CN111909892A - 一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法，能确保小鼠胚胎干细胞在此种培养条件下长期处于自我更新状态且具有多能性。本发明所述的培养基组成成份为小鼠胚胎干细胞基础培养基，含10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L‑Glutamin，0.1mMβ‑巯基乙醇和1mM丙酮酸钠，同时添加Spautin‑1+PD0325901或Spautin‑1+CHIR99021任意组合。与传统添加LIF培养基相比，本发明的新型培养条件减少了外源性动物源性细胞因子的添加，且能达到稳定的培养效果。本发明所摸索出的培养条件，可以为改善和提高目前小鼠胚胎干细胞，同时为优化他种类型的干细胞的培养条件提供了线索。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)来源于植入前囊胚期的内细胞团，体积小，形态与早期胚胎细胞相似，细胞核大，在体外抑制分化培养，细胞排列紧密，细胞边缘清晰，呈集落状生长。在体外培养条件下能够无限增殖(自我更新)，且在一定条件下能够被诱导分化为神经细胞、造血干细胞、内皮层细胞等几乎所有细胞类型(多能性)。因此，胚胎干细胞常作为研究动物细胞组织分化、胚胎发生、细胞信号网络调控等发育生物学基础研究的一个非常有用的工具。胚胎干细胞体外培养条件下的自我更新能力保证了干细胞研究和应用所需要的大量细胞，而多能性扩展了干细胞在多领域的应用前景和价值。小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs，mESCs)是最早建立的干细胞系，小鼠与人胚胎干细胞(human ESCs，hESCs)拥有众多的相似之处，常作为人类疾病研究的良好模型，解决了研究人胚胎干细胞所带来的伦理道德问题。但人胚胎干细胞体外培养的工序繁琐，成本较高，是目前所要解决的难题。而小鼠胚胎干细胞的体外培养需要特定的营养物质和众多细胞因子的参与，若无这些因子细胞会出现分化现象，从而失去自我更新和多向分化的潜能。所以以小鼠胚胎干细胞为模型，筛选有利于胚胎干细胞体外维持的条件，特别是无动物血清成份的因素(如小分子化合物)，将有助于优化当前不同哺乳动物胚胎干细胞体外维持未分化状态的培养条件。前期我们发现小分子Spautin-1可以促进小鼠胚胎干细胞自我更新的状态，这将为避免小鼠胚胎干细胞在培养过程中出现分化问题提供了一个新途径。
Spautin-1小分子是一种细胞自噬抑制剂，抑制泛素特异性肽酶10(USP10)和USP13的活性.。前期有研究发现Spautin-1通过抑制细胞自噬作用，增强了几种癌症的靶向治疗和传统化学放疗的抗癌活性，因此可以作为一种新型药物，对某些癌症具有潜在治疗意义。
将Spautin-1小分子加入小鼠胚胎干细胞的培养体系，我们发现Spautin-1在最适浓度下，能够在不添加一些细胞因子的条件下短暂地促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。进一步研究发现，仅使用Spautin-1和CHIR99021两种小分子组合或Spautin-1和PD0325901两种小分子组合均可促进小鼠胚胎干细胞自我更新，作为一种干细胞培养的新因素，有望优化未来其他哺乳动物或其他类型干细胞的体外培养条件。
发明内容
本发明所要解决的发现小鼠胚胎干细胞新的培养条件，提供一种小分子在促进小鼠胚胎干细胞自我更新中的应用方法，从而为其他动物的胚胎干细胞培养提供新的策略。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是在含有10％FBS基础上，摸索Spautin-1最适培养浓度，通过加入Spautin-1与CHIR99021两种小分子组合或者Spautin-1与PD0325901两种小分子组合来促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。
本发明的具体操作，包括以下步骤：
(1)取1.5ml 0.1％浓度的明胶包细胞培养板，置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱，包板30min；
(2)取生长密度在70-80％的小鼠胚胎干细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤一次，除去残留的培养液；
(3)加入1ml 0.1％浓度的胰蛋白酶，消化细胞2min左右，细胞边缘浮起，用微量移液器吹打细胞，吸取细胞悬液，转移至盛有2ml DMEM血清培养液的15ml离心管中，继续吹打混匀，终止消化；
(4)1000rpm，离心3min后，弃去上清，加入2ml DMEM培养液重悬细胞，利用细胞计数板仪计数，并以此计算出细胞密度；
(5)取出包好的培养板，弃去明胶，向培养板中加入2ml DMEM培养液，DMEM培养液包括：10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mM β-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100μg的链霉素；
(6)向两组培养板中分别加入4×105个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
(7)向其中一组细胞培养板中分别加入1μM、2μM、3μM、4μM浓度Spuatin-1处理细胞，水平十字形晃动，使其混合均匀；
(8)向另一组细胞培养板中分别添加2μM Spautin-1+3μM CHIR99021小分子组合，以及2μM Spautin-1+1μM PD0325901小分子组合，水平十字形晃动，使其混合均匀；
(9)将细胞培养皿置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱内培养。
细胞自我更新状态检测：
(1)形态观察，使用Leica DMIL倒置显微镜分别对添加不同浓度Spautin-1进行处理的小鼠胚胎干细胞进行观察，结果显示不添加外源性小分子的细胞发生了分化，虽然添加不同浓度Spuatin-1能够促进小鼠胚胎干细胞的自我更新，但低于2μM浓度时干细胞分化较多，而高于这一浓度细胞发生了凋亡，所以选择2μM作为最佳处理浓度。
(2)使用Leica DMIL倒置显微镜分别对负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)以及实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)、实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)的细胞形态进行观察，发现对照组中不添加小分子的细胞已经完全分化，仅添加Spautin-1小分子的细胞出现部分分化；与对照组相比实验组A和B的细胞边缘清晰，细胞之间堆叠紧密，细胞呈自我更新的状态；。
本发明具有如下优点：
(1)本发明采用在含有10％FBS的DMEM培养基中加入Spautin-1和CHIR99021两种小分子组合或Spautin-1和PD0325901两种小分子组合来培养小鼠胚胎干细胞，在此种培养条件下，细胞生长情况良好，能够维持自我更新的状态。
(2)与传统的添加白血病抑制因子(LIF)培养条件相比，本发明具有更加稳定的培养效果，可以使细胞维持在最佳的生长状态，简化操作流程，且避免了动物源性因子的使用，利于基础和应用研究的开展。
(3)与现有的干细胞培养体系相比，本发明简化了细胞培养体系中细胞因子的添加种类，有利于后续细胞内相关信号通路与分子调控机制深入研究。
(4)本发明所摸索出的培养条件，可以为改善和提高目前小鼠胚胎干细胞以及其他种类干细胞的培养条件提供线索。
附图说明
图1所示为添加不同浓度Spautin-1进行处理的P24代小鼠胚胎干细胞形态观察，左侧为不添加外源性小分子的细胞，细胞发生了分化；右侧为依次添加1μM、2μM、3μM、4μM浓度Spuatin-1小分子处理的细胞，添加不同浓度Spuatin-1能够促进小鼠胚胎干细胞的自我更新，但低于2μM浓度时干细胞分化较多，而高于这一浓度细胞发生了凋亡，所以选择2μM作为最佳处理浓度。
图2所示为三种培养条件下P24代小鼠胚胎干细胞的形态图，其中左侧为不添加这两种因子条件下培养的细胞，细胞出现严重分化；在单加Spautin-1小分子条件下培养的细胞，细胞较左边相比，只出现部分分化；加入Spautin-1和CHIR99021两种小分子或者Spautin-1和PD0325901两种小分子的条件下培养的细胞，均处于自我更新的状态。
具体实施方式
实施例
实验中所用的小鼠胚胎干细胞由美国南加州大学提供。
Spautin-1促进小鼠胚胎干细胞自我更新最佳浓度摸索，以及Spautin-1和CHIR99021两种小分子组合或者Spautin-1和PD0325901两种小分子组合的条件下的培养与传代：
(1)取1.5ml 0.1％浓度的明胶包细胞培养板，置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱，包板10-20min；
(2)取生长密度在70-80％的小鼠胚胎干细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤一次，除去残留的培养液；
(3)加入1ml 0.1％浓度的胰蛋白酶，消化细胞2min左右，至细胞边缘浮起，用微量移液器吹打细胞，吸取细胞悬液，转移至盛有2ml DMEM血清培养液的15ml离心管中，继续吹打混匀，终止消化；
(4)1000rpm，离心3min后，弃去上清，加入2ml DMEM培养液重悬细胞，利用细胞计数板计数，并以此计算出细胞密度；
(5)取出包好的培养板，弃去明胶，向培养板中加入2ml DMEM培养液，其中包括：10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mM β-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100μg的链霉素；
(6)向两组培养基中分别加入4×105个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
(7)向其中一组细胞培养板中分别加入1μM、2μM、3μM、4μM浓度Spuatin-1小分子处理的细胞，设置不添加小分子空白对照，水平十字形晃动，使其混合均匀；
(8)向另一组细胞培养板中分别添加2μM Spautin-1+3μM CHIR99021小分子组合为实验组A，以及2μM Spautin-1+1μM PD0325901小分子组合为实验组B，设置的正对照组仅加入2μM Spautin-1和负对照组不加入Spautin-1和CHIR99021两种小分子，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
(9)将细胞培养板置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱内培养。
细胞自我更新状态检测：
(1)形态观察，使用Leica DMIL倒置显微镜分别对添加不同浓度Spautin-1进行处理的小鼠胚胎干细胞进行观察，结果显示不添加外源性小分子的细胞发生了分化，虽然添加不同浓度Spuatin-1能够促进小鼠胚胎干细胞的自我更新，但是低于2μM浓度时干细胞分化较多，而高于这一浓度细胞发生了凋亡，所以选择2μM作为最佳处理浓度，如图1所示。
(2)形态观察，使用Leica DMIL倒置显微镜分别对负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)以及实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)、实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)的细胞形态进行观察，发现与对照组相比实验组A和B的细胞边缘清晰，细胞之间堆叠紧密，符合自我更新的状态；对照组中不添加小分子的细胞已经完全分化，仅添加Spautin-1小分子的细胞出现部分分化，如图2所示。
(3)碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)染色检测自我更新状况，具体方法如下：
a、正、负对照组和实验组接种适量的细胞，培养一定时间后即可进行AP染色；
b、按照AP染色试剂盒说明配制BCIP/NBT染色工作液；
c、弃去细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤3-5次，每次3-5min，加入500μl 4％的多聚甲醛固定细胞1-2min，弃去固定液，再用PBS洗涤3-5次，每次3-5min；
d、最后一次洗涤完毕后，去除PBS洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品；
e、室温避光孵育30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅；
f、去除BCIP/NBT染色工作液，用PBS洗涤1-2次即可终止显色反应；
g、最后加入适量PBS后，将培养板放在Leica DMIL倒置显微镜观察负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)与实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)和实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)细胞染色情况，判断细胞自我更新状态。
如图2所示，小鼠胚胎干细胞的着色情况，负对照组细胞显示无色，说明已经分化；正对照组细胞仅有少量红色，说明细胞部分分化；实验组A和B的细胞被染成大面积红色，符合自我更新的特点。
Claims (6)
1.一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新状态中的应用方法，其特征在于，在含有10％FBS的DMEM培养基中，加入Spautin-1小分子来维持小鼠胚胎干细胞自我更新的状态。
2.根据权利1所述的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎干细胞在Spautin-1小分子条件下的传代和培养：
(1)取1.5ml 0.1％浓度的明胶包细胞培养板，置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱，包板30min；
(2)取生长密度在70-80％的P24代小鼠胚胎干细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤一次，除去残留的培养液；
(3)加入1ml 0.1％浓度的胰蛋白酶，消化细胞2min左右，至细胞边缘浮起，用移液器吹打细胞，吸取细胞悬液，转移至盛有2ml DMEM血清培养液的15ml离心管中，继续吹打混匀，终止消化；
(4)1000rpm，离心3min后，弃去上清，加入2ml DMEM培养液重悬细胞，利用细胞计数板计数，并以此计算出细胞密度；
(5)取出包好的培养板，弃去明胶，向培养板中加入2ml DMEM培养液；
(6)向两组细胞培养板中分别加入4×105个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
(7)向其中一组细胞培养板中分别加入1μM、2μM、3μM、4μM浓度Spuatin-1小分子处理的细胞，水平十字形晃动，使其混合均匀；
(8)向另一组细胞培养板中分别添加2μM Spautin-1+3μM CHIR99021小分子组合，以及2μM Spautin-1+1μM PD0325901小分子组合，水平十字形晃动，使其混合均匀；
(9)将细胞培养皿置于37℃、5％CO2浓度的细胞培养箱内培养。
3.根据权利要求2中(7)所述的方法，其特征在于，加入的Spautin-1小分子为2μM时，为促进小鼠胚胎干细胞自我更新的最佳处理浓度。
4.根据权利要求2中(8)所述的方法，其特征在于，加入Spautin-1与CHIR99021两种小分子组合或Spautin-1与PD0325901两种小分子组合均能够维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。
5.根据权利要求1所述一种小分子在促进小鼠胚胎干细胞自我更新状态中的应用方法，其特征在于，细胞自我更新状态与细胞特性检测方法如下：
(1)形态观察，使用Leica DMIL倒置显微镜分别对添加不同浓度Spautin-1进行处理的小鼠胚胎干细胞进行观察选择最佳培养浓度；
(2)使用Leica DMIL倒置显微镜分别对负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)以及实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)、实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)的细胞形态进行观察；
(3)碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)染色检测自我更新状况，具体方法如下：
a、正、负对照组和实验组接种适量的细胞，培养一定时间后即可进行AP染色；
b、按照AP染色试剂盒说明配制BCIP/NBT染色工作液；
c、弃去细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤3-5次，每次3-5min，加入500μl 4％的多聚甲醛固定细胞1-2min，弃去固定液，再用PBS洗涤3-5次，每次3-5min；
d、最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖细胞；
e、室温避光孵育30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅；
f、去除BCIP/NBT染色工作液，用PBS洗涤1-2次即可终止显色反应；
g、最后加入适量PBS后，将培养板放在Leica DMIL倒置显微镜观察负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)与实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)和实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)细胞染色情况，判断细胞自我更新状态。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DMEM包括以下组分：10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100μg的链霉素。
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| WO2012079079A1 (en) * | 2010-12-10 | 2012-06-14 | President And Fellows Of Harvard College | Production of induced pluripotent stem cells |
| CN110724664A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-01-24 | 安徽大学 | 一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法 |
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2020
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