CN1119017A - 含有5-烷基-、5-(1-链烯基)-和5-(1-炔基)嘧啶的低聚脱氧核苷酸及含有这类化合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种12到30个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，其中含有至少一个5-取代的嘧啶碱基(尿嘧啶或胞嘧啶)，该5-取代基是一个C3-14正烷基、C2-8(E)-正-1-链烯基、乙炔基或C4-12正-1-炔基。本发明的低聚脱氧核苷酸可以与互补核酸形成双螺旋，与未改性的低聚脱氧核苷酸相比，显示出不变或增高的稳定性、大大提高的对抗3′-核酸外切酶的稳定性以及大大增加的疏水性，被细胞的吸收要好得多。用这种方式，它们可以有效地作为防治各种肿瘤和病毒(包括艾滋病毒)的药物使用。

Description

含有5-烷基-、5-(1-链烯基)-和5-(1-炔基)嘧啶 的低聚脱氧核苷酸及含有这类化合物的药物组合物
本发明涉及含有5-烷基-、5-(1-链烯基)-和5-(1-炔基)嘧啶的低聚脱氧核苷酸及含有这类化合物的药物组合物。另外，本发明还涉及一种制备这类化合物及组合物的方法。
更具体地说，本发明涉及一种可用于治疗的12到30个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，它含有至少一个5-取代的嘧啶碱(尿嘧啶或胞嘧啶)，其中的5-取代基是C3-14正烷基、C2-8(E)-正-1-链烯基、乙炔基或C4-12正-1-炔基。
已知低聚核苷酸能通过形成三螺旋与双股DNA顺序特异性结合，通过形成双螺旋与单股DNA顺序特异性结合，从而调节基因表达。通过与在外源病原体(如病毒、真菌或细菌)或内源病原体(如致癌基因)的生物合成中涉及到的双股DNA的特定区域相结合，DNA的特定区域的转录作用因形成三螺旋而被抑制。这称为反基因作用。
由于低聚核苷酸通过与RNA、信使RNA(mRNA)或病毒RNA的特定区域形成双螺旋而产生的对基因表达的抑制作用称作反义的抑制作用。以这种方式发挥作用的低聚核苷酸称为反义的低聚核苷酸。对mRNA的表达的反义抑制意味着转译抑制，即，抑制蛋白质合成。病毒RNA表达的反义抑制意味着对RNA复制的抑制或逆转录，如艾滋病毒的情形。常规的药物与靶分子(通常是像酶这样的生物高分子)以2-3个键结合，而反义的低聚核苷酸与靶物RNA则在反义的低聚核苷酸所包含的单体单元(称作核苷酸)一样多的部位上以2-3个氢键结合。这是反义的低聚核苷酸具有异常高的选择性的基础。为了用于治疗，这种反义的低聚核苷酸应具有以下性质：
i)能有效地穿过细胞膜以便在靶细胞内达到适当的浓度，以后称作细胞摄入；
ii)在血清和细胞内对核酸酶的降解作用高度稳定，以后称作核酸酶稳定性；
iii)能与细胞内的靶物RNA的确定区域以顺序特异性的方式形成稳定的双螺旋，此后称作双螺旋稳定性。
根据文献资料，这些性质不能由天然核苷酸组成的反义低聚核苷酸得到。因此，必须对低聚核苷酸进行化学改性以满足以上要求。化学改性可以在低聚核苷酸的核苷酸单元三个组分中的任一个上进行(示意1)：
i)杂环碱
ii)糖部分，或
iii)磷酸二酯键。
已经提到过许多种磷酸二酯键的改性(示意1)：
         示意11.X＝O；Y＝S2.X＝Y＝S3.X＝O；Y＝NH－R4.X＝O；Y＝烷基
在这些改性方案中，标号1的那种应用最广泛。所有以上的改性都增加核酸酶稳定性，但在大多数情形它们会减小低聚脱氧核苷酸的双螺旋稳定性。除了化合物2以外，非桥连的氧的取代造成了手性磷原子。理论上可能存在的非对映体数目是2n，其中n是低聚核苷酸中的核苷酸数目(E.Uhlman&A.Peyman：Chem.Rev.1990，90，543-583)。
在Antisense Research and Development 1991，1，66-112；1992，2，64-107；以及E.Uhlman&A.Peyman：Chem.Rev.1990，90，543-583中可以查到对至今发表的化学改性的全面收集。根据这些文献资料，只有很少数嘧啶碱的化学改性中胞嘧啶的5-溴和5-甲基取代提高了双螺旋稳定性，但是不提高核酸酶稳定性(P.Dan Cook，Anti-Cancer Drug Design1991，6，585-607；O.Kemal et al.，Nucleosides&Nucleotides，1991，10，555-561)。用一个(4-氨基丁氨基)甲基代替胸腺嘧啶的5-甲基和进行胸腺嘧啶的6-氮杂取代提高了核酸酶稳定性，但降低了双螺旋稳定性(T.Takeda等，Chem.Dharm.Bull.1987，35，3558-3567；Y.S.Sanghvi等，Nucleosides&Nucleotides1991，10，345-6)。
根据近来公开的结果，如果用5-(1-丙炔基)尿嘧啶或5-(1-丙炔基)胞嘧啶分别代替胸腺嘧啶或胞嘧啶，结合到低聚脱氧核苷酸中，则与互补RNA低聚物的双螺旋稳定性增加(B.C.Froehler等，Tetrahedron Letters 1992，33，5307-5310)。虽然这种改性也将核酸酶稳定性提高了很小程度，但这一增加比用硫代磷酸酯改性的低聚脱氧核苷酸(上述改性方案1)所观察到的小几个数量级。嘧啶的5-(1-丙炔基)取代几乎不能提高与细胞摄入密切有关的低聚脱氧核苷酸的疏水性。
本发明的目的是合成出具有不变或增高的双螺旋稳定性、大大提高的核酸酶稳定性、强烈增加的疏水性和细胞摄入性的低聚脱氧核苷酸。
本发明以下述的认识为根据，即，如果12-30个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸中至少一个核苷酸单元含有一个5-取代的嘧啶碱，其中的5-取代基是C3-14正烷基、C2-8(E)-正-1-链烯基、乙炔基或C4-12正-1-炔基，则低聚脱氧核苷酸具有不变的或提高的双螺旋稳定性、大大增强的核酸酶稳定性以及强烈增加的疏水性和细胞摄入性。
根据以上论述，本发明涉及由12到30个单体单元组成的低聚脱氧核苷酸，它含有至少一个5-取代的嘧啶碱(尿嘧啶或胞嘧啶)，其中该5-取代基是C3-14正-烷基、C2-8(E)-正-1-链烯基、乙炔基或C4-12正-1-炔基。
在本发明的一组优选的化合物中，一个或多个磷酸二酯部分用硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯部分代替。
根据本发明的另一组优选的化合物中，一个或多个磷酸二酯部分被R-或S-构型的硫代磷酸酯代替。
根据本发明的一组化合物中嘧啶碱是一个5-取代的尿嘧啶，其中的5-取代基是一个C3-14正-烷基、C2-4(E)-正-1-链烯基或C5-8正-1-炔基，它们也具有优越的性质。
根据本发明的又一组优选的化合物含有一个5-取代的胞嘧啶作为嘧啶碱，其中的5-取代基是一个C3-14正烷基、C2-4(E)-正-1-链烯基或C5-8正-1-炔基。
以下实验证实了本发明化合物的优越性质。双螺旋稳定性
一个反义的低聚脱氧核苷酸(低聚的DNA)应当能与细胞内的靶RNA的确定区域形成稳定的双螺旋。这称作DNA-RNA杂化的双螺旋。一个DNA-RNA杂化双螺旋一般比DNA-DNA双螺旋更稳定。我们选择了自补顺序的脱氧低聚核苷酸(即DNA-DNA双螺旋)作为双螺旋稳定性实验的模型低聚核苷酸。
除了其它因素以外，核酸双螺旋的结构稳定性还与温度有关。因此，双螺旋的稳定性最常用双螺旋对热诱发的变性或热变性的稳定性来表征。核酸溶液的紫外光密度取决于核酸的二极结构，即，取决于核酸是双螺旋还是变性的无规线团。按这种方式，可以用从紫外光密度随温度变化图或是从核酸溶液的解链型式得到的参数表征双螺旋稳定性。
我们的双螺旋稳定性试验结果列在表1至表7。
由解链型式可以得到的最重要的数据是热转变曲线的中点，称为Tm(℃)。Tm是50％的双螺旋变成无规线团(即变性)时的温度。用聚脱氧核苷酸或DNA，Tm可重复在0.1℃以内；用低聚脱氧核苷酸，则在1℃之内。表中列出的第二种数据是热诱发的指定波长下摩尔消光系数的增加或热增色性(H260或H280)。这提供了对于可变性的量度，因此与未变性的双螺旋的螺旋含量有关。更具体地说，H值是指定波长下核酸溶液光密度的增加百分数。第三个参数是dT，它是在25％到75％的H值之间的温度范围。dT值表征了热转变的协同性，它与转变机制有关。对于天然的聚脱氧核苷酸，dT小于1℃。对于低聚脱氧核苷酸双螺旋体，dT高于5℃。
核酸的双螺旋稳定性还与溶液的离子强度有关。本发明化合物的双螺旋稳定性试验在离子强度接近生理血清条件的缓冲液中进行。在特殊情形还使用了在两个方向上与这些离子条件不同的缓冲液：
1.生理缓冲液：0.1M NaCl，20mM磷酸钠(pH7.2)，2mMMgCl2；
2.高盐缓冲液，用来测定含腺嘌呤-胸腺嘧啶及类似物的低稳定性低聚脱氧核苷酸的双螺旋稳定性：0.5M NaCl，20mMTris·HCl(pH7.5)，10mM MgCl2；
3.低盐缓冲液，用来测定含鸟嘌呤-胞嘧啶及类似物的高度稳定的低聚脱氧核苷酸的双螺旋稳定性：10mM缓冲的Na+，pH7.6。
热解链型式是在一台Hewlett-Packard HP8452 A二极管组分光光度计上测定，光度计经过一个AD卡与一台IBM兼容的AT386计算机接口。用换能器将池座加热。为此目的编制的软件“Absorbe”(CheMicro公司，Budapest)调节低聚脱氧核苷酸溶液在一只1cm光程、体积0.7ml的池内线性升温，一般是速度为0.5℃/分，收集吸收数据和用铂探头测得的池内温度数据，完成表征热转变的参数的计算。Tm由平滑化的吸收随温度变化曲线的一阶导线计算。低聚脱氧核苷酸浓度是1.0+/-0.1光密度单位(在260nm)/ml。表中列出的数据是至少两次测量的平均值。
表1
本发明的低聚脱氧核苷酸5′-(正烷基5dU-dA)10-3′的双螺旋稳定性
低聚脱氧核苷酸    高盐缓冲液      生理缓冲液
              Tm   H260   dT    Tm   H260    dT
             (℃)   (％)   (℃)  (℃)   (％)    (℃)(丙基5dU-dA)10  40.7   25.0   15.2   34.9   25.2   12.7(丁基5dU-dA)10  39.1   24.3   16.6   33.8   24.6   14.3(戊基5dU-dA)10  38.8   13.8   14.5   32.1   18.7   15.0(己基5dU-dA)10   7.8   14.0    8.2   -(辛基5dU-dA)10   ＜5                 -(十四烷基5dU-dA)10     ＜5                 -(dT-dA)10              53.4   30.3   16.7   47.4   27.5   12.9化学式5′-(正烷基5dU-dA)10-3′是指20个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，它由5-正烷基-dUMP+和dAMP++核苷酸通过磷酸二酯键连接，顺序是严格交替排列的。末端是有自由的5′-OH基的5-正烷基-2′-脱氧尿苷(低聚脱氧核苷酸的5′-端)和有自由3′-OH基的2′-脱氧腺苷(低聚脱氧核苷酸的3′-端)。+dUMP＝2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯艹dAMP＝2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸酯
表2
本发明的低聚脱氧核苷酸5′-(1-正链烯基5dU-dA)10-3′的双螺旋稳定性
低聚脱氧核苷酸      生理缓冲液
               Tm     H260   dT
              (℃)     (％)   (℃)(乙烯基5dU-dA)10 44.1    12.3    17.5(丁烯基5dU-dA)10 46.2    12.3    17.7(dT-dA)10         47.4    27.5    12.9化学式5′-(1-正链烯基5dU-dA)10-3′是指20个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，它由通过磷酸二酯键连接起来的(E)-5-(1-正链烯基)-dUMP和dAMP核苷酸构成，其顺序是严格地交错排列。末端是带有自由的5′-OH基的(E)-5-(1-正链烯基)-2′-脱氧尿苷和有自由的3′-OH基的2′-脱氧腺苷。
表3
本发明的低聚脱氧核苷酸5′-(1-正炔基5dU-dA)10-3′的双螺旋稳定性低聚脱氧核苷酸                 生理缓冲液
                        Tm      H260   dT
                       (℃)      (％)   (℃)(戊炔基5dU-dA)10         54.4      25.3    12.6(己炔基5dU-dA)10         52.0      23.4    16.6(庚炔基5dU-dA)10         43.7      22.5    15.6(辛炔基5dU-dA)10         18.3      15.6     7.9(dT-dA)10                 47.4      27.5    12.9
化学式5′-(1-正炔基5dU-dA)10-3′是指20个核苷酸长的低聚脱氧核苷酸，它由5-(1-正炔基)-dUMP和dAMP核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序严格地交替排列。末端是有自由的5′-OH基的5-(1-正炔基)-2′-脱氧尿苷和有自由3′-OH基的2′-脱氧腺苷。
表4
本发明的低聚脱氧核苷酸5′-(正烷基5dC-dG)6-3′的双螺旋稳定性低聚脱氧核苷酸    低盐缓冲液                 生理缓冲液
              Tm    H260     dT     Tm    H260   dT
             (℃)    (％)     (℃)   (℃)    (％)   (℃)(丁基5dC-dG)6  80.6    19.2     21.8    -(戊基5dC-dG)6  79.3    25.1     20.1    -(己基5dC-dG)6  75.8    25.5     23.4    75.4   28.7   27.9(辛基5dC-dG)6  42.4    19.9     24.9    27.2   22.2   21.1(dC-dG)6        79.7    38.0     16.5    82.9   55.7   14.3化学式5′-(正烷基5dC-dG)6-3′是指12个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，由5-正烷基-dCMP+和dGMP++核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序严格地交错排列。末端是有一个自由5′-OH基的5-正烷基-2′-脱氧胞苷和有一个自由3′-OH基的2′-脱氧鸟苷。+dCMP＝2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯
++dGMP＝2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸酯
表5
本发明的低聚脱氧核苷酸5′-(正-1-炔基5dC-dG)6-3′的双螺旋稳定性低聚脱氧核苷酸         低盐缓冲液        生理缓冲液
                Tm     H260     dT      Tm     H260     dT
               (℃)     (％)     (℃)    (℃)     (％)     (℃)(乙炔基5dC-dG)6  95.2     14.9     16.4      -(戊炔基5dC-dG)6  95.6     11.7     10.6    ＞98(己炔基5dC-dG)6  95.9     13.5     12.6    ＞98(辛炔基5dC-dG)6  90.0     18.1     16.0    ＞90(dC-dG)6          79.7     38.0     16.5    82.9     55.7     14.3化学式5′-(1-正炔基5dC-dG)6-3′是指12个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，由5-(1-正炔基)-dCMP和dGMP核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序严格地交替排列。末端是有自由5′-OH基的5-(1-正炔基)-2′-脱氧胞苷和有自由3′-OH基的2′-脱氧鸟苷。
表6
本发明的含硫代磷酸酯键的低聚脱氧核苷酸5′-(1-正己炔基5dU-dA)10-3′的双螺旋稳定性
低聚脱氧核苷酸                        生理缓冲液
                                     Tm(℃)1. 1，2-硫代-(己炔基5dU-dA)10           51.22. 1，2，18，19-硫代)-(己炔基5dU-dA)10  50.53.过硫-(己炔基5dU-dA)10                 44.04. 1，2-二硫代-(己炔基5dU-dA)10         50.8(己炔基5dU-dA)10                        52.0(dT-dA)10                                47.4
过硫-(dT-dA)10                       38.6化学式5′-(1-正己炔基5dU-dA)10-3′是指一个20个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，由5-(1-正己炔基)-dUMP和dAMP核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序严格地交替排列。末端是有自由5′-OH基的5-(1-正己炔基)-2′-脱氧尿苷和有3′-OH基的2′-脱氧腺苷。化合物1含有一个靠近3′-末端的硫代磷酸酯键而不是磷酸二酯键。化合物2含两个靠近两端的硫代磷酸酯键。在化合物3中，19个磷酸二酯键中的每个均被硫代磷酸酯键代替。化合物4含一个靠近3′-末端的二硫代磷酸酯键。
表7
本发明的12个链节的嵌段低聚脱氧核苷酸的双螺旋稳定性
5′-3′低聚脱氧核苷酸      高盐    生理缓冲液      低盐
                      Tm(℃)   Tm(℃)       Tm(℃)1.(dT)6(dA)6             33.3       -             -2.(己炔基5dU)6(dA)6     53.5       -             -3.(dC)6(dG)6              -         -            74.24.(己炔基5dC)6(dG)6      -         -            95.7(dT-dA)10                 53.4     47.4            -(dT-dA)6                  40.2       -             -(己炔基5dU-dA)10         54.9     52.0            -(dC-dG)6                    -      82.9           79.7(己炔基5dC-dG)6            -     ＞98            95.9嵌段顺序意味着低聚脱氧核苷酸由对应顺序的嵌段构成。化合物1是一个12链节的低聚脱氧核苷酸，由6个依次相连的dTMP和6个依次相连的dAMP单元通过磷酸二酯键连接构成，末端是有一个自由5′-OH基的胸苷和有一个自由3′-OH基的2′脱氧腺苷。化合物2含有5-(1-正己炔基)-dUMP单元代替胸苷。化合物4含5(1-正己炔基)-dCMP单元代替2′-脱氧胞苷单元。
上面表1-7中的Tm数据证实，含有5-正烷基-、5-(正-1-链烯基)-或5-(正-1-炔基)嘧啶代替示改性的嘧啶的低聚脱氧核苷酸，与含有未改性嘧啶的同样长度的低聚脱氧核苷酸相比，其双螺旋稳定性保持不变或增高。一个例外是用5-正烷基尿嘧啶代替嘧啶碱胸腺嘧啶的情形(表1)。但是，如果用5-正烷基胞嘧啶替代嘧啶碱胞嘧啶，则双螺旋稳定性增高，直到5-正戊基胞嘧啶(表4)。如果嘧啶碱胸腺嘧啶被5-(1-正链烯基)尿嘧啶代替，则双螺旋稳定性保持不变(表2)。如果嘧啶碱胸腺嘧啶用5-(1-正炔基)尿嘧啶代替，则双螺旋稳定性一直到5-(1-正己炔基)衍生物都增高(表3)。如果嘧啶碱胞嘧啶用5-(1-正炔基)胞嘧啶代替，双螺旋稳定性提高，一直到5-(1-正辛炔基)或更长链衍生物(表5)。磷酸二酯键用硫代磷酸酯取代已知会减小双螺旋稳定性。嘧啶碱胸腺嘧啶被5-(1-正己炔基)尿嘧啶代替则同样提高硫代磷酸酯取代的低聚脱氧核苷酸的双螺旋稳定性(表6)。如果低聚脱氧核苷酸的顺序不是交替的，而是改性的嘧啶并排地排列，则用5-(1-正炔基)尿嘧啶或5-(1-正炔基)胞嘧啶替代嘧啶碱胸腺嘧啶或胞嘧啶时，双螺旋稳定性的增加甚至更高(表7)。细胞摄入
低聚脱氧核苷酸类似物的疏水性
从文献中已知，聚阴离子型的低聚脱氧核苷酸的疏水性与它的细胞摄入性很有关系。低聚脱氧核苷酸的细胞摄入最好是用其标记形式(放射性的或非放射性的)进行研究。用这种方式，对于新的低聚脱氧核苷酸类似物的疏水性的对比测定，提供了关于它们的相对细胞摄入性的信息。
可以使用高效液相色谱(HPLC)测定疏水性。例如，近来曾采用HPLC保留时间来测定核苷衍生物的疏水性(Valko等.，J.Liq.Chromatogr.1989.12，2103-2116)。我们将此方法扩展到低聚脱氧核苷酸。
HPLC检验用带有2350型泵和V4紫外探测器的ISCO仪器进行。泵用一台与ISCO接口的IBM兼容AT286程序化，该计算机带有版本2.3的ISCO Chem Search软件。除了使泵程序化之外，该软件还进行数据采集和计算。低聚脱氧核苷酸在反相C18柱(Nucleosil 5微米，300A°，250×4.6mm，Phenomenex，Torrence，CA，U.S.A.)上的保留时间用乙腈梯度测定(45分钟内5-50％，0.1M磷酸钠缓冲液，pH7)。流速为1ml/分，峰值在260或280nm检测。化合物在基质上的与柱无关的保留时间(k′)可通过公式(tR-tO)/tO确定，其中tR是化合物在所用的C18柱上的保留时间，tO分别是2.5和2.73分钟。表征疏水性所用的参数是log(k′)。我们的实验结果列在表8和9中。
表8
根据在反相HPLC柱上的保留时间(tO＝2.5分)得到的5′-(dT-dA)10-3′类似物的疏水性。
低聚脱氧核苷酸      tR      k′    log(k′)
                   (分)(丙基5dU-dA)10       22.2     7.38    0.8965(丁基5dU-dA)10       26.2     9.48    0.9768(戊基5dU-dA)10       30.7    11.28    1.0523(己基5dU-dA)10       35.2    13.08    1.1166(辛基5dU-dA)10       47.2    17.88    1.2524(十四烷基15dU-dA)10  55.0    21.0     1.3222(乙烯基5dU-dA)10     20.1     7.04    0.8476(丁烯基5dU-dA)10     25.3     9.12    0.960(戊炔基5dU-dA)10     24.8     8.92    0.9504(己炔基5dU-dA)10     31.0    11.4     1.0569(庚炔基5dU-dA)10     36.6    13.64    1.1348(辛炔基5dU-dA)10     42.0    15.8     1.1987(dT-dA)10             17.0     5.80    0.7634(丙炔基5dU-dA)10     18.0     6.2     0.7924化学式5′-(dT-dA)10-3′是指一个20个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，它由dTTP和dAMP核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序是严格地交替排列。末端是有一个自由5′-OH基的胸苷和有一个自由3′-OH基的2′-脱氧腺苷。列在“低聚脱氧核苷酸”标题下的化合物是(dT-dA)10类似物，其中胸苷dT核苷被5-正烷基-、5-(1-正链烯基)-和5-(1-正炔基)-2′-脱氧尿苷核苷单元代替。参数tR、tO、k′和log(k′)的定义如上。
表9
根据在反相HPLC柱上的保留时间(tO＝2.73分)得到的5′-(dC-dG)6-3′类似物的疏水性。低聚脱氧核苷酸        tR      k′    log(k′)
                  (分)(丁基5dC-dG)6       16.5    5.04    0.7024(戊基5dC-dG)6       20.0    6.33    0.8014(己基5dC-dG)6       25.7    8.41    0.9248(辛基5dc-dG)6       39.3   13.40    1.1271(乙炔基5dC-dG)6     16.6    5.08    0.7059(戊炔基5dC-dG)6     24.4    7.94    0.8998(己炔基5dC-dG)6     28.8    9.55    0.9800(辛炔基5dC-dG)6     40.8   13.94    1.1443(dC-dG)6             11.0    3.03    0.4814(甲基5dC-dG)6       11.8    3.32    0.5211(乙基5dC-dG)6       13.6    3.98    0.5999化学式5′-(dC-dG)6-3′代表一个12个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，它由dCMP和dGMP核苷酸通过磷酸二酯键连接构成，其顺序严格地交替排列。末端是带有一个自由5′-OH基的2′-脱氧胞苷和带有一个自由3′-OH基的2′-脱氧鸟苷。列在标题“低聚脱氧核苷酸”下的化合物是(dC-dG)6的类似物，其中2′-脱氧胞苷dC核苷被5-正烷基-和5-(1-正炔基)-2′-脱氧胞苷核苷单元代替。参数tR、tO、k′和log(k′)的定义如上。
表8和9以及图1和2中列出的数据充分表明，在低聚脱氧核苷酸的疏水取代基碳链长度和由HPLC保留时间计算出的疏水性[log(k′)]之间有很好的相关性。随着嘧啶碱尿嘧啶和胞嘧啶的5-取代基链长的增加，作为疏水性特征的log(k′)值也增加。更准确地说，这一增加是线性的，直到含8个碳原子链的类似物(辛基5dU-dA)10、(辛炔基5dU-dA)10(图1)和(辛基5dC-dG)6及(辛炔基5dC-dG)6(图2)。(辛基5dU-dA)10的疏水性比(dT-dA)10高1.64倍，(辛炔基5dU-dA)10高1.57倍。与(dC-dG)6相比，(辛基5dC-dG)6的疏水性高2.34倍，(辛炔基5dC-dG)6高2.38倍。用放射性同位素标记的类似物测定的低聚脱氧核苷酸的细胞摄入
在作为磷酸酯供体的(γ-35S)ATP(腺苷三磷酸)存在下，用多核苷酸激酶将低聚脱氧核苷酸5′-(dT-dA)10-3′和5′-(正炔基5dU-dA)10-3′标记在它们的5′-末端核苷胸苷和5-(1-正炔基)-2′脱氧尿苷上。5′-硫代磷酸酯标记的低聚脱氧核苷酸用反相薄层色谱纯化。在从层中溶解去除之后，将标记过的低聚脱氧核苷酸浓缩，然后用紫外线光光度法(与AT386计算机接口的HP8452A分光光度计)和液体闪烁法(LKB1217)测定。对于细胞摄入实验，使用比活性为0.5－2.5×106dpm/μg的低聚脱氧核苷酸溶液。
对于细胞摄入实验，使用肿瘤细胞系205和MT4细胞系。以5×105的细胞数移植细胞，在细胞系205的情形移入一个24孔的板，在MT4细胞系的情形移入一个直径33mm的陪替氏培养皿中。移植48小时后，向含有细胞的溶液中加入1-1μg标记过的低聚脱氧核苷酸。然后将溶液在37℃于5％CO2下恒温3、6、10和24小时。用4℃的PBS(Dulbecco缓冲液，Sigma公司)洗细胞，除掉吸附在细胞表面上的标记的低聚脱氧核苷酸。随后用1M NaOH溶液(0.5ml)溶解细胞。24小时后测定0.2ml样品中的放射性。
图3表示低聚脱氧核苷酸的细胞摄入与疏水性[log(k′)]之间的关系，细胞摄入用肿瘤细胞205内的放射性(dpm/0.2ml)表示。圆圈从左到右是(dT-dA)10、(丙炔基5dU-dA)10、(戊炔基5dU-dA)10、(己炔基5dU-dA)10、(庚炔基5dU-dA)10和(辛炔基5dU-dA)10。图3表明，尿嘧啶的5-位上用1-炔基取代后，低聚脱氧核苷酸的细胞摄入增加，而且低聚脱氧核苷酸类似物的疏水性与细胞摄入之间有很好的相关性。低聚脱氧核苷酸被蛇毒磷酸二酯酶降解速度的测定
3′-核酸外切酶被认为是降低低聚脱氧核苷酸体内活性的主要因素(E.Uhlman&A.Peyman：Chem.Rev.1990，90，543-583)。蛇毒磷酸二酯酶是一种3′-核酸外切酶。用它来比较新型低聚脱氧核苷酸类似物与未改性的样品的水解速度。用基于HPLC的一种方法进行动态分析。
酶反应在生理缓冲液中进行，最终体积0.12ml中有0.1MNaCl、20mM磷酸钠缓冲剂(pH7.02)和2mM MgCl2。低聚脱氧核苷酸的浓度为1光学密度单位/ml，酶浓度为13.5μg/ml。将反应混合物在37℃下恒温，在5、10、20和30分钟时分别取样0.01ml，直接注入到HPLC柱上。
用一台Waters仪器(Waters 510泵，Waters 991二极管组检测器，Millipore梯度控制器)进行HPLC测定，该仪器有一个连接到保护柱(Nucleosil C18，5×4mm，BST，匈牙利)之后的阴离子交换柱(Waters蛋白质PAK，DEAE 5PW，75×7.5mm)。梯度A为0.02M磷酸钠缓冲液(pH3)，梯度B是0.02M磷酸盐(pH3)加0.5M NaCl，以1ml/分的流速在20分钟内达到梯度A100％至20％。测定裂开的嘌呤核苷酸dAMP和dGMP的峰面积变化以跟踪水解速度。在260nm处检测(dT-dA)10及类似物，在280nm检测(dC-dG)6及类似物。在250-285nm的范围内收集吸收数据。水解速度按下式计算
                  V＝A/(a.e.i)其中“V”是水解速度，“A”是裂开的嘌呤核苷酸的峰面积，“a”是用光密度单位表示的低聚脱氧核苷酸的数量，“e”是以微克表示的磷酸二酯酶的数量，“i”是以分钟为单位的保温时间。对于(dT-dA)10’得到的比吸收面积为628(1单位·1微克·1分)；对于(dC-dG)6，为128(1单位·1微克·1分)。以这些数值作为100％，表10和表11中列出的速度值是对它们的相对值。
表10
5′-(dT-dA)10-3′和类似物被蛇毒磷酸二酯酶水解的相对速度
低聚脱氧核苷酸           相对水解速度       (％)(丙基5dU-dA)10            73.6(丁基5dU-dA)10            25.6(戊基5dU-dA)10             3.2(己基5dU-dA)10             0(辛基5dU-dA)10             0(十四烷基5dU-dA)10         0(乙烯基5dU-dA)10          36.6(丁烯基5dU-dA)10          17.8(戊炔基5dU-dA)10           0(己炔基5dU-dA)10           0(庚炔基5dU-dA)10           0(辛炔基5dU-dA)10           0(dT-dA)10                  100(丙炔基5dU-dA)10          34.
表11
5′-(dC-dG)6-3′和类似物被蛇毒磷酸二酯酶水解的相对速度
低聚脱氧核苷酸      相对水解速度    (％)(丁基5dC-dG)6       44.5(戊基5dC-dG)6       19.5(己基5dC-dG6         0(辛基5dC-dG)6        0(乙炔基5dC-dG)6     13.9(戊炔基5dC-dG)6      0(己炔基5dC-dG)6      0(辛炔基5dC-dG)6      0(dC-dG)6            100(甲基5dC-dG)6       87.5(乙基5dC-dG)6       78.1
表10和表11中列出的数据证实，低聚脱氧核苷酸的嘧啶第5位上用5-正烷基、5-(1-正链烯基)和5-(1-正炔基)取代，大大提高了它们抵抗核酸酶的能力。更具体地说，由3′核酸外切酶蛇毒磷酸二酯酶造成的水解速度由于取代而大大减小，(己基5dU-dA)10、(戊炔基5dU-dA)10、(己基5dC-dG)6和(戊炔基5dC-dG)6以及甚至更长链的类似物都变得在30分钟保温期间能抗拒酶的作用。
为用于治疗，可以将本发明的化合物与无毒的惰性固体或液体载体、烯释剂和/或制药工业中常用的其它添加剂混合，转化成药物组合物，制成常见的用药形式，例如用于肠道或非肠道给药。符合上述要求的载体、稀释剂和赋形剂的实例有水、明胶、乳糖、蔗糖、淀粉、果胶、硬脂酸、硬脂酸镁、滑石粉、各种植物油以及二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)。
在药物添加剂中，可以包括防腐剂(例如4-羟基苯甲酸甲酯)，各种天然或合成的乳化剂、分散剂和润湿剂、着色剂与风味剂、缓冲剂以及促进崩解和溶解的试剂。
用上述药物添加剂可以制得的常规的药物组合物可以是固体组合物，例如片剂、胶囊、粉末、糖锭剂或粒剂；液体药物组合物，如糖浆、溶液、乳状液或悬浮液；还包括非肠道用的组合物，例如注射液和输注液；以及用于直肠用药的组合物，如栓剂。
本发明的组合物的毒性很低，它们实际上无毒。已发现在MT4细胞培养物中100μg/ml的(己炔5dU-dA)10对细胞无毒性，细胞的生存力未显示任何变化。
本发明组合物的日剂量取决于多种因素，例如要治疗的疾病类型、所治疗的患者的年龄和状况、用药方式等。实际上每日用药量为每Kg体重0.5至1200mg。因此，最好是每日分1到3次服用0.01至0.2g片剂、胶囊或糖锭剂。
本发明化合物的主要优点是：
1)它们能通过与mRNA或病毒RNA的特定区域形成稳定和特定顺序的双螺旋，抑制对指定疾病负责的基因表达，从而发挥其作用；
2)与未改性的低聚脱氧核苷酸相比，它们能形成具有不变的或增强的稳定性的双螺旋；
3)与未改性的低聚脱氧核苷酸相比，它们的核酸酶稳定性大大提高；
4)与未改性的对应物相比，它们的疏水性强得多，因此被细胞吸收也容易得多；
5)它们能有效地作为反义药物使用，防治由病毒(包括艾滋病毒)、真菌、细菌或内源基因造成的疾病。
以下的非限制性实施例进一步说明本发明。
                        实施例1含有代替胸腺嘧啶的5-(1-正己炔基)尿嘧啶的低聚脱氧核苷酸的合成
用一台Biosearch 8700DNA合成仪进行合成。将装有S′-O-(P，P′)-二甲氧基三苯甲基-5-(正-1-己炔基)-2′-脱氧尿苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)-氨基磷酸酯(DMT-2′-脱氧-正-1-己炔基-CED-氨基磷酸酯)(示意2)在乙腈中的0.03M溶液放在合成仪的位置13处。在位置9-12处放上装有天然核苷酸的CED试剂的类似溶液的瓶子。在位置8放置一个装有0.47M的活化剂四唑/乙腈溶液的瓶子。
                   示意2
Figure A9419138900261
要合成的低聚脱氧核苷酸的第一个核苷酸通过它的自由3′-OH基以共价键穿过间隔臂结合到控孔玻璃(CPG)基质上。由这个与基质结合的在5′-OH基处被二甲氧基三苯甲基保护的核苷出发，将1μmol注入到1×30mm的反应器中，反应器的两端装有过滤器和封堵物。合成仪根据要合成的低聚脱氧核苷酸的顺序程序化，开始合成。
第一步是用2.5％的二氯乙酸/二氯甲烷溶液在90秒内从与CPG基质结合的核苷上除掉5′-二甲氧基三苯甲基保护基。在用乙腈洗过之后，紧接着要合成的序列中下一个核苷酸的缩合反应：将位置9-13中的一个15μmol物质和位置8处的75μmol物质泵入到反应器中，在那里放置3分钟。用乙腈洗过后，未反应的自由5′-OH基团用乙腈-可力丁-二甲氨基吡啶-乙酸酐(73∶15∶2∶10)混合物乙酰化，然后用0.01M碘溶液(乙腈-可力丁-水＝64∶6∶30)将缩合反应中形成的亚磷酸酯键氧化成磷酸酯。在洗涤步骤之后，再次开始整个循环，从去三苯甲基化开始，直到完成要合成的整个序列。在最后的核苷酸缩合之后，紧接着最后的去三苯甲基化步骤。
用30％的NH4OH/水溶液在1小时内将在杂环碱上含有保护基的与CPG基质结合的低聚脱氧核苷酸从基质上裂解下来。然后将该溶液加热到60℃，在该温度下保持8小时以便从低聚脱氧核苷酸上除掉所有的保护基团。接着将溶液蒸发，用乙醚萃取，水溶液用HPLC纯化。粗制的低聚脱氧核苷酸混合物主要含有较短的低聚脱氧核苷酸作为污染物。主成分的纯化用反相HPLC进行，使用带有2350型泵和V4紫外探测器的ISCO仪器。泵用一台与ISCO接口并装有版本2.3ISCO Chem Search软件的IBM-兼容AT286程序化。除了将泵程序化之外，该软件还进行数据采集和计算。
粗制的低聚脱氧核苷酸先用分析型反相柱(Nucleosil5，C18，300，4.6×250mm，Phenomenex)于45分钟内进行分析，采用在0.1M磷酸钾(pH7)中的5％至50％的乙腈梯度。常常将0.05光密度单位(约1.6μg)的粗制混合物注入柱中，在所得的层析谱的基础上安排制备型纯化。对于制备规模的分离，将大约100单位(约3.3mg)的粗物质加到10×250mm的半制备型柱上(Nucleosil5.C18，300，Phenomenex)，使用同样的乙腈梯度进行分离。
除主峰以外，还收集所有的色谱峰，以便能计算产率。用紫外分光光度法测定所收集的物质数量。然后用真空蒸发法除掉溶液中与主色谱峰相应的乙腈。剩下的水溶液用离心蒸发法(Vacu-Spin，Virtis，美国)进一步浓缩到5-10ml。然后在一个低分子量截止值(6000道尔顿)的渗析袋(SpectrumMed.Ind.L.A.，美国)中将此溶液渗析脱盐。相对于去离子水进行渗析，袋内盐的去除用测定外部水的电导率增加来跟踪。随后将纯化过的低聚脱氧核苷酸的去盐溶液冷冻干燥，在-25℃下保存。
合成仪内缩合反应的产率约为97％。用这种方式，得到了一个20个核苷酸长的低聚脱氧核苷酸，最终产率约为55％，这相当于在260nm测得约100光密度单位。在反相HPLC纯化后，最终总产量一般是50单位(约1.65mg)纯的20个链节的低聚脱氧核苷酸。
                 实施例2含有代替胞嘧啶的5-(1-正己炔基)胞嘧啶的低聚脱氧核苷酸的合成
按实施例1中所述进行低聚脱氧核苷酸的制备，不同之处在于，放在DNA合成仪位置13的瓶中装有10ml 0.04M 4-苯甲酰-5-(正-1-己炔基)-2′-脱氧胞苷-CED(示意3)溶液。此缩合步骤耗时4分钟。
                   示意3
                  实施例3含有代替胸腺嘧啶的5-(1-正己炔基)尿嘧啶和代替胞嘧啶的5-(1-正己炔基)胞嘧啶的低聚脱氧核苷酸的合成
按实施例1中所述制备低聚脱氧核苷酸，不同之处在于，在DNA合成仪位置12处放置的瓶中装有10ml 0.04M 4-苯甲酰-5-(正-1-己炔基)-2′-脱氧胞苷-CED。此缩合步骤耗时4分钟。
                  实施例4含有代替胸腺嘧啶的5-(1-正己炔基)尿嘧啶的硫代磷酸酯低聚脱氧核苷酸的合成
按实施例1中所述制备低聚脱氧核苷酸，其中的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键代替，如示意4中的5-(1-正己炔基)-2′-脱氧尿苷单元所示
                  示意4
Figure A9419138900301
但制备方法有以下修改：
i)氧化步骤：在每次缩合步骤之后，用0.5M二硫化四乙基秋兰姆/乙腈溶液处理低聚脱氧核苷酸溶液20分钟，接着用乙腈进行通常的洗涤步骤。
ii)未反应的5′-OH基的乙酰化：在以上步骤i)中，用乙腈-可力丁-乙酸酐-(N-甲基咪唑)的混合物(65∶15∶10∶13)处理低聚脱氧核苷酸溶液1分钟，然后用乙腈洗。
iii)制备型反相色谱纯化的主HPLC峰用HPLC法反复纯化。

Claims (5)

1.一种12到30个核苷酸单元长的低聚脱氧核苷酸，含有至少一个5-取代的嘧啶碱(尿嘧啶或胞嘧啶)，其中的5-取代基是一个C3-14正烷基、C2-8(E)-正-1-链烯基、乙炔基或一个C4-12正-1-炔基。
2.权利要求1中的低聚脱氧核苷酸，其中的一个或多个磷酸二酯部分被硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯部分代替。
3.权利要求1中的低聚脱氧核苷酸，其中一个或多个磷酸二酯部分被R-或S-构型的硫代磷酸酯部分取代。
4.权利要求1至3中任一项的低聚脱氧核苷酸，其中的嘧啶碱是一个5-取代的尿嘧啶、5-取代基是一个C3-14正烷基、C2-4(E)-正-1-链烯基或C5-8正-1-炔基。
5.权利要求1至3中任一项的低聚脱氧核苷酸，其中的嘧啶碱是一个5-取代的胞嘧啶、5-取代基是一个C3-14正烷基、C2-4(E)-正-1-链烯基或C5-8正-1-炔基。
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