精氨酸取代了赖氨酸(K263R)。令人感兴趣的是，表达Mut1的质粒比表达WT PD-L1的质粒偏向于将PD-L1定位在细胞核上(图2A)。
实施例2
核PD-L1驱动间充质、干性标志物的表达
将表达WT-PD-L1的质粒和表达Mutl-PDL1的质粒转染到MCF7乳腺癌细胞系中，增加了药物耐受性、干性、间充质和侵袭性癌症标识，并将上皮细胞系推向更基础的三阴性表型(MDA-MB-231)，其中增殖降低(图2B)。药物耐受性癌干细胞具有降低的、几乎休眠的细胞周期，这存在于多种耐受性癌症类型中(Ebinger等人，2016，Cancer Cell 30，849–862)。这证明了PD-L1在调节干性、间充质肿瘤细胞中休眠的、对疗法耐受性的表型中的重要性。
由于间充质标志物(例如CSV、EGFR、SNAIL和ABCB5)表达的增加是间充质、药物耐受性、干性样标识的标志(Wang等人，2016，Genes&Diseases(2016)3，3e6；van der Toom等人，2016，Oncotarget.7(38)：62754–62766)，在发明人的PD-L1质粒转染模型中检查了这些标志物的表达。这项研究表明，Mut1构建体的表达限制PD-L1定位在细胞核中，显著提高了CSV、CD133、EGFR和SNAIL中各自的表达(图3A，图3B)。还发现核PD-L1的表达增加了表观遗传酶(例如甲基转移酶SETDB1、EHTM2和DNMT1)的表达(图4A和图4B)。考虑到核PD-L1对SETDB1和DNMT1表达的影响，决定检查通常对SETDB1、组蛋白PTM H3k9me3和DNA甲基化(5-mC)酶读取(read out)的影响。令人惊讶地，发现在MCF7细胞系中，核PD-L1对H3k9me3表达具有最小的影响或者没有影响，表明蛋白-蛋白相互作用针对SETDB1。相比之下，5-mC和耐受性标志物ABCB5均显著增加，表明核PDL1可以调节侵袭性癌症中的这些表观遗传酶，因此在DNA甲基化中起作用(图5)。
实施例3
抗PD-LI抗体靶向关键的赖氨酸-NLS基质
接下来设计了定制的抗体，其针对包含未修饰的、三甲基化的(me3)或乙酰化形式的K263的NLS基序，用于测试乙酰化和甲基化的核靶向作用。图6描述了ELISA亲和结合测定法，显示了对相应的抗体靶标，即，未修饰的(图6A)、乙酰化的(图6B)或甲基化的K263(图6C)具有特异性的定制抗体。
这项研究表明，在MDA-MB-231细胞中，在263K处乙酰化的PD-L1保留并限制在细胞核中，而在263k处甲基化的PD-L1限制在细胞质/细胞表面(图7A)。发明人还检查了未被透化的黑色素瘤样本和转移性乳腺癌(MBC)样本中乙酰化靶向抗体和me3靶向抗体的表达。他们发现，PD-L1-K263me3抗体能够成功地标记细胞的细胞质，然而PD-L1-K263Ac抗体却不能，这指示这种PD-L1的PTM的核优先性(图7B)。
还证实了这些抗体对WT和Mut1质粒构建体的特异性，如图8所示。
实施例4
PD-L1 K263Ac在更高的疾病负担中增加
使用一组对药物耐受性、干性(DRS)标识具有特异性的抗体(即，抗CD133、抗PDL1-K263Ac和抗ABCB5)来研究其是否可用于将不同的黑色素瘤患者分层，所述分层根据其是否对疗法有完全反应(CR)或部分反应(PR)，以及其是否患有稳定的疾病(SD)或进行性疾病(PR)。这项研究表明，核PDL1-K263Ac表达的增加与增加的疾病负担相关，并且PD群显示PD-L1-K263Ac的最高表达(图9A)。
发明人还详细检查了两名患者，并确定DRS标识还可预测对药物的反应性或耐受性的难治性疾病(图9B)。值得注意的是，结果还表明，CTC中PD-L1-K263Ac的低水平表达与反应的表型相关，但是PD-L1-K263Ac的高水平表达与耐受性CTC表型强烈相关(图10)。
此外，发现与反应者CTC样本相比，耐受性CTC样本中PD-L1-K263Me3的表达显著降低(图11A)。
DRS标识抗体组还用于探索晚期结直肠癌和肺癌患者的CTC样本，并且发现在两种情况下，PD-L1-K263Ac的表达都很高(图11B)。
实施例5
药物耐受性MBC细胞系中PD-L1 K263Ac的表达增加
用DRS标识抗体组探测了三种药物耐受性乳腺癌细胞系和用靶向P-糖蛋白泵机制的药物处理的未经处理(naive)对照，发现PD-L1-K263Ac在这药物耐受性细胞系中和P-糖蛋白泵机制处理的细胞中均上调。这些结果表明，PD-L1在药物逃逸中起作用(图12A)。使用相同的抗体组，在IV期MBC患者来源的CTC中也发现了DRS标识的显著表达(图12B)。
实施例6
PD-L1 K263Ac与疾病负担增加的P300共定位
由于蛋白乙酰化PTM在控制蛋白核定位和相互作用中的重要性，因此还研究了P300和PD-L1-K263Ac之间的相互作用，并在药物耐受性样本中发现了这些蛋白之间的强的相关性(图13)。还在MBC药物耐受性系中测试了P300和PD-L1-K263Ac之间的相互作用，发现P300与PD-L1-K263Ac强烈共定位，并在药物耐受性系中高表达(图14)。为了进一步检查P300的重要性，用DRS标识抗体组探测了用P300抑制剂处理的MDA-MB-231细胞，发现随着P300抑制剂浓度的增加，PD-L1-K263Ac下降而PD-L1-K263Me3上升(图15)。
实施例7
核PD-L1促进侵袭性、药物耐受性、间充质转录组标识
将实施例1中所述的质粒构建体转染到上皮乳腺癌细胞系(MCF7)中，以检查PD-L1的细胞核和表观遗传学作用。这项研究表明，WT-PD-L1构建体显示了细胞质和细胞核作用，而Mutl-PD-L1构建体仅显示了细胞核的作用。通过使用Pan Cancer免疫芯片对转录组进行Nanostring分析，检查了这些差异，该Pan Cancer免疫芯片分析与免疫系统和癌症相关的700个基因，以鉴定哪些转录本分别被突变体和WT构建体显著上调。图16显示了被核PD-L1表达显著上调的基因。
接下来，使用对由CSV、NODAL或CSV和CCL5组成的间充质、免疫疗法耐受性标识具有特异性的抗体组，筛选从黑色素瘤血液中分离的CTC，所述黑色素瘤血液来自根据RECIST1.1的免疫疗法反应者或耐受性群。值得注意的是，PD-L1的过表达高度上调NODAL和CCL5二者，图17中显示的结果表明，这些蛋白在免疫疗法耐受性患者的群中也显著上调。CSV作为CTC的标志物也包括在内。这表明PD-L1构建体的转录组作用与免疫疗法耐受性黑色素瘤患者衍生的CTC中存在的机制之间存在很强的相关性。
提出的核PD-L1模型的机制
不希望受任何特定理论或操作方式的束缚，本发明人提出PD-L1与癌细胞的细胞核中的染色质结合，并形成转录的抑制性复合物和活化转录的复合物。这通过实施例7中讨论的Nanostring分析得到支持，该分析显示了间充质、干性、耐受性蛋白的上调和抗肿瘤基因的下调(参见图18)。
实施例8
高通量显微镜揭示PD-L1 K263-Ac阳性CTC在较高疾病负担患者群中的黑色素瘤中显著增加
使用ASI mIF数字病理系统(Applied Spectral Imaging 5315，AvenidaEncinas，Suite 150 Carlsbad，CA 92008，USA)，本发明人用PDL1-Ac测试了黑色素瘤患者样本中其关键的化学耐受性、干性标识。值得注意的是，他们发现这些生物标志物的表达随疾病负担的增加而增加(图19A)，PD群具有最高的PD-L1-K263Ac表达以及最高的干性样标志物CD133和化学耐受性干性样标志物ABCB5的表达(图19B)。发现CR群中全部CTC中约2％表达PD-L1-K263Ac+/CD133+/ABCB5+。对于PR而言，这增加到约5％，对于SD则增加到19％，但是增加并不显著。令人惊讶的是，揭示疾病负担最高的PD患者中CTC群％增加至约96％，明显高于所有其他群。因此，PD-L1-K263Ac+/CD133+/ABCB5群％揭示增加的和进行性疾病，还可以根据总的CTC群数量显示患者是否对所采用的特定疗法有反应或有耐受性。
材料和方法
循环肿瘤细胞的分离
使用RosetteSepTM方法预先富集转移性黑色素瘤活检样本，以分离CTC，通过使用RosetteSepTM人CD45耗竭试剂盒(15162，Stemcell Technologies)去除CD45+细胞，使用SepMateTM-15(IVD)密度梯度管(85420，Stemcell Technologies)和LymphoprepTM密度梯度介质(07861，Stemcell Technologies)进行密度梯度离心去除红细胞。然后将富集的细胞离心涂片(cytospun)到用聚-1-赖氨酸预处理的盖玻片上并固定，然后保存在PBS中用于染色。
免疫荧光显微镜
通过与1％Triton X-100孵育20分钟，使用于显微镜检查的细胞进行透化。用多种抗体探测细胞，包括：
兔或山羊抗PDL1、小鼠抗H3K27ac、H3k4me3或H3k9me3。小鼠抗CSV、兔抗EGFR、山羊抗SNAIL、兔EHTM2、小鼠抗DMNTI、山羊抗SETDB1。我们的定制兔宿主PDL1-263k-Ac、PDL1-263k-me3或PDL1-263k。小鼠抗5-mC、小鼠抗CD133、山羊抗ABCB5或小鼠抗P300。以及巨噬细胞标志物山羊抗F4/80或小鼠抗CD38或CD206。侵袭性、转移性标识的标志物还包括山羊抗Nodal和山羊抗CCL5。一抗通过与Alexa Fluor 488缀合的驴抗兔二抗、抗小鼠二抗568或抗山羊二抗647可视化。用ProLong Diamond Antifade试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白靶标进行定位。使用LeicaDMI8显微镜(使用100x油浸透镜、运行LAX软件)获得单个0.5μm切片。通过同一切片的四个连续图像取平均，而获得最终图像。使用ImageJ软件(ImageJ，NIH，Bethesda，MD，USA)分析数字图像，以确定总细胞核荧光强度(TNFI)、总细胞质荧光强度(TCFI)。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，GraphPad Software，San Diego，CA)来确定数据组之间的显著差异。
共定位
使用具有自动阈值的ImageJ软件，并手动选择细胞核特定的感兴趣区域(ROI)来计算每对抗体的皮尔逊系数相关性(PCC)。PCC值的范围从：-1＝共定位的倒数，0＝无共定位，+1＝完美共定位。对于每个样本组，还测量了最少n＝20个细胞中的总细胞核荧光强度。使用ImageJ软件分析细胞核强度，并通过软件减去背景来计算每个细胞的核和总细胞核荧光。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，GraphPad Software，San Diego，CA)确定数据组之间的显著差异。
细胞培养
使用的所有乳腺癌细胞系均来自ATCC，但多西他赛耐受性系除外，多西他赛耐受性系来自Sikic博士(斯坦福大学)的馈赠。在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％PSN的DMEM(Invitrogen)中维持和培养细胞系。用1.29ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich)或5ng/ml重组TGF-β1(R&D Systems)刺激MCF-7细胞60小时38。
生成PD-L1-WT、PD-L1-K263Ac和PD-L1-K263Me3抗体
生成了针对肽2803201、2803204和2803213的抗体(表1)。由于短肽通常本身不具有免疫原性，因此经常有必要将其与免疫原性载体蛋白偶联。为了促进这种偶联，在肽的C-末端掺入半胱氨酸并反应以将肽缀合至免疫原性载体蛋白锁孔戚血蓝蛋白(KeyholeLimpet Hemocyanin，KLH)。不需要特殊的免疫方案即可产生抗三甲基化或抗乙酰化肽的抗体。对于每个肽序列，间隔数周免疫两只兔子。第一次免疫使用肽缀合物与完全弗氏佐剂的乳剂进行，第二次免疫使用不完全弗氏佐剂。数周后可获得有效的抗肽血清(参见，Palfreyman等人(1984)J Immunol Meth，75：383)。
表1：用于抗体产生的肽序列
肽 序列 分子量(Da)
2803201 FRLRKGRMMDVKKC-OH[SEQ ID NO：2] 1768.25
2803204 FRLRK(Ac)GRMMDVKKC-OH[SEQ ID NO：3] 1810.29
2803213 FRLRK(Me<sub>3</sub>)GRMMDVKKC-OH[SEQ ID NO：4] 1811.34
使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行三甲基化和乙酰化的肽抗血清测试，其中血清在包被有非三甲基化肽和三甲基化肽、或非乙酰化和乙酰化肽的微量滴定板上滴定。
按照制造商的说明，通过可用的半胱氨酸残基，将用于免疫的肽的非三甲基化、非乙酰化的类似物偶联至凝胶Sulfo Link Coupling Resin(Thermo Scientific，目录号20401)上，进行抗体增强。将所得的凝胶与抗血清的等分试样孵育以吸附对非三甲基化、非乙酰化的肽具有特异性的抗体。所得的抗血清将对三甲基化的肽或乙酰化的肽序列具有增强的特异性。
为了产生仅对三甲基化或乙酰化的肽具有特异性的亲和力纯化抗体，必须首先进行增强步骤以从血清中去除对非三甲基化和非乙酰化的肽具有特异性的抗体。再次针对(back onto)包被在平板上的非三甲基化和三甲基化的肽，或者非乙酰化和乙酰化的肽，通过ELISA测试亲和力纯化的抗体的特异性。生成的抗体对残基263处三甲基化的PD-L1和乙酰化的PD-L1显示出高的特异性。
4T1小鼠模型
将50μL PBS中的总共2x105个细胞注射到每只小鼠的乳腺中。接种4T1细胞15天后，开始对小鼠进行治疗。治疗组如下：A-对照，B-30mg/kg白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)。使用卡尺测量肿瘤，并且使用公式(长x宽2)计算肿瘤体积(mm3)。使用外部卡尺测量肿瘤，并使用修正的椭圆公式：1/2(a/b2)计算，其中a＝最长直径，b＝最小直径。允许肿瘤生长到约50mm3，然后开始治疗(约15天)。所有治疗均通过IP注射白蛋白结合型紫杉醇(30mg/kg)进行。切除肿瘤并收集在补充有2.5％FCS的DMEM中。然后使用手术刀将肿瘤切碎，并在DMEM 2.5％FCS和4型胶原酶(Worthington-Biochem)(1mg胶原酶/1g肿瘤)中于37℃孵育1小时。将消化的肿瘤旋转离心并重悬于DMEM 2.5％FCS中，然后使其通过0.2μM过滤器并用于荧光显微镜检查。
ASI系统方法(高通量、高分辨率显微镜)
ASI的mIF系统是用于多重免疫荧光样本的通用扫描和分析系统。它被设计用来扫描用DAPI和最多6种抗体染色剂染色的载玻片、去除自动荧光、解决滤光片之间的分离问题、并对获得的数据进行基于细胞的分析。接触细胞会自动分割，会定量测量信号表达，并显示每个细胞以及整个扫描区域的结果。支持各种自动和半自动扫描模式，包括：
1.用于悬浮液样本的基于密度的有效扫描–基于细胞群扫描样本，进行最快的细胞评分；
2.扫描选择性区域/区；和
3.交互式扫描感兴趣的特定位置。
在所有模式下，都可以在数分钟内获得具有抗体共定位的成千上万个细胞的综合统计数据。3D堆叠、自动曝光、自动聚焦和其他成像参数是每次扫描的固有部分。图像用于确定平均细胞核荧光强度(NFI)或总荧光强度(FI)。使用自动化平台和用于自动选择细胞并测量荧光强度的ASI软件，在定义的区域内对细胞总数进行计数。然后将所得数据用于计算CTC群动态，以占总细胞群的％表示。
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Claims (87)

1.一种用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中的PD-L1的核定位序列的翻译后修饰，从而确定PD-L1所在的癌细胞的细胞区室。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263的乙酰化(在本文中也称为“PD-L1-K263Ac”)，并确定细胞区室是细胞核。
3.根据权利要求2所述的方法，其包括检测到相对于合适的对照(例如，正常细胞或上皮癌细胞)，癌细胞中的PD-L1-K263Ac的水平升高，这指示所述细胞区室是细胞核。
4.根据权利要求1所述的方法，其包括检测癌细胞中PD-L1-K263的甲基化(在本文中也称为“PD-L1-K263Me”)，并确定细胞区室是细胞质和/或细胞膜。
5.根据权利要求4所述的方法，其包括检测到相对于合适的对照(例如，间充质癌细胞)，癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平升高，这指示所述细胞区室是细胞质和/或细胞膜。
6.一种用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1的核定位序列的翻译后修饰，从而预测癌细胞对疗法有反应的可能性。
7.根据权利要求6所述的方法，其包括检测癌细胞中PD-L1-K263的乙酰化(在本文中也称为“PD-L1-K263Ac”)，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
8.根据权利要求6所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263的甲基化(在本文中也称为“PD-L1-K263Me”)，从而确定癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
9.一种用于确定癌细胞对疗法(例如细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1-K263Ac的存在，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
10.根据权利要求9所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，正常细胞或上皮癌细胞)检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，这指示癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其包括使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而确定癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加。
12.一种用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：检测癌细胞中PD-L1-K263Me的存在，从而确定癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
13.根据权利要求12所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，间充质癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，这指示癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其包括使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而确定癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
15.一种用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有反应的可能性的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：测量癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平、测量癌细胞中PD-L1-K263Me的水平；比较癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平和PD-L1-K263Me的水平；和根据比较预测癌细胞对疗法的反应，其中癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平高于PD-L1-K263Me的水平，表明癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加，并且其中癌细胞中PD-L1-K263Me的水平高于PD-L1-K263Ac的水平，表明癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
16.根据权利要求15所述的方法，其包括：使包含癌细胞的样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平、以及包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较预测癌细胞对疗法有反应的可能性，其中样本中所述第一复合物的水平高于所述第二复合物的水平，表明癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加，并且其中样本中所述第二复合物的水平更高，表明癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加。
17.根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测对疗法的反应和/或疾病负担。
18.根据权利要求17所述的方法，其中至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
19.根据权利要求6至18中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示癌细胞可能对疗法无反应。
20.根据权利要求6至18中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示癌细胞可能对疗法无反应。
21.根据权利要求6至18中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示癌细胞可能对疗法有反应。
22.根据权利要求6至18中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中PD-L1-K263Me和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物合适地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测对疗法的反应和/或疾病负担。
23.根据权利要求22所述的方法，其中至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5；和(u)ABCB5。
24.根据权利要求6至23中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平不变，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示癌细胞可能对疗法无反应。
25.根据权利要求6至23中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示癌细胞可能对疗法有反应。
26.根据权利要求6至23中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，未暴露于疗法的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地检测到至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示癌细胞可能对疗法有反应。
27.一种将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或对疗法的无反应者的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而将患者分层为可能对疗法的反应者或对疗法的无反应者。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac，和将所述患者分层为可能对疗法的无反应者。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其包括使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的无反应者。
30.根据权利要求27所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和将所述患者分层为可能对疗法的反应者。
31.根据权利要求30所述的方法，其包括使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的反应者。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其包括：使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较将患者分层为可能的反应者或无反应者，其中当样本中第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则将患者分层为可能的无反应者，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则将患者分层为可能的反应者。
33.一种管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：根据患者是可能对疗法的反应者，选择用疗法治疗的癌症患者，或根据患者是可能对疗法的无反应者，选择不用疗法治疗的癌症患者，以及根据选择，用疗法治疗或不用疗法治疗患者，其中所述选择根据分层方法，所述分层方法包括从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而将所述患者分层为可能对疗法的反应者或对疗法的无反应者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述分层方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和将所述患者分层为可能对疗法的反应者。
35.根据权利要求34所述的方法，其包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测样本中包含抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的反应者。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述分层方法包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac，和将所述患者分层为可能对疗法的无反应者。
37.根据权利要求36所述的方法，其包括使样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测样本中包含抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而将患者分层为可能对疗法的无反应者。
38.根据权利要求33所述的方法，其包括：使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；以及根据比较将患者分层为可能的反应者或无反应者，其中当样本中第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则将患者分层为可能的无反应者，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则将患者分层为可能的反应者。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。
40.根据权利要求39所述的方法，其中至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5和(u)ABCB5。
41.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，表达PD-L1-K263Ac的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能不变。
42.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能增加。
43.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者可能对疗法有反应和/或患者的疾病负担可能降低。
44.根据权利要求27至38中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。
45.根据权利要求44所述的方法，其中至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5和(u)ABCB5。
46.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者可能对疗法有反应和/或患者的疾病负担可能降低。
47.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示患者可能对疗法无反应和/或患者的疾病负担可能增加。
48.一种用于预测用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：从患者采集的样本中检测包含PD-L1核定位序列的翻译后修饰的癌细胞，从而预测患者的治疗结果。
49.根据权利要求48所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和预测阴性治疗结果。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述阴性治疗结果是进行性疾病。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其包括使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的复合物，从而预测患者的阴性治疗结果。
52.根据权利要求48所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me，和预测阳性治疗结果。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述阳性治疗结果选自对疗法有部分或完全反应和稳定的疾病。
54.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其包括使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子接触，和检测所述样本中包含所述抗原结合分子和PD-L1-K263Me的复合物，从而预测患者的阳性治疗结果。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的方法，其包括：使所述样本与特异性结合PD-L1-K263Ac的第一抗原结合分子和特异性结合PD-L1-K263Me的第二抗原结合分子接触；测量样本中包含第一抗原结合分子和PD-L1-K263Ac的第一复合物的水平，和包含第二抗原结合分子和PD-L1-K263Me的第二复合物的水平；和根据比较预测患者的治疗结果，其中当所述样本中的第一复合物的水平高于第二复合物的水平，则预测治疗结果为阴性治疗结果，并且其中当第二复合物的水平高于第一复合物的水平，则预测治疗结果为阳性治疗结果。
56.根据权利要求48至54中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Ac和至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而预测患者的治疗结果。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5和(u)ABCB5。
58.根据权利要求48至57中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，表达PD-L1-K263Ac的患者癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平不变，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平不变或升高，这指示患者的治疗结果为阴性。
59.根据权利要求48至57中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，在暴露于疗法之前，患者的癌细胞)，检测到癌细胞中PD-L1-K263Ac的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者的治疗结果为阳性。
60.根据权利要求48至59中任一项所述的方法，其包括检测癌细胞中的PD-L1-K263Me和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物，所述生物标志物适当地与药物耐受性和/或疾病负担相关(例如，CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1和ABCB5)，从而监测患者对疗法的反应和/或疾病负担。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述至少一种间充质和/或干性生物标志物包括：(a)CD133；(b)CD133：ALDH1A；(c)CD133：ALDH1A：P300；(d)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1；(e)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(f)CD133：ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(g)ALDH1A；(h)ALDH1A：P300；(i)ALDH1A：P300：DNMT1；(j)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1；(k)ALDH1A：P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(l)P300；(m)P300：DNMT1；(n)P300：DNMT1：SETDB1；(o)P300：DNMT1：SETDB1：ABCB5；(p)DNMT1；(q)DNMT1：SETDB1；(r)DNMT1：SETDB1：ABCB5；(s)SETDB1；(t)SETDB1：ABCB5和(u)ABCB5。
62.根据权利要求48至57、60和61中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平升高，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平降低，这指示患者的治疗结果为阳性。
63.根据权利要求48至57、60和61中任一项所述的方法，其包括相对于合适的对照(例如，暴露于疗法之前的患者癌细胞)，检测到癌细胞中的PD-L1-K263Me的水平降低，和任选地至少一种间充质和/或干性生物标志物的水平升高，这指示患者的治疗结果为阴性。
64.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其包括根据预测的治疗结果来预测癌症患者的临床结果。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述临床结果选自肿瘤反应(TR)、总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无疾病生存期、到肿瘤复发的时间(TTR)、到肿瘤进展的时间(TTP)、相对风险(RR)、毒性或副作用。
66.一种特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子，其适用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核)中的位置，所述抗原结合分子用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗。
67.一种复合物，其包含PD-L1-K263Ac和特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子。
68.一种特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子，其适用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞质和/或细胞膜)中的位置，所述抗原结合分子用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗。
69.一种复合物，其包含PD-L1-K263Me和特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子。
70.一种试剂盒，其用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗，所述试剂盒包含特异性结合PD-L1-K263Ac的抗原结合分子和/或特异性结合PD-L1-K263Me的抗原结合分子。
71.根据权利要求70所述的试剂盒，进一步包含一个或多个对照，所述对照包括阳性和阴性对照。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其中所述阳性对照选自PD-L1-K263Ac多肽或PD-L1-K263Me多肽。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的试剂盒，其还包含用于执行权利要求1至65中任一项所述的方法的指导材料。
74.一种方法，其用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗、和/或用于预测通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(i)从癌症患者获得样本，其中所述样本包含癌细胞；(ii)使样本与特异性结合所述样本中的PD-L1的第一抗原结合分子和特异性结合所述样本中的PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子接触，其中所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)当与样本中的包含PD-L1和PD-L1-结合配偶体的复合物结合时，检测第一和第二结合的抗原结合分子，其中样本中检测到的复合物水平相对于在对照样本(例如，包含正常细胞或上皮癌细胞的样本)中检测到的复合物水平升高时，指示PD-L1的细胞区室是细胞核、癌细胞对疗法具有耐受性的可能性增加、癌症患者可能对疗法是无反应者、癌症患者选择不使用疗法治疗、和/或预测对患者的治疗结果可能是阴性治疗结果。
75.一种方法，其用于确定PD-L1在癌细胞的细胞区室中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗、和/或用于预测通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗癌症患者的治疗结果，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(i)从癌症患者获得样本，其中所述样本包含癌细胞；(ii)使样本与特异性结合所述样本中的PD-L1的第一抗原结合分子和特异性结合所述样本中的PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子接触，所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)当与样本中的包含PD-L1和PD-L1-结合配偶体的复合物结合时，检测第一和第二结合的抗原结合分子，其中样本中检测到的复合物水平相对于在对照样本(例如，包含正常细胞或上皮癌细胞的样本)中检测到的复合物水平不变或降低时，指示PD-L1的细胞区室是细胞质和/或细胞膜、癌细胞对疗法具有敏感性的可能性增加、癌症患者可能对疗法是反应者、选择癌症患者使用疗法治疗、和/或预测对患者的治疗结果可能是阳性治疗结果。
76.一种试剂盒，其用于检测PD-L1在癌细胞的细胞区室(例如，细胞核)中的位置、用于预测癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)反应的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有耐受性的可能性、用于确定癌细胞对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)具有敏感性的可能性、用于将癌症患者分层为可能对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的反应者或无反应者、和/或用于管理通过疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)对癌症患者的治疗，所述试剂盒包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗原结合分子，(ii)特异性结合PD-L1-结合配偶体的第二抗原结合分子，所述PD-L1-结合配偶体选自P300、DNMT1和SETDB1；和(iii)结合第一和第二抗原结合分子的第三抗原结合分子。
77.根据权利要求76所述的试剂盒，其中所述第三抗原结合分子包含可检测的标记。
78.一种复合物，其包含PD-L1和选自P300、DNMT1和SETDB1的PD-L1-结合配偶体、特异性结合复合物中PD-L1的第一抗原结合分子、与复合物中PD-L1-结合配偶体结合的第二抗原结合分子、和(iii)与复合物中第一和第二抗原结合分子中每一个结合的第三抗原结合分子。
79.根据权利要求78所述的复合物，其中所述PD-L1—PD-L1-结合配偶体复合物位于癌细胞中。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的复合物，其中所述第三抗原结合分子包含可检测的标记。
81.一种癌细胞，其包含复合物，所述复合物包含PD-L1和选自P300、DNMT1和SETDB1的PD-L1-结合配偶体、特异性结合复合物中PD-L1的第一抗原结合分子、与复合物中PD-L1-结合配偶体结合的第二抗原结合分子、和(iii)与复合物中第一和第二抗原结合分子中每一个结合的第三抗原结合分子。
82.根据权利要求81所述的癌细胞，其中所述第三抗原结合分子包含可检测的标记。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或癌细胞，其中所述疗法是免疫疗法。
84.根据权利要求83所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或癌细胞，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。
85.根据权利要求84所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或癌细胞，其中所述免疫检查点抑制剂是特异性结合免疫检查点分子的拮抗性抗原结合分子(例如抗体)。
86.根据权利要求85所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或癌细胞，其中所述拮抗性抗原结合分子(例如抗体)特异性结合选自PD-1和CTLA4的免疫检查点分子。
87.根据前述权利要求中任一项所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或癌细胞，其中所述疗法是细胞毒性疗法，合适地是采用化学治疗剂的细胞毒性疗法。
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