CN111936151A - 利用纳米颗粒银的用于神经保护的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

已发现银纳米颗粒的制剂在改善外伤性脊髓损伤的功能和行为恢复方面是有效。银纳米颗粒被提供在不可流动凝胶载体中，从不可流动凝胶载体中所述纳米颗粒以高效率释放，其被局部应用于脊髓损伤部位。发现本文所描述的银纳米颗粒制剂改变M1/M2巨噬细胞表型比率并在与精氨酸酶的组合中提供协同效应以促进被治疗的损伤部位的愈合过程，减少损伤后炎症。

Description

利用纳米颗粒银的用于神经保护的组合物和方法

本申请要求于2017年2月22日提交的美国临时申请号62/462,145的权益。这些和所有其他参考的外部材料通过引用以其整体并入本文。如果通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义被视为具有控制性。

技术领域

本发明的领域是神经学损伤的预防和/或治疗，特别是利用纳米颗粒金属。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

外伤性脊髓损伤(Traumatic Spinal Cord Injury)(TSCI)是可导致麻痹的严重状况，是显著地影响患病个人的生活质量的状况。接触机动车辆加速TSCI已成为全球流行病，其发病率为每年每百万人中约40至80人。目前，美国有大约250,000名活着的TSCI幸存者。在中国，约有78,000人遭受脊髓损伤，并且在香港约有400名患有严重的慢性脊髓损伤的人正在康复中心接受治疗。在实际层面上，TSCI在其他方面健康的年轻成人中发病率达到最高。因此，在一名患者的一生中累积的医疗费用可能约为二百万至五百万美元(取决于损伤的严重程度)的金额。

TSCI通常是交通事故、跌倒和运动损伤以及外科手术程序中的脊髓伤害(例如，脊柱畸形的矫正)的结果。脊柱受到的突然外伤产生压迫和伤害脊髓的初级损伤，断开大脑与身体之间的沟通通道，导致功能性问题如感觉丧失、神经病性疼痛、终生瘫痪进而甚至死亡。在初始机械性伤害中，身体对损伤做出应答伴随炎性反应，炎性反应通常导致继发性损伤。这样的炎性反应可能导致缺血、水肿、兴奋性中毒、缺氧、离子稳态的紊乱和细胞凋亡。该过程在损伤后数分钟内开始并在几个小时内进展，并且在最初出现不完全性脊髓综合症的患者的前8至12小时内由神经系统的恶化而显现。脊髓水肿最终将被中枢性出血性坏死所代替，这意味着不可逆的神经学损伤。

TSCI继发性损伤的日常管理依赖于糖皮质激素(甲泼尼龙)的给予，其是目前在临床试验中已经发现的改善TSCI患者中结果的唯一治疗选项(1-3)。本文中的所有出版物通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体和单独地被指出通过引用而并入的程度相同。如果并入的引用中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义适用，而该术语在引用中的定义不适用。尽管糖皮质激素的抗炎作用，许多临床医生已对高剂量糖皮质激素治疗的全身效应，特别是关于对感染的免疫应答以及中度至重度外伤性脑/多系统损伤的患者中的免疫应答，产生了关注。还认为糖皮质激素治疗可以干扰再生过程。利鲁唑，作为神经保护药物，目前正在用于减少脊髓伤害的研究中(4-6)。然而，只有药物在对脊髓的损伤前被给予才有用(4)。

已发现银纳米颗粒(即，平均直径小于1μm的银金属颗粒)在针对再生愈合过程——具体是在皮肤、肌腱和骨中——的各种体外和体内研究中，具有有益效果(11-13)。这样的研究表明，纳米颗粒形式的银的应用可以导致当这样的组织愈合时在它们中胶原沉积的改善，和机械性能的改善以及因此修复组织的功能性结果。

一些研究表明，银纳米颗粒的应用可以降低细胞因子TGF-β1和IL-6(其与瘢痕形成有关)的表达，同时增加IL-10和VEGF(其与基质沉积和血管化有关)的表达(14)。还注意到在某些组织(如腹膜和跟腱)中的抗炎作用，伴随嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润的减少，连同TNF-α的减少。同时GAG和各种蛋白聚糖的产生被增强。然而，这些作用背后的机制尚不清楚。

因此，仍然需要安全且有效的组合物和方法用于治疗外伤性脊髓损伤的继发性效应。

发明内容

本发明的主题提供了装置、系统和方法，其中银纳米颗粒(AgNPs)的制剂——银纳米颗粒可以以含有透明质酸的凝胶提供——在外伤之前、期间或之后被应用于中枢神经系统伤害(例如，由于事故和/或脊柱外科手术的并发症引起的外伤造成的脊髓损伤)的部位，以减少或预防炎症并有助于愈合和功能的恢复。发现这样的AgNPs至少部分地通过选择性杀伤M1表型细胞来更改M1和M2表型巨噬细胞之间的比率。

本发明构思的一个实施方式是治疗神经元组织(神经组织，neuronal tissue)的方法，其中银纳米颗粒制剂被应用于需要治疗的部位，如在对神经元组织的伤害之前、期间、和/或之后的损伤(如急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤的部位、和中风部位)。这样的治疗可以在对神经元组织的伤害之前提供神经保护，并且如果在损伤时或损伤后应用则改善恢复和/或愈合。使用的银纳米颗粒的平均直径小于约1μm(例如，约20nm至约500nm、约500nm至约1,000nm、或约5nm至约20nm)，并且可以在药学上可接受的载体例如生物聚合物，如透明质酸中提供。药学上可接受的载体可以是液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、或制品(器具，appliance)。在一些实施方式中，AgNPs制剂被全身应用。在其他实施方式中，AgNPs制剂被局部应用(例如在损伤部位处或附近)。这种应用可从神经损伤时起48至96小时内进行。AgNPs制剂可以与补充疗法或治疗性化合物例如皮质类固醇、细胞因子或抗体(例如细胞特异性或细胞因子特异性抗体)组合应用。

本发明构思的另一个实施方式是用于通过将银纳米颗粒制剂应用于需要保护免受炎症的部位，如对神经元组织的伤害后的神经元损伤(如急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤的部位、和中风部位)，调节M1/M2巨噬细胞平衡的方法。如果在对神经元组织的伤害之前使用，这样的方法可以提供神经保护。使用的银纳米颗粒的平均直径小于约1μm或约5nm至约20nm，并且可以在药学上可接受的载体——例如生物聚合物如透明质酸——中提供。药学上可接受的载体可以是液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂或制品。在一些实施方式中，AgNPs制剂被全身应用。在其他实施方式中，AgNPs制剂被局部应用(例如在损伤部位处或附近)。这种应用可从神经损伤时起48至96小时内进行。AgNPs制剂可以与补充疗法或治疗性化合物例如皮质类固醇、细胞因子、或抗体(例如细胞特异性或细胞因子特异性抗体)组合应用。

本发明构思的另一个实施方式是将银纳米颗粒制剂与精氨酸酶组合应用的方法，其可以对需要保护免受炎症的部位提供协同效应，如由对神经元组织(例如，急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤的部位、中风部位、和/或外科介入部位)的伤害引起的神经元损伤的预防或治疗。在一些实施方式中，如果在对神经元组织的伤害之前被应用，则这样的治疗可以提供神经保护作用。使用的银纳米颗粒的平均直径小于约1μm或约5nm至约20nm，并且可以在药学上可接受的载体例如生物聚合物如透明质酸中提供。药学上可接受的载体可以是液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂或制品。在一些实施方式中，AgNPs制剂被全身应用。在其他实施方式中，AgNPs制剂被局部应用(例如在损伤部位处或附近)。这样的应用可从神经损伤时起48至96小时内进行。在一些实施方式中，应用可以在损伤之前发生，例如在要进行脊柱手术的部位处进行预防性应用。AgNPs制剂可以与补充疗法或治疗化合物例如皮质类固醇、细胞因子、或抗体(例如细胞特异性或细胞因子特异性抗体)组合应用。

本发明构思的另一个实施方式是用于治疗动物(其可包括人)的组合物，其包括银纳米颗粒和不可流动凝胶形式的药物载体。银纳米颗粒的平均直径可小于约1μm，如约5nm至约20nm。药物载体可包括生物聚合物，如蛋白质、多糖、淀粉和氨基糖苷类(例如透明质酸)。药物载体可包括减少或防止银纳米颗粒聚集的稳定剂，如如聚乙烯吡咯烷酮。

本发明构思的另一个实施方式是用于提供神经元组织的治疗——例如在神经元组织伤害后对神经元损伤的治疗——的试剂盒。这样的试剂盒包括平均直径小于约1μm(例如约5nm至约20nm)的银纳米颗粒，以及提供有效治疗的治疗方案的说明。这样的治疗可以包括在对神经组织伤害(例如，由于在脊柱处或附近的外科介入)之前提供神经保护、M1/M2巨噬细胞平衡的调节、和/或增加精氨酸酶活性，并且这样的治疗可以被应用于急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤的部位、和/或中风部位。试剂盒还可包括药学上可接受的载体，其可包括生物聚合物。这在药学上可以被配制成液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂或制品。试剂盒可包括一种或多种补充治疗剂，如精氨酸酶、皮质类固醇、细胞因子和/或抗体(如细胞特异性抗体或细胞因子特异性抗体)。治疗方案可以在损伤的48至96小时内提供银纳米颗粒的全身和/或局部(即在治疗部位处或附近)应用。

从优选实施方式的以下详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，附图中相同的数字表示相同的组件。

附图说明

图1A和1B：图1A显示免疫荧光染色研究的典型结果，该研究涉及使用银纳米颗粒(AgNPs)处理和未使用银纳米颗粒(AgNPs)处理的嗜中性粒细胞浸润到伤口中的动力学。绿色荧光代表Ly6G阳性嗜中性粒细胞；蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核(200×)。损伤后立即和之后长达10天的浸润程度明显降低。图1B显示免疫荧光染色研究的典型结果，所述研究涉及使用银纳米颗粒(AgNPs)处理和未使用银纳米颗粒(AgNPs)处理的巨噬细胞浸润到伤口中的动力学。绿色荧光代表F4/80阳性巨噬细胞；蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核(200×)。损伤后立即和之后长达10天的浸润程度明显降低。

图2A和2B：图2A和图2B显示了分别用5nm至20nm不同浓度的AgNPs处理的原始的、未修饰的表型的RAW264.7巨噬细胞以及RAW264.7巨噬细胞的M1和M2表型在暴露的第2天和第3天的细胞活力研究结果。银纳米颗粒在20μM和更高浓度下的选择性杀伤作用是明显的。

图3A和3B：图3A示意性地描绘了M1和M2巨噬细胞中L-精氨酸代谢的竞争途径。在M1巨噬细胞中，NO由iNOS从精氨酸合成，引起细胞毒性和细胞凋亡。在M2巨噬细胞中，精氨酸酶从L-精氨酸产生多胺和脯氨酸，这有利于细胞增殖和胶原蛋白的产生。精氨酸酶途径也参与尿素循环，其消除过量的氨。图3B显示在用精氨酸酶(香港理工大学(Hong KongPolytechnic University))处理的第2天，表达非极化的M1或M2表型的RAW264.7的细胞活力研究结果。浓度范围为0ng/L至1,000ng/L的精氨酸酶对非极化的M1、M2表型的细胞活力没有明显影响。

图4：图4示意性地描绘了负载AgNPs的水凝胶的典型合成。

图5：图5示意性地描绘了在本文描述的研究中用于产生受控的挫伤脊髓损伤(SCI)的机制。

图6A至6C：图6A至6C显示了表征AgNPs性质的各种研究的结果。图6A提供了典型AgNPs悬浮液的照片。图6B显示AgNPs的典型UV-可见吸收光谱。图6C显示了基于TEM结果的AgNPs的形态和尺寸分布。

图7：图7显示了在不存在添加的溶剂和/或释放剂的情况下，表征来自透明质酸/甲基纤维素(HAMC)水凝胶的AgNPs的体外释放的研究结果。

图8：图8显示了小鼠移动性研究的典型结果，使用前肢运动量表(FLS)测试来评估AgNPs对C5水平脊髓损伤后小鼠行为结果的功效。显示了在5个测试时间点AgNPs处理组、对照组、无水凝胶组、和假手术组之间的FLS值的比较。

图9：图9显示了小鼠移动性研究的典型结果，使用爬梯行走性能(Ladder RungWalking Performance)测试来评估AgNPs对C5水平脊髓损伤后用AgNPs处理的小鼠行为结果的功效。显示了在4个测试时间点AgNPs处理组、对照组、无水凝胶组、和假手术组之间漏失比率(missing ratio)结果的比较。

图10A和10B：图10A和10B提供了来自AGNPs处理的和对照受试者的损伤脊髓部分的组织学研究的显微照片。图10A显示H&E染色的典型结果，其中空泡形成由黑色箭头指示。图10B显示损伤部位(黑色箭头)——包括后索和背角——中髓鞘质损失的程度。脱髓鞘的缓解显示为两组中的恢复，呈现为蓝色的分布和强度。

图11A和11B：图11A和11B显示了使用针对炎症标记物的抗体对来自AGNPs处理的和对照受试者的损伤脊髓部分的免疫荧光染色的典型结果。图11A显示了AgNPs组和空白水凝胶组在第3天和第9天在脊髓损伤部位的背角处TNF-α表达的免疫荧光染色的典型结果。绿色荧光代表TNF-α表达。通过软件Image J定量荧光的平均强度。显示的值是具有一个标准差的平均值。(放大率：10×)。图11B显示了AgNPs组和空白水凝胶组在第3天和第9天在脊髓损伤部位的背角处iNOS表达的免疫荧光染色的典型结果。绿色荧光代表iNOS表达，通过软件Image J定量荧光的平均强度(放大率：10×)。

具体实施方式

以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本发明的主题提供了装置、系统和方法，其中银金属被提供为平均直径小于约1μm、小于约500nm、或在约5nm至约999nm之间的纳米颗粒，其中这样的纳米颗粒在外伤性神经损伤(如外伤性脊髓损伤)后被全身或局部应用，以治疗或预防神经损伤的影响。发明人认为，通过改变损伤部位处或附近的M1和M2巨噬细胞的应答来提供神经保护作用，进而，减少损伤部位处或附近的炎症应答。具体地，发明人认为M1巨噬细胞优先被纳米颗粒银靶向，并且这种靶向导致这种M1巨噬细胞的失活或死亡。令人惊讶的是，发明人已经发现当这样的纳米颗粒作为基于透明质酸的凝胶制剂中的悬浮物被应用于损伤部位时，在不使用助溶剂或其它释放剂的情况下，它们可以有效地从凝胶制剂被释放，这样的纳米颗粒可以有效地改善外伤性脊髓损伤的动物模型中的恢复。

本发明构思的银纳米颗粒是金属银的颗粒(如通过还原可溶性银盐产生的那些)。这些通常基本上是单分散的并且具有小于1μm的平均直径。这种纳米颗粒的合适的平均直径为约5nm至约999nm之间，例如约5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm和900nm。在典型的配方中，大多数银纳米颗粒的直径范围为约5nm至约20nm。

在本发明构思的组合物中，银纳米颗粒可以是液体、凝胶、糊剂、乳膏、或其他流体或半流体载体中的悬浮液或分散体的形式。在一些实施方式中，银纳米颗粒被提供在固体载体中，所述固体载体随时间溶解或分散。这样的载体可以由任何药学上可接受的材料制成，如生物聚合物(例如蛋白质、多糖、淀粉、葡糖胺聚糖等)。在优选的实施方式中，悬浮液或分散体包括透明质酸，其可以与一种或多种其他生物聚合物组合使用。

透明质酸是细胞外基质的组分，并且已经在临床上用于替代或补充具有关节炎的关节中的滑液以试图改善功能。遗憾的是，这样的治疗没有证明明显的临床益处，其在某些情况下已经产生了显著的负面副作用。透明质酸也已用于皮肤填充物(dermal filler)中，所述皮肤填充物被皮下注射用于美容目的。不幸的是，这样的用途已与炎性反应和异物型(foreign body-type)肉芽肿反应有关。应当理解，透明质酸的存在通常也与增加的炎症有关。因此，鉴于炎症在中枢神经系统损伤中的外伤后伤害中的作用，银纳米颗粒在减少炎症和促进从中枢神经系统损伤恢复方面的功效(如下所示)是违反直觉和意想不到的。

在本发明构思的方法中，含有银纳米颗粒的制剂可以被全身或局部应用。用于全身应用的合适方法包括注射和口服摄入。局部应用可以通过在需要治疗的部位或其附近处流体悬浮液的直接应用、(例如，增稠或粘稠制剂的)注射、半固体(例如凝胶、糊剂和/或乳膏)的应用、和/或包括银纳米颗粒的植入物或制品的应用或定位来提供。

应当理解，所公开的技术提供了许多有益的技术效果，包括安全有效地减少通常在急性损伤之后，特别是对中枢神经系统的急性损伤之后的伤害性炎症，同时支持随后的愈合和/或再生。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表示成分的量、诸如浓度、反应条件等性质的数字被理解为在某些情况下通过术语“约(about)”修饰。因此，在一些实施方式中，书面说明和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据试图通过特定实施方式获得的期望性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管陈述本发明的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中陈述的数值根据实际被精确地被报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能含有由其各自的测试测量中发现的标准差必然引起的某些误差。

如本文的说明中和贯穿随后的权利要求所使用的，除非上下文另有明确指定，“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的含义包括复数指代。此外，如本文的说明中所使用的，除非上下文另有明确指定，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”。

本文中对数值范围的陈述仅意图用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有指定，每个单独的值被并入说明书中，如同它在本文中单独陈述一样。除非本文另有指定或上下文另有明确矛盾，本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如(such as)”)的使用仅意图更好地阐明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。

本文公开的发明的可替代元素或实施方式的分组不应被解释为限制。每个成员可以单独地或与本文中找到的组中的其他成员或其他元素以任何组合被引用和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将组的一个或多个成员包括在组中或从组删除。当发生任何这样的包括或删除时，本说明书在本文被认为含有经修改的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面说明。

本发明构思的一个实施方式是使用纳米颗粒银以调节M1和M2巨噬细胞之间的平衡。M1巨噬细胞与炎症过程(其导致脊髓损伤后的明显伤害)相关，而M2巨噬细胞与细胞募集和再生相关。在优选的实施方式中，M1和M2巨噬细胞之间的平衡的这种调节可用于减少和/或预防炎症，特别是与神经外伤相关或导致神经外伤的炎症。如图1A和1B所示，用银纳米颗粒治疗损伤的组织(在这种情况下为肌腱)导致与炎症过程有关的嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞的浸润减少。

图1A显示了在200×放大率下Ly6G阳性嗜中性粒细胞(细胞核用DAPI复染色)的免疫荧光染色结果，并显示了使用银纳米颗粒(AgNPs)处理和未使用银纳米颗粒(AgNPs)处理的这样的嗜中性粒细胞浸润到伤口中的动力学。类似的研究显示在图1B中，其中对F4/80阳性巨噬细胞进行免疫荧光染色。损伤后立即和之后长达10天的浸润程度降低。如下所示，这也在脊髓损伤实验中显示。

发明人认为银纳米颗粒可导致巨噬细胞的选择性细胞死亡，其可导致急性炎症应答(如神经学损伤后的那些)中发现的M1/M2比率的调节(如降低)。此外，发明人惊奇地发现银纳米颗粒的应用可以调节急性炎症——如神经外伤(例如脊髓损伤、中风等)后的急性炎症——中的M1/M2比率。不希望受理论束缚，发明人认为AgNPs对某些细胞类型可以是选择性细胞毒性的。发明人已经确定AgNPs对原代软骨细胞和大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞的不同作用，其中发现AgNPs的细胞毒性是剂量依赖性的。值得注意的是，原代RCS细胞在高于20μM的浓度下展示出降低的活力。发现原代软骨细胞耐受更高的AgNPs浓度。除了细胞毒性之外，在20μM AgNPs下培养的RCS细胞中蛋白多糖的表达显示，纤调蛋白的表达上调，并且在高尔基体附近的细胞核处存在可观察到的形态变化，其指示增加的细胞分泌活性的水平。

为了进一步表征这样的选择性细胞毒性，发明人研究了AgNP暴露对RAW264.7细胞上的作用。因为该细胞系的体外极化已经很好地建立，因此这些细胞提供了通常用于研究巨噬细胞极化的实验模型。用100ng/mL LPS加2.5ng/mL IFNγ处理的RAW264.7细胞生长为M1表型，而用10ng/mlIL-4的处理则导致M2表型。MTT染色(指示细胞代谢活性)显示，当暴露于直径范围为约5nm至约20nm的20μMAgNPs时，具有M1表型的细胞与具有M2表型的细胞相比，显示出显著降低的活力。图2A和2B显示用不同浓度的5nm至20nm AgNPs处理的M1和M2表型RAW264.7巨噬细胞在暴露的第2天(图2A)和第3天(图2B)的细胞活力研究结果，显示在约20μM或更高的浓度下银纳米颗粒的选择性杀伤作用。

通过应用银纳米颗粒调节(例如降低)存在于外伤性损伤部位的巨噬细胞的M1/M2比率可以用于治疗和/或预防这种外伤性损伤的负面结果。具体地，通过应用银纳米颗粒降低外伤性损伤后的M1/M2比率可以选择性地降低伤害性炎症效应，同时一般不会导致细胞毒性和/或当前治疗方案的其他负面作用。在优选的实施方式中，外伤性损伤与中枢神经系统外伤(例如脊髓损伤、头部损伤、中风等)有关，并且银纳米颗粒提供神经保护作用。

外伤性脊髓损伤(TSCI)的病理生理学包括初级(原发性，primary)和继发性损伤机制，这些机制协调作用导致在损伤后第一周期间，在脊髓内形成空腔的组织的坏死核心的发展(27-29)。继发性损伤以缺血、水肿、增加的兴奋性氨基酸和活性氧物质对组织的氧化伤害的形式，对实际撞击部位的伤害扩展到嘴和尾部(rostral and caudal)水平(28、30、31)。脊髓损伤的人的改善的紧急护理以及积极的治疗和康复可以最小化对神经系统的伤害，甚至恢复有限的能力。

TSCI初级损伤的机制由以下表征：(i)冲击加持续压迫；(ii)单独瞬态压迫的冲击；(iii)内脱位(引离，distraction)；和(iv)撕裂/横断(32)。初始的机械伤害倾向于主要伤害中心灰质，同时外围白质相对不受伤害。损伤的脊髓遭受早期出血，后期发展为中断的血流。这样的中断导致由缺氧和缺血引起的局部梗塞。由于其高代谢需求，这特别伤害灰质(32)。通过损伤部位的神经元被物理中断，并表现出减少的髓鞘质厚度(34)。神经传递可以被损伤部位附近的水肿和微出血进一步中断(32、35-37)。灰质在损伤的第一个小时内，而白质在72小时内(38)遭受不可逆转的伤害，为有效治疗提供了有限的机会窗口。由于免疫细胞的募集和激活，炎症应答诱导的免疫伤害已被广泛接受作为脊髓继发性伤害的重要原因(28、39-41)。

对损伤的急性炎症应答涉及将嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集到损伤部位。中枢神经系统的小胶质细胞也在炎症应答的起始中起重要作用。这样的应答几乎立即跟随TSCI的发生，其中伤害的组织内的细胞如内皮细胞产生促炎细胞因子和化学引诱剂(28、42、43)。这反过来增强了粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的内皮细胞表达，其允许嗜中性粒细胞通过反受体(LFA-1、VLA-4)结合并在损伤后几小时内迁移到组织中(44、45)。随后巨噬细胞涌入。嗜中性粒细胞和巨噬细胞诱导氧化爆发，导致在碎屑的吞噬过程中产生活性氧物质(28、35)。这些活性氧物质可通过介导脂质过氧化和蛋白质硝化，以及通过激活氧化还原敏感信号级联和一氧化氮的消耗而导致大量继发性伤害(39、46)。因此，周围相对健康的组织可能被损坏。在脑挫伤(47、48)、涉及缺血再灌注的中风(49、50)和视神经的断裂(51、52)后，也可能发生由这样的炎症应答引起的伤害。

巨噬细胞和小胶质细胞被认为是神经再生的组成部分。损伤脊髓中的巨噬细胞来源于血源性单核细胞和常驻小胶质细胞(60)。在大鼠模型中，血源性单核细胞在初始损伤后2天内浸润病灶，在5-7天达到最高密度，并持续数周至数月(28)。小胶质细胞可在损伤后数分钟至数小时内被激活，并转化为巨噬细胞(61)。

巨噬细胞已显示表现很强的可塑性，并且可以根据它们的微环境提供的刺激中的变化改变它们的表型和功能(40)。已经报道了几种具有不同功能的巨噬细胞亚群，包括M1、M2、调节性巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞和骨髓来源的抑制细胞等(64)。已经观察到TSCI后积累的大多数巨噬细胞是M1(65)。

已知M1巨噬细胞在TSCI后产生有害作用，因为它们产生高水平的IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、CCL5、TNF-α、IFN-σ和iNOS(66、67)。相对于M2巨噬细胞，M1巨噬细胞还表达高水平的白三烯B4和前列腺素、炎症和继发性损伤的介质(68)。另一方面，M2巨噬细胞已显示参与愈合和修复过程(72)。发明人认为，在脊髓损伤区内减少M1巨噬细胞增殖并提供M1表达的抑制和/或阻止可以控制和/或消退TCSI后的伤害性炎症，并且这可以通过AgNPs的应用来提供。

发明人注意到精氨酸酶的表达已与中枢神经系统损伤的恢复有关。在炎症应答期间，精氨酸酶主要由通过旁路途径激活的M2巨噬细胞产生，而经典激活的M1巨噬细胞表达可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)。精氨酸酶和iNOS都参与L-精氨酸代谢。精氨酸酶水解L-精氨酸以产生刺激细胞增殖的鸟氨酸(脯氨酸和多胺的前体)、和尿素(其有助于去除过量的氨)。在某些情况下，iNOS可以竞争可用的L-精氨酸以产生NO，NO是一种细胞毒性介质，其可以氧化DNA、蛋白质和/或脂质，从而产生有害作用。精氨酸酶和iNOS之间的竞争在图3A中示意性地显示。如图3A中显示，由M1巨噬细胞产生的iNOS与L-精氨酸反应产生NO，导致细胞毒性和细胞凋亡。M2巨噬细胞产生精氨酸酶，其与L-精氨酸反应产生多胺和脯氨酸。这反过来又支持细胞增殖和胶原蛋白产生。此外，发明人认为在组织损伤的应用部位用AgNPs与精氨酸酶组合治疗可以提供协同效应，该协同效应进一步增强愈合效果。不希望受理论束缚，但发明人认为在治疗的部位提供额外的精氨酸酶可以加速精氨酸分解成多胺和脯氨酸，这反过来可以在恢复过程中进一步促进细胞增殖和胶原蛋白产生。

图3B显示应用的精氨酸酶浓度与表达非极化的M1和M2表型的RAW264.7细胞活力之间的相关性。如所示，在宽浓度范围下应用的精氨酸酶对细胞活力(通过MTT测定确定)没有影响。因此，预期AgNPs与精氨酸酶组合使用不应对治疗部位的细胞活力产生不利影响。用于这些研究的精氨酸酶由香港理工大学根据美国专利号8,507,245(其通过引用并入本文)提供。

令人惊讶的是，发明人已经发现银纳米微粒可以在保留M2巨噬细胞的同时展示M1巨噬细胞的选择性杀死和/或抑制，并且在这些巨噬细胞活性之间的平衡中的这种调节在治疗TSCI中非常有用。应当理解，常规方法不提供这样的的单一试剂，其能够在促进M2巨噬细胞活性(其可以在脊髓再生中提供积极效果)的同时减少脊髓损伤中M1巨噬细胞活性的有害作用。

在本发明构思的一个实施方式中，银纳米颗粒用于治疗外伤性脊髓损伤。在优选的实施方式中，相对于缺乏银纳米颗粒的假治疗，这样的治疗导致至少运动恢复的改善。令人惊讶的是，发明人已经发现银纳米颗粒可以增强TSCI后大鼠的运动恢复。不希望受理论束缚，发明人认为银纳米颗粒可以减少或减轻通常在急性脊髓损伤后发生的急性炎症，并通过调节免疫细胞(巨噬细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞)的活性同时也激活它们并向它们发信号以开始导致加速愈合的再生过程来保护脊髓免受继发性损伤。在下面的实例中提供了银纳米颗粒制剂在治疗冲击诱导的TSCI大鼠模型的动物模型中的效用以及由此导致的运动恢复的增强。

在本发明构思的一些实施方式中，银纳米颗粒与补充治疗方法组合使用以提供神经保护和/或治疗神经损伤。合适的补充治疗方法包括用精氨酸酶和/或抗炎化合物如皮质类固醇和/或NSAIDs治疗。其他补充治疗方法包括用针对免疫系统和/或炎性过程的组分的特异性抗体(例如，单克隆抗体)的治疗。实例包括针对M1巨噬细胞、白细胞介素1、γ-干扰素、和/或TNFα的抗体。其他补充治疗方法还包括用有利于在M1/M2平衡中增加M2组分的细胞因子治疗。这样的细胞因子包括白细胞介素4、白细胞介素10和白细胞介素13。

实施例

负载银纳米颗粒(AgNP)的透明质酸/甲基纤维素(HAMC)水凝胶的制备：使用化学还原法合成悬浮液中的银纳米颗粒(AgNPs)。将含有0.7mM柠檬酸钠二水合物(Sigma-Aldrich)和0.1mM硝酸银(AgNO₃；Sigma-Aldrich)的500ml溶液鼓泡并在氮气下在室温下剧烈搅拌30分钟。向这里加入0.5ml的10mg/ml硼氢化钠(NaBH₄；Sigma-Aldrich)溶液，然后在黑暗中搅拌4小时(至完成)。过夜老化后，通过旋转蒸发将溶液从500ml浓缩至50ml，并加入50μl的100mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP；Mr＝10,000Da；Sigma-Aldrich)作为稳定剂以防止AgNPs在储存期间聚集。获得的AgNPs悬浮液的最终浓度大约为1mM(以每体积的Ag质量计)。

使用2wt％透明质酸钠(HA；MW＝2,600Da；Ryon)和5wt％甲基纤维素(MC；MW＝300Da；Sigma-Aldrich)在无菌人工脑脊液(aCSF；pH 7.4；组成：148mMNaCl、3mMKCl、0.8mMMgCl₂、1.4mMCaCl₂、1.5mMNa₂HPO₄和0.2mMNaH₂PO₄)中制备透明质酸/羧甲基纤维素(HAMC)水凝胶。在60℃下将无菌MC和HA依次并机械地分散在aCSF中，并使其在4℃下溶解过夜。通过依次和机械地将5wt％MC和2wt％HA分配到无菌AgNPs溶液中并使悬浮液在4℃下溶解过夜，类似地制备负载AgNPs的HAMC水凝胶。典型的合成示意性地显示在图4中。

AgNPs的表征：在120KV下通过透射电子显微镜(TEM；Philips Technai 12)分析合成的AgNPs的大小和形态。还使用分光光度计通过全波UV光谱扫描(Full-wave UV spectrascanning)(NanoDrop 2000；Thermo Scientific)记录跨越UV-可见光谱的吸收。

AgNPs从HAMC水凝胶的释放：在一系列连续的时间段内体外测量来自HAMC水凝胶制剂的银纳米颗粒的累积释放曲线。具体地，将重约1g的负载AgNPs的水凝胶的部分储存在10ml的aCSF(释放介质)中，并在37℃下在旋转振荡器上以60rpm的频率振荡。在不同时间点提取0.5ml的释放介质并储存在4℃下以用于进一步表征。在这样的时间点，向释放介质中加入0.5ml新鲜的aCSF。使用分光光度计(NanoDrop 2000；Thermo Scientific)，通过光密度(O.D.)在400nm下测量释放的银纳米颗粒的量。

动物研究：将49只重约250克的8周龄斯普拉-道来(Sprague-Dawley)(SD)大鼠随机分为4组，其中AgNPs组中20只大鼠、空白水凝胶组中18只大鼠、无水凝胶组中5只大鼠、假手术组中6只大鼠。对照组中的大鼠用空白、无负载HAMC水凝胶注射，而AgNPs试验组中的大鼠在挫伤手术后用负载AgNPs的HAMC水凝胶注射。无水凝胶组大鼠在挫伤手术后仅用生理盐水注射，并且假手术组中的动物脊髓通过外科手术暴露但未被挫伤。在每组中，在通过外科手术引入损伤后的3个不同时间点(在第7、9和14天结束时)对大鼠进行安乐死用于H&E染色和Luxol固蓝(fast blue)染色，并在2个不同时间点(在第1和9天结束时)用于免疫组织化学分析。这些动物获得自香港大学实验动物中心，并在一个房间内提供随意饮食和水，和12小时光照和12小时黑暗的交替周期。

挫伤性脊髓损伤：大鼠在腹膜内用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(K：X＝2：1)全身麻醉下进行手术。沿着矢状平面制作皮肤切口以暴露沿着C3-C7覆盖椎弓板的肌肉。随后，在椎骨水平C5用显微外科手术工具进行椎板切除术以暴露脊髓。如图5示例，使用从NYU冲击器装置(85、86)改进的定制落锤损伤装置(weight-drop injury device)制造NYU-MASCIS挫伤脊髓损伤(SCI)。具体地，小心地降下直径为2mm的10克无菌钝金属棒直至其与硬膜接触。为了通过冲击模仿不完全的急性SCI，将杆从12.5厘米的高度自由落在C5水平的脊髓左部，以便对左前爪受损的运动创建可观察的临床体征。随后将切口部位逐层缝合。发明人认为，这个模型提供了由脊柱手术引起的事故和外伤两者导致的外伤性脊髓损伤的精确模拟。

用AgNPs治疗：在切口部位被逐层缝合之前，对于AgNPs组中的大鼠，将0.1ml的1mM无菌AgNPs溶液直接逐步输灌在损伤部位，然后将0.15ml的负载AgNPs的水凝胶注射到椎骨水平C5的硬膜上。对于对照组中的大鼠，将0.1ml温热注射盐水以及0.15ml空白HAMC水凝胶依次置于损伤部位上。总之，递送到损伤部位中的AgNPs的总剂量被控制在约45μg/kg。在恢复的前三天期间，通过肌内注射每天两次给予止痛药(丁丙诺啡，0.01至0.02mg/kg)。仔细监测动物疼痛、炎症和任何其他术后并发症的迹象。发明人注意到，在AgNP制剂存在下进行这样的程序会期望类似的效果，这将基本上提供制剂的到损伤部位的立即应用，并得出结论，从逻辑上讲，这样的应用将提供针对随后的炎症和损伤的保护作用。

使用前肢运动量表(FLS)测试(87)和爬梯行走测试(88)进行功能恢复的评估。观察的时间点分别为术后第3天、第5天、第7天、第9天和第14天。

FLS被设计以提供快速观察评分，其描述在运动期间前肢的功能能力(87)。评分系统的类别是基于单侧颈部损伤后观察到的行为变化，其中范围从0(完全麻痹)到17(健康状况)。将大鼠放置于围栏(5cm×1m)中，使动物自由移动。左前爪行为通过数字视频记录，用于双盲法观察者的进一步分析。在1或2次预热练习后，每只大鼠在每个时间点进行4次测试试验。

爬梯行走测试被用于评价在恢复期间受影响的爪的运动功能的变化，并且被认为对于表现中的细微变化更为客观、定量和敏感(88)。简言之，对于除第3天之外的所有时间点，通过随机跨越水平放置的带有金属梯级(直径3mm)的梯子，给动物提供到达它们的家笼的任务。大鼠在梯子上的表现被视频记录，并由双盲法观察者逐帧分析。它们的左前爪的步伐在7级量表的基础上进行评分，并进一步二分为错误(0-2)或正确的步伐(3-7)。“漏失比率(missing ratio)”被定义为试验中间的10个步伐中任何类型的脚滑或总漏失的数量。计算5个试验的错误步伐的平均数量用于比较。

组织学染色和免疫组织化学：使用过量的戊巴比妥钠(100mg/kg)在指定的时间点处死大鼠，并在心脏内灌注250ml盐水，然后灌注200ml的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。获得C5水平的脊髓节段并在4％多聚甲醛中固定过夜。将用于组织学染色的样品经受脱水和脱钙，并将处理过的组织片包埋在石蜡中并切片。制备6-μm石蜡包埋的损伤脊髓组织的横切片用于组织学分析。用于免疫组织化学(IHC)染色的样品在30％蔗糖溶液中依次脱水在4℃下过夜，并在冷冻切片之前被包埋在最佳切割温度化合物(OCT化合物)中。

为了观察AgNPs对损伤部位处的炎症应答的影响，尤其是对两种表型的巨噬细胞(M1和M2)的操纵的影响，Arg-1抗体(1：50，用于M2表型的生物标志物，GeneTex)或TNF-α抗体(1：50，用于M1表型的生物标志物，Abeam)、和iNOS抗体(1：50，用于M1表型的生物标志物，Abeam)被用作免疫组织化学研究中的初级抗体(一抗，primary antibody)，连同适合的AlexaFluor缀合的二抗(1：200；Life Technologies Corp.)和Hoechst33342(Sigma-Aldrich)用于更好的可视化。

髓鞘质完整性：在石蜡包埋的切片中定性和定量测定髓鞘质完整性，所述切片用Luxol固蓝(fast blue)染色用于髓鞘质，并用甲酚紫染色用于神经元和细胞核的尼斯耳质。使用尼康荧光显微镜(Nikon E800)用于显微镜分析。为了确定伤害部位处的组织学形态和病理变化，使用H&E染色进行损害部位分界。

统计分析：进行统计分析以表征AgNPs组和对照组之间以及恢复中的不同时间点之间的差异。为了分析由组(AgNPs和对照组)和时间点(第3、第5、第7、第9和第14天)组成的两个主要因素对FLS评分的影响，利用双因素ANOVA作为统计模型。在下文中，应用t检验来检验在相同时间点两组之间FLS评分的方差，同时使用用于多重比较的Bonferroni事后(post hoc)检验来检验不同时间点之间的差异。

类似地，通过双因素ANOVA作为统计模型表征不同因素对实验组(AgNPs和对照组)和观察时间点(第5天、第7天、第9天和第14天)对漏失比率的影响，双因素ANOVA后跟随t检验以检验在同一时间点两组之间漏失比率的差异，和Bonferroni事后以检验不同时间点之间的差异。

结果

AgNPs的表征：TEM图像(参见图6A)显示AgNPs在水中是球形的和单分散的。如图6C所示，大部分纳米颗粒的直径分布在约5nm至约12nm，其中中值直径是8.203nm。合成的AgNPs溶液的UV-可见吸收光谱(参见图6B)在400nm处表现出吸收峰，这证实了溶液中纳米颗粒的存在。

来自HAMC水凝胶的AgNPs的释放曲线：图7中显示了来自HAMC(HA：MC＝2：5)水凝胶的AgNPs在5天内的释放的体外研究结果。约108μg/g的AgNPs被负载到HAMC水凝胶中，并且在5天后从递送系统释放的药物(AgNP)大于初始纳米颗粒负载的65％。这表明存在于水凝胶中的大百分比(例如大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、或按重量计)的AgNPs将在注射部位被局部递送。

运动功能的评估：恢复的FLS测试的结果显示在图8中。发现治疗组和时间点两个因素对FLS评分有显著影响。对于AgNPs组，第3天和第5天之间的差异非常显著(p<0.01)，与对照组相同。在第7天，发现AgNPs组具有比空白水凝胶(p＝0.033)和无水凝胶组(p<0.01)明显更大的FLS。在第9天，AgNPs组显示出比空白水凝胶组(p＝0.048)和无水凝胶(p<0.01)显著更大的FLS值。在第14天，AgNPs组显示出比空白水凝胶组(p＝0.033)和无水凝胶(p＝0.015)明显更大的FLS值。

一般而言，AgNPs组展示出比对照组明显更大的FLS评分值。在每个时间点，空白水凝胶和无水凝胶组之间没有显著差异。在所有时间点，假手术组(无脊髓损伤)显示出比其他三组明显更大的FLS。根据t检验，两组之间的FLS评分在术后第7天(p＝0.033)、第9天(p<0.01)、第14天(p＝0.015)显著不同。

恢复的爬梯行走测试的结果显示在图9中。治疗组和时间点两个因素都显示对爬梯行走测试期间观察到的漏失比率的显著影响。随着两组中每一组的恢复的进展，漏失比率下降。

比较在相同时间点AgNPs和空白水凝胶组观察到的漏失比率时，空白水凝胶组的值明显大于AgNP组的值。在第7天，AgNPs组显示比空白水凝胶组(p＝0.019)和无水凝胶组(p＝0.018)显著更小的漏失比率。在第9天，AgNPs组显示比空白水凝胶组(p＝0.033)和无水凝胶组(p＝0.025)明显更小的漏失比率。在第14天，AgNPs组显示比空白水凝胶组(p＝0.016)和无水凝胶组(p<0.01)显著更小的漏失比率。在任何时间点，空白水凝胶组和无水凝胶组之间没有明显差异。在所有时间点，假手术组具有比其他三组显著更小的漏失比率。

组织学评估：组织学研究的典型结果显示在图10A和10B中。图10A显示H&E染色的典型结果，其中空泡形成由黑色箭头表明。图10B示例了包括后索和背角的损伤部位(黑色箭头)中髓鞘质损失的程度。两组中的脱髓鞘的缓解分别作为恢复显示，呈现为蓝色的分布和强度。如H&E染色标本的显微照片所示，在大多数组织中观察到在损伤部位(黑色箭头)的不同程度的空泡形成。在第7天在对照组中展示了严重的空泡形成，随着恢复的进展，该空泡形成得到改善。在每个时间点，相对于对照组，在AgNPs处理组中，代表神经元损失的这种空泡形成大大减少。类似地，在每个观察时间点，与对照组中的大鼠相比，AgNPs处理的大鼠中有较少的髓鞘质损失。

免疫组织化学评估：图11A和11B显示了针对TNF-α(图11A)和iNOS(图11B)——它们都是炎症的介质——的免疫组织化学染色的结果。图11A显示了使用针对TNF-α的一抗，在第3天和第9天，以10×的放大率，在AgNPs组和空白水凝胶组中脊髓损伤部位的背角处的免疫荧光染色的典型的结果。图11B显示了类似免疫荧光染色研究的典型结果，其中一抗针对iNOS。通过软件Image J定量荧光的平均强度。显示的值是具有标准差的平均值。

显然，银纳米颗粒的应用显著降低脊髓损伤后炎性因子TNF-α和iNOS的表达，表明继发性损伤在这样的治疗后至少部分地通过炎症的减少而减弱。

发明人已经发现，使用挫伤性损伤动物模型来展示TSCI，银纳米颗粒在组织学和功能的基础上都对损伤的恢复具有显著的积极影响。如所示，如在损伤后第7天、第9天和第14天使用前肢运动量表(FLS)测试，和在损伤后第5天、第7天、第9天、第14天使用爬梯行走测试所示，AgNPs治疗的受试者显示更好和更快的恢复。这个功能评估展示，AgNPs可以在损伤后脊髓的恢复中产生积极影响。

组织学检查的结果还表明，相比对照受试者，AgNPs治疗的受试者中对受外伤的脊髓的损伤后损害较不严重，如通过减少的空泡形成和减少的脱髓鞘所证明的。免疫组织化学检查结果显示炎症极大地减少，如通过损伤后TNF-α和iNOS表达的减少所证明的。这展示AgNPs可以成功减少TSCI后的继发性伤害。发明人认为，通过损伤后释放的银纳米颗粒的M1/M2比率的调节，导致脊髓损伤后改善的愈合和功能恢复。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含(comprises,comprising)”应该被解释为以非排他的方式指代元素、组件或步骤，表明所引用的元素、组件或步骤可以存在，或者被利用或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。如果说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中某些中的至少一种，则该文本应被解释为仅需要该组中的一个元素，而不是A加N或B加N等。

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Claims (87)

1.提供神经元组织的治疗的方法，所述方法包括：

提供包含银纳米颗粒的银纳米颗粒制剂；和

将所述银纳米颗粒制剂应用于需要治疗的部位。

2.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括在对所述神经元组织伤害后神经元损伤的治疗。

3.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括在对所述神经元组织伤害前提供神经保护。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中需要治疗的所述部位选自由急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤部位、和中风部位组成的组。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径小于约1μm。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒制剂进一步包含药学上可接受的载体。

8.权利要求7所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括生物聚合物。

9.权利要求7和8中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是选自由液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂和制品组成的组的形式。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括全身应用。

11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法包括定位于需要治疗的所述部位处或其附近的应用。

12.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的96小时内。

13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的72小时内。

14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的48小时内。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，进一步包括给予补充治疗剂的所述步骤。

16.权利要求15所述的方法，其中所述补充治疗剂选自由精氨酸酶、皮质类固醇、抗体、和细胞因子组成的组。

17.权利要求16所述的方法，其中所述抗体选自由细胞特异性抗体和细胞因子特异性抗体组成的组。

18.调节M1/M2巨噬细胞平衡的方法，包括：

提供包含银纳米颗粒的银纳米颗粒制剂；和

将所述银纳米颗粒制剂应用于需要治疗的部位，所述治疗提供保护免受炎症。

19.权利要求18所述的方法，其中所述治疗包括在对所述神经元组织伤害后神经元损伤的治疗。

20.权利要求18所述的方法，其中所述治疗包括在对所述神经元组织伤害前提供神经保护。

21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中需要保护免受炎症的所述部位选自由急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤部位、和中风部位组成的组。

22.权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径小于约1μm。

23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒制剂进一步包含药学上可接受的载体。

25.权利要求24所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括生物聚合物。

26.权利要求24和25中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是选自由液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂和制品组成的组的形式。

27.权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括全身应用。

28.权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括定位于需要保护免受炎症的所述部位处或其附近的应用。

29.权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的96小时内。

30.权利要求18至29中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的72小时内。

31.权利要求18至30中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的48小时内。

32.权利要求18至31中任一项所述的方法，进一步包括给予补充治疗剂的步骤。

33.权利要求32所述的方法，其中所述补充治疗剂选自由精氨酸酶、皮质类固醇、抗体和细胞因子组成的组。

34.权利要求33所述的方法，其中所述抗体选自由细胞特异性抗体和细胞因子特异性抗体组成的组。

35.用于治疗动物的组合物，所述组合物包含：

多个银纳米颗粒；和

不可流动凝胶形式的药物载体。

36.权利要求35所述的组合物，其中所述银纳米颗粒的平均直径小于约1μm。

37.权利要求35或36所述的组合物，其中所述银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

38.权利要求35至37中任一项所述的组合物，其中所述药物载体包括生物聚合物。

39.权利要求38所述的组合物，其中所述生物聚合物选自由蛋白质、多糖、淀粉和氨基糖苷组成的组。

40.权利要求39所述的组合物，其中所述氨基糖苷包括透明质酸。

41.权利要求35至40中任一项所述的组合物，其中所述药物载体进一步包括稳定剂，其中所述稳定剂被配制以防止所述银纳米颗粒的聚集。

42.权利要求41所述的组合物，其中所述稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮。

43.权利要求35至42中任一项所述的组合物，进一步包含选自由精氨酸酶、皮质类固醇、抗体和细胞因子组成的组的补充治疗剂。

44.权利要求35至43中任一项所述的组合物，其中所述动物是人。

45.用于提供神经元组织治疗的试剂盒，试剂盒包括：

多个平均直径小于1μm的银纳米颗粒；和

适用于提供所述治疗的治疗方案的说明。

46.权利要求45所述的试剂盒，其中所述治疗包括在对所述神经元组织的伤害后神经元损伤的治疗。

47.权利要求45所述的试剂盒，其中所述治疗包括在对所述神经元组织伤害前提供神经保护。

48.权利要求45至47中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗包括M1/M2巨噬细胞平衡的调节。

49.权利要求45至48中任一项所述的试剂盒，其中选择所述治疗方案以有效治疗选自由急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤部位、和中风部位组成的组的部位。

50.权利要求45至49中任一项所述的试剂盒，其中所述银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

51.权利要求45至50中任一项所述的试剂盒，进一步包含药学上可接受的载体。

52.权利要求51所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的载体包括生物聚合物。

53.权利要求51和52中任一项所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的载体是选自由液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂和制品组成的组的形式。

54.权利要求45至53中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗方案包括全身应用。

55.权利要求45至54中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗方案包括定位于需要治疗的所述部位处或其附近的应用。

56.权利要求45至55中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗方案包括在神经损伤的96小时内应用的步骤。

57.权利要求45至55中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗方案包括在神经损伤的72小时内应用的步骤。

58.权利要求45至57中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗方案包括在神经损伤的48小时内应用的步骤。

59.权利要求45至58中任一项所述的试剂盒，进一步包含补充治疗剂。

60.权利要求59所述的试剂盒，其中所述补充治疗剂选自由精氨酸酶、皮质类固醇、抗体和细胞因子组成的组。

61.权利要求60所述的试剂盒，其中所述抗体选自由细胞特异性抗体和细胞因子特异性抗体组成的组。

62.治疗需要保护免受炎症的部位的方法，包括：

提供包含银纳米颗粒的银纳米颗粒制剂；和

将所述银纳米颗粒制剂和精氨酸酶应用于需要治疗的所述部位，所述治疗提供保护免受炎症，

其中精氨酸酶和所述银纳米颗粒制剂的组合在保护需要保护免受炎症的所述部位方面提供协同效应。

63.权利要求62所述的方法，其中所述方法包括在对所述神经元组织伤害后神经元损伤的治疗。

64.权利要求62所述的方法，其中所述方法包括在对所述神经元组织伤害前提供神经保护。

65.权利要求62至64中任一项所述的方法，其中需要保护免受炎症的所述部位选自由急性脊髓损伤部位、头部损伤部位、神经损伤部位、和中风部位组成的组。

66.权利要求62至65中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径小于约1μm。

67.权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

68.权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述银纳米颗粒制剂进一步包含药学上可接受的载体。

69.权利要求68所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括生物聚合物。

70.权利要求68和69中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是选自由液体、凝胶、乳膏、软膏、糊剂和制品组成的组的形式。

71.权利要求62至70中任一项所述的方法，其中所述方法包括全身应用。

72.权利要求62至71中任一项所述的方法，其中所述方法包括定位于需要保护免受炎症的所述部位处或其附近的应用。

73.权利要求62至72中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的96小时内。

74.权利要求62至73中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的72小时内。

75.权利要求62至74中任一项所述的方法，其中所述应用步骤发生在神经损伤的48小时内。

76.权利要求62至75中任一项所述的方法，进一步包括给予补充治疗剂的所述步骤。

77.权利要求76所述的方法，其中所述补充治疗剂选自由皮质类固醇、抗体和细胞因子组成的组。

78.权利要求77所述的方法，其中所述抗体选自由细胞特异性抗体和细胞因子特异性抗体组成的组。

79.银纳米颗粒在制备用于治疗动物炎症的药物的制剂中的用途，其中银纳米颗粒的平均直径小于约1μm，并以不可流动凝胶的形式在药物载体中提供。

80.权利要求79所述的用途，其中银纳米颗粒的平均直径为约5nm至约20nm。

81.权利要求79至80所述的组合物，其中所述药物载体包括生物聚合物。

82.权利要求81所述的用途，其中所述生物聚合物选自由蛋白质、多糖、淀粉和氨基糖苷组成的组。

83.权利要求82所述的用途，其中所述氨基糖苷包括透明质酸。

84.权利要求79至83中任一项所述的用途，其中所述药物载体进一步包括稳定剂，其中所述稳定剂被配制以防止所述银纳米颗粒的聚集。

85.权利要求84所述的用途，其中所述稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮。

86.权利要求79至85中任一项所述的用途，其中所述药物进一步包含选自由精氨酸酶、皮质类固醇、抗体和细胞因子组成的组的补充治疗剂。

87.权利要求79至86中任一项所述的用途，其中所述动物是人。

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