CN111936050A - 使用吩嗪衍生物或含有吩嗪衍生物的高分子量氧化还原聚合物的传感器 - Google Patents

使用吩嗪衍生物或含有吩嗪衍生物的高分子量氧化还原聚合物的传感器 Download PDF

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Abstract

本发明中，在嵌入型生物传感器的探头中使用吩嗪衍生物作为氧化还原介体而形成检测层，所述吩嗪衍生物是使吩嗪基共价键合于聚氨基酸、聚亚胺或聚烯丙基胺等具有羧基或氨基的高分子量聚合物、并且利用聚乙二醇链延长吩嗪基与高分子量聚合物主链之间的距离而得到的吩嗪衍生物。

Description

使用吩嗪衍生物或含有吩嗪衍生物的高分子量氧化还原聚合 物的传感器
技术领域
本发明涉及使用吩嗪衍生物或含有吩嗪衍生物的高分子量氧化还原聚合物的传感器。尤其涉及使用带电氧化还原酶的生物传感器用的高分子量氧化还原聚合物。
背景技术
生物传感器是利用或模仿生物体所具有的分子识别能力测量物质的系统，例如为以下测定装置：该测定装置将酶-底物、抗原-抗体、激素-受体等组合中的一者作为被检物(测定对象物质)，将另一者作为受体，将由被检物与其受体之间的分子识别反应产生的化学变化通过换能器转换为电信号，根据得到的电信号的强度测定被检物的量。
作为生物传感器中使用的生物分子，除了上述以外还包括基因、糖链、脂质、肽、细胞、组织等。其中，正在积极地开发使用酶的生物传感器，其代表例为用于自身血糖测定的、使用葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase；GOx)、葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase；GDH)等的电化学式葡萄糖传感器。
用于自身血糖测定的电化学式葡萄糖传感器的构成大致为：在其表面形成有电极的绝缘基板上，隔着间隔件配置有壳体。在上述电极上配置有包含被检物应答性酶、氧化还原介体(电子传递体)等的试剂，该部分成为分析部。用于导入血液的流路的一端与该分析部连通，上述流路的另一端朝向外部而开口，该开口成为血液供给口。使用这种传感器的血糖值测定例如可如下进行。即，首先将上述传感器设置在专用的测定装置(仪器)中。之后用刺血针刺破指尖等而造成出血，使上述传感器的血液供给口与该出血位置接触。血液通过毛细管现象被吸入传感器的流路，通过该流路被导入分析部，在此与上述试剂接触。之后被检物应答性酶E(例如GOx、GDH)与血液中的葡萄糖特异性地进行反应而将葡萄糖氧化。氧化还原介体M接收由氧化产生的电子。接收电子而被还原的氧化还原介体M在电极上被电化学氧化。由将还原型氧化还原介体M氧化而得到的电流值、电荷量等的大小简便地检测血液中的葡萄糖浓度、即血糖值。
这样的电化学式血糖传感器在糖尿病治疗中的血糖值管理中发挥重要的作用，糖尿病患者可以进行基于血糖值的合理的胰岛素给药、饮食限制。但是，必须每天多次测定血糖值，每次采集血液都会给患者带来痛苦，因此难以维持生活质量(Quality of Life；QOL)。
已经开发出嵌入型电化学式葡萄糖传感器。将这种嵌入型电化学式葡萄糖传感器1的主体10贴附在生物体2上，将探头11插入生物体内持续地进行血糖值的测定(图1及2)。由此，可以在不每次采集血液的情况下长时间地测定血糖值。
对于嵌入型生物传感器而言，由于将其探头长时间地插入体内，因此作为构成要素的被检物应答性酶、氧化还原介体流出的机会增加。若被检物应答性酶、氧化还原介体流出到传感器外部，不仅检测灵敏度变差，而且还会对生物体造成伤害。另外，若被检物应答性酶、氧化还原介体流出到外部，传感器的耐久性也会下降。因此，防止被检物应答性酶、氧化还原介体流出的对策非常重要。
专利文献1公开了用于酶电化学传感器的离子型亲水性高分子量氧化还原聚合物。该离子型亲水性高分子量氧化还原聚合物中，例如多个氧化还原介体以垂饰状共价键合于具有离子部分的亲水性聚合物。另外，作为亲水性聚合物，由聚合性丙烯酸酯或具有乙烯基的亲水性单体形成。专利文献1的氧化还原聚合物是通过使二茂铁等氧化还原介体以垂饰状共价键合于上述亲水性聚合物主链而得到的。另外，通过离子键固定有带电氧化还原酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-131893号公报
发明内容
发明所要解决的问题
嵌入型生物传感器的探头中，要防止构成检测层的氧化还原介体的流出。特别地，需要维持葡萄糖检测灵敏度、并且提高保存稳定性(耐久性)。
用于解决问题的方法
本发明提供一种使吩嗪衍生物等氧化还原介体共价键合于高分子量聚合物从而防止氧化还原介体流出的高分子量氧化还原聚合物。本发明中使用的氧化还原介体为具有氨基或羧基的衍生物，本发明中使用的高分子量聚合物具有羧基或氨基。因此，本发明的高分子量氧化还原聚合物利用氧化还原介体的氨基或羧基与高分子量聚合物的羧基或氨基之间的酰胺键而构成。
作为氧化还原介体，可以使用铁氰化物、二茂铁等各种化合物，但是本发明的吩嗪衍生物的氧化还原电位比0V更为负性(vs.Ag/AgCl饱和KCl)，因此不易受到生物试样中的抗坏血酸(维生素C)、尿酸等杂质的影响，因此可以期待高精度地检测被检物(被分析物(analyte))。
在本发明中，作为具有氨基或羧基的氧化还原介体，可以使用通式(1)所示的吩嗪衍生物。
Figure BDA0002709147580000041
[式中，X–表示阴离子种，R表示在末端具有氨基或羧基的有机基团。]
本发明的通式(1)所示的吩嗪衍生物包括例如通式(2)所示的吩嗪衍生物。
Figure BDA0002709147580000042
[式中，X-表示阴离子种，R1不存在、或者为-O-、-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-，R2为-COOH或-NH2或它们的盐，p、q和s各自独立地为1～15的整数，r为0～30的整数。]
在上述式中，作为阴离子种的X-为选自由卤素离子、含卤素的化合物的离子、氢氧根离子、羧酸根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、乙酸根离子、碳酸氢根离子、磷酸二氢根离子、硫酸氢根离子、烷基磺酸根离子、硫化氢离子、草酸氢根离子、氰酸根离子及硫氰酸根离子组成的组中的任意一种或它们的混合物。
上述R的末端或R2可以为下式所示的羧基与N-琥珀酰亚胺的酯。
Figure BDA0002709147580000051
本发明的吩嗪衍生物的具体例包括例如下式所示的化合物。
1.具有氨基的吩嗪衍生物
Figure BDA0002709147580000052
2.具有羧基的吩嗪衍生物
Figure BDA0002709147580000061
[式中，n表示1～30的整数.]
若利用聚乙二醇链、烃链等接头来延长吩嗪部分与高分子量聚合物主链之间的距离，则氧化还原介体在生物体环境下的热稳定性提高，因此是优选的。
为了提高反应性，可以利用N-羟基琥珀酰亚胺活化上述具有羧基的吩嗪衍生物的羧基。作为一例，包括下式所示的N-羟基琥珀酰亚胺与吩嗪衍生物的酯。上述具有羧基的吩嗪衍生物均与N-羟基琥珀酰亚胺成酯。
Figure BDA0002709147580000071
在本发明中，作为具有羧基或氨基的高分子量聚合物，可以使用例如下述的聚氨基酸、聚亚胺及聚合性丙烯酸酯或由乙烯基形成的聚合物。
1.具有氨基的聚氨基酸
Figure BDA0002709147580000072
2.具有羧基的聚氨基酸
Figure BDA0002709147580000081
3.具有氨基的聚亚胺
Figure BDA0002709147580000091
4.具有氨基的聚乙烯基
Figure BDA0002709147580000092
本发明的高分子量氧化还原聚合物利用具有氨基的吩嗪衍生物与具有羧基的高分子量聚合物的酰胺键、或者具有羧基的吩嗪衍生物与具有氨基的高分子量聚合物的酰胺键而形成。
在本发明的高分子量氧化还原聚合物上，可以通过与上述相同的酰胺键直接或介由聚乙二醇链或烃链等接头进一步共价键合有带电氧化还原酶。
5.蛋白质
另外，在本发明中，作为具有羧基或氨基的高分子量聚合物，可以使用例如牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GOx)等蛋白质。即，本发明的高分子氧化还原聚合物还包括吩嗪衍生物键合于带电氧化还原酶而成的复合体。
将应用本发明的高分子量氧化还原聚合物的嵌入型生物传感器的探头的内部结构的一例示于图3～6，其为例示性图示，而非限定本发明的高分子量氧化还原聚合物的应用对象。
嵌入型生物传感器1包含主体10和探头11，探头11大致呈钥匙形状，包括插入生物体内的传感部分及用于与生物传感器主体10的内部电路电连接的端子部分。传感部分形成得较细，使得可插入体内，端子部分具有一定的大小，使得插入生物传感器主体10而形成电连接。因此，首先准备钥匙形状的绝缘性基板111。
图3示出从表面侧观察而得的俯视图，将图3的A-A’剖切线处的剖面图示于图4。
在绝缘性基板111的两面，通过溅射法、蒸镀法、离子镀等沉积碳或选自由金、银、铂或钯等金属组成的组中的导电性金属材料，由此形成导电性薄膜112。
在形成于绝缘性基板111的表面侧的导电性薄膜112上进行激光描绘，由此形成深达绝缘性基板111的表面的槽113，分离为工作电极引线112a和参比电极引线112b而进行电绝缘。
在绝缘性基板111的两面形成在规定位置具有开口的绝缘性抗蚀膜116a、116b。
在形成于绝缘性基板111的表面侧的抗蚀膜116a的参比电极用的开口处，通过丝网印刷法、喷墨法沉积Ag/AgCl而形成参比电极115。
在工作电极114上，涂布碳粒子等导电性粒子的悬浮液、共价键合有氧化还原介体的高分子量氧化还原聚合物的水溶液、被检物应答性酶等的水溶液并进行干燥，形成包含导电性粒子、被检物应答性酶及氧化还原介体的检测层118。被检物应答性酶也可以共价键合于该高分子量氧化还原聚合物。
在本发明中，“被检物应答性酶”是指可以特异性地催化被检物的氧化或还原的生化物质。只要可以用于生物传感器的检测目的，则任何生化物质均可。例如，在以葡萄糖作为被检物的情况下，相应的被检物应答性酶为葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase；GOx)、葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase；GDH)等。“氧化还原介体”是指介导电子传递的氧化还原物质，在生物传感器中负责传递通过被检物(被分析物)的氧化还原反应而产生的电子。例如，包括吩嗪衍生物等，但不限于此，只要可以用于生物传感器的检测目的，则任何氧化还原物质均可。
可以将传感部分浸渍于包含保护膜用聚合物的溶液而在传感部分的两面、侧面及前端形成保护膜119。
发明效果
本发明的高分子量氧化还原聚合物是氧化还原介体共价键合于高分子量聚合物而成的，因此即使用在嵌入型生物传感器的探头中，氧化还原介体也不会流出到外部，可以防止向外部的流出。不仅可以防止检测灵敏度变差，而且还可以防止对生物体的伤害。
附图说明
图1为示出嵌入型生物传感器被安装于生物体(人体)的状态的概略图。
图2为示出安装于生物体(人体)的状态的嵌入型生物传感器的剖面图。
图3为本发明的一个具体例的嵌入型生物传感器的探头表面侧的俯视图。
图4为图3的A-A’剖切线处的剖面图。
图5为图4的B-B’剖切线处的剖面图。
图6为图4的C-C’剖切线处的剖面图。
图7为使用共价键合有本发明的吩嗪衍生物的高分子量聚合物的传感器的伏安图。
图8为使用共价键合有本发明的吩嗪衍生物的高分子量聚合物的传感器的伏安图。
图9为使用共价键合有本发明的吩嗪衍生物的蛋白质的传感器的伏安图。
图10为作为比较的、使用低分子的吩嗪衍生物的传感器的伏安图。
图11为共价键合有本发明的吩嗪衍生物的高分子量聚合物的吸收光谱。
图12为示出使用共价键合有本发明的吩嗪衍生物的高分子量聚合物的探头的葡萄糖应答特性的图。
图13为示出使用共价键合有本发明的吩嗪衍生物的高分子量聚合物的探头的耐久性的图。
具体实施方式
A.低分子量吩嗪衍生物的合成
上述的具有氨基或羧基的吩嗪衍生物大致可以通过以下的合成路线来合成。
[合成例1：具有氨基的吩嗪衍生物的合成]
使N-烷基化剂作用于1-甲氧基吩嗪，合成例如5-[6-(N-邻苯二甲酰亚胺)己基]-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000121
硝酸盐，接着，使邻苯二甲酰亚胺离去而合成5-(6-氨基己基)-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000122
硝酸盐。选择对应的N-烷基化剂，可合成期望的N-烷基氨基吩嗪
Figure BDA0002709147580000123
盐。
Figure BDA0002709147580000131
[合成例2：具有氨基的吩嗪衍生物的合成]
同样地使N-烷基化剂作用于1-甲氧基吩嗪，合成例如5-{12-[(12-铵基十二烷基)氧基]十二烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000133
二硝酸盐。
Figure BDA0002709147580000132
[合成例3：具有羧基的吩嗪衍生物的合成]
使N-烷基化剂作用于1-甲氧基吩嗪，合成例如5-(4-羧基丁基)-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000134
硝酸盐。进一步合成在末端羧基上添加有N-羟基琥珀酰亚胺而提高了羧基的反应性的5-{[(2,5-二氧代吡啶-1-基)氧基]-5-氧代戊基}-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000135
硝酸盐。选择对应的N-烷基化剂，可以合成期望的N-烷基羧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000136
盐。
Figure BDA0002709147580000141
[合成例4：具有羧基的吩嗪衍生物的合成]
同样地使N-烷基化剂作用于1-甲氧基吩嗪，进一步合成在末端羧基上添加有N-羟基琥珀酰亚胺而提高了羧基的反应性的5-{11-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-11-氧代十一烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000143
硝酸盐。
Figure BDA0002709147580000142
[合成例5：具有羧基的吩嗪衍生物的合成]
同样地使N-烷基化剂作用于1-甲氧基吩嗪，进一步合成在末端羧基上添加有N-羟基琥珀酰亚胺而提高了羧基的反应性的5-{11-[11-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-11-氧代十一烷基氨基]-11-氧代十一烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000144
硝酸盐。
Figure BDA0002709147580000151
B.共价键合有吩嗪衍生物的高分子量氧化还原聚合物的合成
将合成例1～5中合成的吩嗪衍生物、或基于上述合成例合成的各种吩嗪衍生物中的任意一种共价键合于具有羧基或氨基的高分子量聚合物，可以合成高分子量氧化还原聚合物。
[实施例1]
量取6.47mg的合成例2中得到的5-{12-[(12-铵基十二烷基)氧基]十二烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000154
二硝酸盐(Ph-C24-NH3 +)：
Figure BDA0002709147580000152
溶解于乙醇500μL。另行量取11.86mg的通式：
Figure BDA0002709147580000153
所示的聚(L-谷氨酸钠)(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3063；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)1.5mL。另行量取8.8mg水溶性碳二亚胺(WSC)(同仁化学)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)500μL。将上述3种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用磷酸缓冲生理盐水(PBS,pH7.4)作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(AmiconUltra-4 10k；Merck Millipore)进行超滤。通过上述的步骤得到在聚(L-谷氨酸钠)上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PGA-C24-Ph)。
对于得到的PGA-C24-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例2]
量取0.70mg合成例4中得到的5-{11-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-11-氧代十一烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000163
硝酸盐(Ph-C11-Su)：
Figure BDA0002709147580000161
溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)500μL。另行量取3.34mg通式：
Figure BDA0002709147580000162
所示的聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)500μL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。通过上述的步骤得到在聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-C11-Ph)。
对于得到的PLL-C11-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例3]
量取0.6mg合成例3中得到的5-{[(2,5-二氧代吡啶-1-基)氧基]-5-氧代戊基}-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000172
硝酸盐(Ph-C5-Su)：
Figure BDA0002709147580000171
溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)120μL。另行量取5mg聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mM MES缓冲液(pH 6.0)1mL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-C5-Ph_1)。
对于得到的PLL-C5-Ph_1的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例4]
量取2mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)500μL。另行量取3.31mg通式：
Figure BDA0002709147580000181
所示的聚烯丙基胺盐酸盐(SIGMA-ALDRICH，制品编号283215；利用GPC测定得到的重均分子量(PEG换算)Mw～17,500)，溶解于100mM MES缓冲液(pH 6.0)500μL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用磷酸钠缓冲液(pH 6.5)10mM作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-410k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在聚烯丙基胺盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PAA-C5-Ph)。
对于得到的PAA-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用磷酸钠缓冲液(pH 6.5)将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)10mM的测定吸光度而得的值。
[实施例5]
量取2.38mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)1mL。另行量取5mg通式：
Figure BDA0002709147580000191
所示的聚(乙烯亚胺)溶液(SIGMA-ALDRICH，制品编号181978；利用GPC测定得到的数均分子量Mn～60,000、利用LS测定得到的重均分子量Mw～750,000，H2O中50重量％)，溶解于100mM MES缓冲液(pH 6.0)1.5mL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在聚乙烯亚胺上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PEI-C5-Ph)。
对于得到的PEI-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例6]
量取0.91mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)1mL。另行量取8.75mg通式：
Figure BDA0002709147580000201
所示的烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物水溶液(NITTOBO MEDICALPAA-D11-HCL；重均分子量Mw＝100,000,浓度40％、pH(5％溶胶)＝2-3,粘度600mPa·s)，溶解于100mM MES缓冲液(pH 6.0)1.5mL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PAA-DAA-C5-Ph)。
对于得到的PAA-DAA-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例7]
量取2.04mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.0)1mL。另行量取6.88mg通式：
Figure BDA0002709147580000211
所示的烯丙基胺二烯丙基二甲基氯化铵共聚物水溶液(NITTOBO MEDICAL PAA-1123；重均分子量Mw＝18,000,浓度15％、pH(5％溶胶)＝11,粘度14mPa·s)，溶解于100mMMES缓冲液(pH 6.0)1.5mL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 10k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在烯丙基胺二烯丙基二甲基氯化铵共聚物上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PAA-DADMA-C5-Ph)。
对于得到的PAA-DADMA-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例8]
量取0.43mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(pH 7.0)300μL。另行量取0.6mg牛血清白蛋白(BSA)(NACALAI TESQUE商品编号01860-65；普通级，pH7.0)，溶解于100mM HEPES缓冲液(pH7.0)200μL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD MiniTrap G-25(GEHealthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-430k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在BSA上共价键合有吩嗪的蛋白质(BSA-C5-Ph)。
对于得到的BSA-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例9]
量取0.86mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)300μL。另行量取1.37mg葡萄糖脱氢酶(FAD依赖型)(BBI International GDH GLD1)，溶解于100mM HEPES缓冲液(pH7.0)200μL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD MiniTrap G-25(GEHealthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-430k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在葡萄糖脱氢酶上共价键合有吩嗪的蛋白质(GDH-C5-Ph)。
对于得到的GDH-C5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例10]
量取2.78mg合成例5中得到的5-{11-[11-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-11-氧代十一烷基氨基]-11-氧代十一烷基}-1-甲氧基吩嗪-5-
Figure BDA0002709147580000231
硝酸盐(Ph-C22-Su)，溶解于乙醇500μL。另行量取15mg葡萄糖脱氢酶(FAD依赖型)(BBI International GDH GLD1)，溶解于100mM HEPES缓冲液(pH7.0)2mL。将上述两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在葡萄糖脱氢酶上共价键合有吩嗪的蛋白质(GDH-C22-Ph)。
对于得到的GDH-C22-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[比较例1]
量取0.63mg下式：
Figure BDA0002709147580000241
所示的合成例1中得到的5-(6-氨基己基)-1-甲氧基吩嗪
Figure BDA0002709147580000242
硝酸盐(Ph-C6-NH2)，溶解于PBS 500μL，得到Ph-C6-NH2溶液。
对于得到的溶液，利用微孔板(greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96WELLF-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200PRO)进行了测定，结果386nm的吸光度为约11。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例11]
量取2mg合成例3中得到的Ph-C5-Su，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)500μL。另行量取11.33mg聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)500μL。将上述的两种溶液混合，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-C5-Ph_2)。
对于得到的PLL-C5-Ph_2的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整到0.52～0.57的范围。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例12]
量取2mg合成例1中得到的Ph-C6-NH2，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取1.8mg Acid-PEG5-NHS酯(BROADPHARM)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。将上述的两种溶液混合，一边在室温下搅拌一边进行反应约20小时，得到包含下式：
Figure BDA0002709147580000251
所示的键合有PEG链的吩嗪
Figure BDA0002709147580000252
硝酸盐的溶液A。另行量取11.02mg聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取4mg水溶性碳二亚胺(WSC)(同仁化学)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)100μL。向溶液A中依次混合上述的聚(L-赖氨酸)盐酸盐、WSC溶液，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在添加有5单元乙二醇的聚乙二醇(PEG)链的聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-PEG5-Ph)。
对于得到的PLL-PEG5-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整到0.52～0.57的范围。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例13]
量取2mg合成例1中得到的Ph-C6-NH2，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取3.26mg Acid-PEG13-NHS酯(BROADPHARM)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。将上述的两种溶液混合，一边在室温下搅拌约20小时一边进行反应，得到包含下式：
Figure BDA0002709147580000261
所示的键合有PEG链的吩嗪
Figure BDA0002709147580000262
硝酸盐的溶液B。另行量取11.02mg聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取4mg水溶性碳二亚胺(WSC)(同仁化学)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)100μL。向溶液B中依次混合上述的聚(L-赖氨酸)盐酸盐、WSC溶液，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在添加有13单元乙二醇的聚乙二醇(PEG)链的聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-PEG13-Ph)。
对于得到的PLL-PEG13-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整到0.52～0.57的范围。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
[实施例14]
量取2mg合成例1中得到的Ph-C6-NH2，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取5.44mg Acid-PEG25-NHS酯(BROADPHARM)，溶解于100mM MES缓冲液(pH6.0)300μL。将上述的两种溶液混合，一边在室温下搅拌一边进行反应约20小时，得到包含下式：
Figure BDA0002709147580000271
所示的键合有PEG链的吩嗪
Figure BDA0002709147580000281
硝酸盐的溶液C。另行量取11.02mg聚(L-赖氨酸)盐酸盐(PEPTIDE INSTITUTE,INC.Code 3075；M.W.>12000,通过透析而截留)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)300μL。另行量取4mg水溶性碳二亚胺(WSC)(同仁化学)，溶解于100mMMES缓冲液(pH6.0)100μL。向溶液C中依次混合上述的聚(L-赖氨酸)盐酸盐、WSC溶液，在室温下一边搅拌一边进行反应4小时。
将反应溶液供于使用PBS作为洗脱缓冲液的利用PD-10柱(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱。将凝胶过滤后的溶液用离心式超滤器(Amicon Ultra-4 30k；Merck Millipore)进行超滤。
通过上述的步骤得到在添加了25单元乙二醇的聚乙二醇(PEG)链的聚(L-赖氨酸)盐酸盐上共价键合有吩嗪的高分子量聚合物(PLL-PEG25-Ph)。
对于得到的PLL-PEG25-Ph的溶液，一边通过微孔板(greiner bio-one UV-STARMICROPALLETE 96WELL F-BODEN)及酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)进行测定，一边用PBS将386nm的吸光度调整到0.52～0.57的范围。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。
C.评价试验
(1)介体流出性
使用恒电位仪(BAS株式会社)，以使用金电极作为工作电极及对电极、使用Ag/AgCl(饱和氯化钾)(BAS株式会社)作为参比电极的三电极式以10mV/秒的扫描速度进行循环伏安法。
在工作电极上分别涂布10μL的实施例1～7中得到的各种键合有吩嗪衍生物的高分子氧化还原聚合物的溶液，进行干燥。
在工作电极上涂布0.6μL科琴黑悬浮液，干燥约10分钟。然后涂布0.6μL实施例8～10中得到的各种键合有吩嗪衍生物的蛋白质的溶液，干燥约1小时。
在工作电极上涂布10μL比较例1中得到的Ph-C6-NH2溶液，进行干燥。
将这些电极浸渍于PBS，在初始电位下静止10秒钟后开始电位的扫描。将得到的循环伏安图示于图7～9。
使用比较例1的低分子量吩嗪衍生物Ph-C6-NH2的电极在第3个循环中氧化峰基本消失，另一方面，使用实施例1～7中得到的各种键合有吩嗪衍生物的高分子氧化还原聚合物的电极在3个循环后也维持了氧化峰，使用实施例8～10中得到的各种键合有吩嗪衍生物的蛋白质的电极在5个循环后也维持了氧化峰。
这表明，低分子量的吩嗪衍生物从电极流出，但通过键合于高分子量的聚合物或蛋白质，从电极的流出得到抑制。
(2)介体保存稳定性
对于实施例11～14中得到的高分子量氧化还原聚合物，在合成初始以及在37℃下保管1天及3天后测定吸收光谱。测定时，将各高分子量氧化还原聚合物溶液100μL分注到微孔板(greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96WELL F-BODEN)中，利用酶标仪(TECANinfinite M200 PRO)进行测定。另外，吸光度使用减去作为空白值的PBS的测定吸光度而得的值。将得到的吸收光谱示于图11。
由280nm及385nm附近的吸收峰的变化可知，与PLL-C5-Ph_2相比，随着PEG链延长，吸收峰的变化变少。
这表明，通过延长吩嗪部分与聚合物主链之间的距离，氧化还原介体在生物体内环境中的热稳定性提高。
(3)探头特性的测定
对利用以下的组成及步骤制作在金电极上的传感器的葡萄糖应答性及耐久性进行评价。
<溶液制备>
(a)酶/介体溶液
将葡萄糖脱氢酶(FAD依赖型)(BBI International GDH GLD1)、戊二醛20％溶液(和光纯药工业株式会社制)及与实施例14同样合成的PLL-PEG25-Ph的各试剂混合，使得达到以下的终浓度，反应约2小时。
[表1]
试剂名 终浓度
GDH GLD1 20000U/mL
PLL-PEG25-Ph 386nm的吸光度相当于3.1
戊二醛 0.01％
(b)碳微粒悬浮液
将科琴黑EC600JD(Lion Specialty Chemicals Co.，Ltd)悬浮于MiliQ水，使得达到2mg/mL，用超声波匀化器处理10分钟以上。另外，当制备悬浮液后经过数小时的情况下，在使用前再次用超声波匀化器处理约10分钟。
(c)保护膜用聚合物溶液
将聚(4-乙烯基吡啶)(Mw＝160,000)(SIGMA-ALDRICH)[P4VP]溶解于乙醇，使得达到10％(重量/体积)，由此制备P4VP乙醇溶液。
<制作传感器>
将0.5μL科琴黑悬浮液涂布在金工作电极上，干燥约5分钟。进一步重复进行2次涂布和干燥，进行共计3次科琴黑悬浮液的涂布。涂布反应2小时后的酶/介体溶液0.5μL，干燥约30分钟。进一步浸渍于P4VP乙醇溶液，干燥10分钟后再次进行浸渍，干燥30分钟以上，形成保护膜，由此制作传感器。
<电化学测定>
使用恒电位仪(BAS株式会社)，以将上述的传感器作为工作电极、将金电极作为对电极、将Ag/AgCl(饱和氯化钾)(BAS株式会社)作为参比电极的三电极式，将制作的传感器浸渍于PBS而进行使用电流时间曲线法(Amperometric i-t curve)的测定。从测定开始1000秒后起，每隔500秒添加葡萄糖，使得达到50、150、300、500mg/dL，持续地测定电流应答值。测定后将传感器保存在37℃的PBS中，在保存1天后、保存3天后也同样地进行测定。将测定结果分别示于图12及13，并汇总于表2。
[表2]
Figure BDA0002709147580000311
在葡萄糖浓度为0～500mg/dL时显示高的直线性，葡萄糖应答性良好。
在37℃下保存3天后，在葡萄糖浓度为0～500mg/dL时也显示高的直线性，与初始的应答相比未见电流值减少，耐久性良好。
产业上的可利用性
若使用本发明的高分子量氧化还原聚合物，则由于氧化还原介体共价键合于高分子量聚合物主链而使生物传感器的探头维持或提高应答性及耐久性、并且可以防止构成检测层的氧化还原介体的流出。因此，本发明的高分子量氧化还原聚合物尤其在嵌入型生物传感器中有用。
符号说明
1 嵌入型电化学式葡萄糖传感器
10 主体
11 探头
111 绝缘性基板
112 导电性薄膜
112a 工作电极引线
112b 参比电极引线
112c 对电极引线
113 槽
114 工作电极
115 参比电极
116 绝缘性抗蚀膜
117 对电极
118 检测层
119 保护膜
2 生物体

Claims (13)

1.一种传感器，其为对试样中所含的被检物进行检测或定量的传感器，其中，至少包含通式(1)所示的吩嗪衍生物和被检物应答性酶，
Figure FDA0002709147570000011
式中，X-表示阴离子种，R表示在末端具有氨基或羧基的有机基团。
2.根据权利要求1所述的传感器，其中，
通式(1)所示的吩嗪衍生物为通式(2)所示的吩嗪衍生物，
Figure FDA0002709147570000012
式中，X-表示阴离子种，R1不存在、或者为-O-、-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-，R2为-COOH或-NH2或它们的盐，p、q和s各自独立地为1～15的整数，r为0～30的整数。
3.根据权利要求1所述的传感器，其中，
通式(1)所示的吩嗪衍生物选自由
Figure FDA0002709147570000021
所示的具有氨基的吩嗪衍生物组成的组、或者选自由
Figure FDA0002709147570000022
Figure FDA0002709147570000031
所示的具有羧基的吩嗪衍生物组成的组，式中，n表示1～30的整数。
4.根据权利要求1所述的传感器，其中，所述被检物为葡萄糖，所述被检物应答性酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。
5.一种高分子量氧化还原聚合物，其为通式(1)所示的吩嗪衍生物共价键合于分子内包含羧基或氨基的高分子量聚合物而成的高分子量氧化还原聚合物，其中，吩嗪衍生物利用所述吩嗪衍生物的氨基或羧基与所述高分子量聚合物的羧基或氨基的酰胺键而共价键合于高分子量聚合物，
Figure FDA0002709147570000032
式中，X-表示阴离子种，R表示在末端具有氨基、或羧基、或羧基与N-琥珀酰亚胺的酯的有机基团。
6.根据权利要求5所述的高分子量氧化还原聚合物，其中，
通式(1)所示的吩嗪衍生物为通式(2)所示的吩嗪衍生物，
Figure FDA0002709147570000041
式中，X-表示阴离子种，R1不存在、或者为-O-、-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-，R2为-COOH或-NH2或它们的盐或下式：
Figure FDA0002709147570000042
所示的羧基与N-琥珀酰亚胺的酯，p、q和s各自独立地为1～15的整数，r为0～30的整数。
7.根据权利要求5所述的高分子量氧化还原聚合物，其中，
通式(1)所示的吩嗪衍生物选自由
Figure FDA0002709147570000043
所示的具有氨基的吩嗪衍生物组成的组、或者选自由
Figure FDA0002709147570000051
所示的具有羧基的吩嗪衍生物组成的组，式中，n表示1～30的整数。
8.根据权利要求7所述的高分子量氧化还原聚合物，其中，所述具有羧基的吩嗪衍生物的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺酯化。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的高分子量氧化还原聚合物，其进一步共价键合有被检物应答性酶。
10.根据权利要求9所述的高分子量氧化还原聚合物，其中，所述被检物应答性酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。
11.一种传感器，其为对试样中所含的被检物进行检测或定量的传感器，其中，至少包含权利要求5～10中任一项所述的高分子量氧化还原聚合物和被检物应答性酶。
12.根据权利要求11所述的传感器，其中，所述被检物为葡萄糖，所述被检物应答性酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。
13.根据权利要求12所述的传感器，其中，所述被检物应答性酶共价键合于高分子量氧化还原聚合物。
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