CN111896757A - 一种改善全血样本测值的d-二聚体测定试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改善全血样本测值的D‑二聚体测定试剂盒,属于生物检测技术领域,包括试剂1和试剂2,试剂1包括缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂;所述试剂2为胶乳试剂。该试剂盒可有效定量测定全血样本中D‑二聚体含量,并能提高低值样本检测的精密度。本发明还提供了一种改善全血样本测值的D‑二聚体测定试剂盒的制备方法及应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒、制备方法及应用。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统,由4种主要部分组成:纤溶酶原、纤溶原激活剂、纤溶酶、纤溶酶抑制剂。D-二聚体是由纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,在经纤溶酶降解不可溶性的交联的纤维蛋白多聚体的α-链、β链和γ链,释放出大量的不同分子量的纤维降解产物,而D-二聚体是其中一个分子量约180-200KDa的片段,因为这种生化结构,导致D-二聚体在血液中的存在与血凝块降解过程的活跃相关。
对于D-二聚体的检测,目前市面上售用的胶乳免疫比浊试剂盒,原理大都是采用大小球偶联鼠类单克隆抗体混用的方式,基本上具有敏感度高、特异性好、线性较宽等优点。但依然存在总体中低值精密度不好等问题;而且市面上的试剂盒均以血浆为检测样本,而通常在临床中采集到的为全血样本,需要离心装置对其进行分离红细胞再进行测试,增加了样本需求量,也增加了操作步骤,不利于检测效率的提升。
发明内容
为了解决现有D-二聚体检测试剂盒不能测定全血样本的技术问题,本发明提供了一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,可有效定量测定全血样本中D-二聚体含量,并能提高低值血浆样本检测的精密度。
本发明还提供了一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒的制备方法及应用。
本发明通过以下技术方案实现:
一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,包括试剂1和试剂2,包括试剂1和试剂2,所述试剂1包含缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂,试剂1中各成分浓度为:
缓冲液:50-100mmol/L、电解质:0.1-0.2mmol/L、十八胺聚氧乙烯醚:1-5g/L、促凝剂:20-50g/L、离散剂:5-25g/L、防腐剂:0.8-1.2g/L;
所述试剂2为胶乳试剂。
进一步的,所述离散剂为硫氰化钾或氯化胆碱或十二烷基硫酸钠。
进一步的,所述缓冲液包括Tris、PB、DIPSO和HEPES中任意一种,缓冲液有效缓冲范围在7.0-8.5。
进一步的,所述电解质包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中任意一种。
进一步的,所述促凝剂包括PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中任意一种。
进一步的,所述防腐剂包括叠氮钠、PC300和硫柳汞中任意一种。
一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒的制备方法,包括:
称取试剂1所需原料:缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂:
将缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂配制成溶液,并通过酸液或碱液调节pH为7.50,得到的试剂1具有如下所述的组分浓度:
缓冲液:50-100mmol/L、电解质:0.1-0.2mmoI/L、十八胺聚氧乙烯醚:1-5g/L、促凝剂:20-50g/L、离散剂:5-25g/L、防腐剂:0.8-1.2g/L;
制备胶乳试剂。
进一步的,所述胶乳试剂的制备方法为:
将粒径83nm的聚苯乙烯羧基微球加入MES缓冲液稀释至1%
浓度,加入EDC搅拌15min,再加入小直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节偶联pH,37℃搅拌偶联2h,加入封闭液,封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制,离心分离,用R2储存液超声重悬得R2-A液;
取粒径240nm的聚苯乙烯羧基微球加入MES缓冲液稀释至1%,加入EDC于37℃搅拌15min,加入大直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节pH,37℃搅拌偶联2h,加入封闭液,封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制,离心分离,用适量R2储存液超声重悬得R2-B液;
将R2-A液与R2-B液按质量比3∶1~8∶1的比例混合即得试剂2。
所述酸液为盐酸,所述碱液为NaOH溶液,所述R2储存液的化学成分包括甘氨酸和海藻糖,浓度分别为:甘氨酸150mmol/L、海藻糖20g/L。
一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒在全血样本D-二聚体检测中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,采用双试剂,通过对试剂1进行改进,加入十八胺聚氧乙烯醚及离散剂,得到的D-二聚体测定试剂盒可在不影响试剂灵敏度和线性的基础性能上,有效定量测定全血样本中D-二聚体含量,并且能显著提高低值血浆样本检测的精密度。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题,总体思路如下:
本发明通过优化调整试剂1组分,有效定量测定全血样本中D-二聚体含量,同时意外地发现能提高低值样本检测的精密度。
具体的,本发明一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,包括试剂1和试剂2,试剂1包括缓冲液:50-100mmol/L、电解质:0.1-0.2mmol/L、十八胺聚氧乙烯醚:1-5g/L、促凝剂:20-50g/L、离散剂:5-25g/L、防腐剂:0.8-1.2g/L;所述试剂2为胶乳试剂。
进一步的,所述离散剂为硫氰化钾或氯化胆碱或十二烷基硫酸钠。
进一步的,所述缓冲液包括Tris、PB、DIPSO和HEPES中任意一种,缓冲液有效缓冲范围在7.0-8.5。
进一步的,所述电解质包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中任意一种。
进一步的,所述促凝剂包括PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中任意一种。
进一步的,所述防腐剂包括叠氮钠、PC300和硫柳汞中任意一种。
本发明中,电解质的作用,在于有效抑制二次收敛聚合的胶乳微球发生溶胀,增强试剂反应钝化的稳定性;
促凝剂的作用在于促进抗原抗体进行免疫反应结合。
本发明通过添加特定表面活性剂:十八胺聚氧乙烯醚,有效达到对红细胞的破胞作用,而离散剂能作用于抗原蛋白的二级和三级结构,对其蛋白构象产生优化,增强特异性,同时使得低值样本的精密度更好,且离散剂能协同强化特定表面活性剂的破胞作用,使得全血样本溶血效果更佳,测试结果与最佳理论血浆比例(计算系数,一般为55%-65%之间,代表溶血后的全血样本中的全血细胞压积,根据全血细胞压积(packed cell volume,简称PCV)对确定出的D2聚体浓度起到修正作用,这是全血测试必要的系数)的比值,即得到血浆中D-二聚的有效浓度。
胶乳免疫比浊的原理,即交联抗体的微球与抗原结合,短时间内迅速聚集一起,改变反应液的散光性能或透光性能;而全血样本中的红细胞等不透光因素,会严重干扰免疫反应的基础,本发明对全血样本溶血的目的,在于破除血细胞后使得全血样本变得澄清,不影响免疫比浊结合。若不溶血,生化仪直接吸光度报警,检测无法正常进行。
因此,本发明的D-二聚体测定试剂盒,通过添加十八胺聚氧乙烯醚和离散剂,促进破胞溶血,减小对测试结果的干扰,满足对全血样本的检测,能有效定量测定全血样本中D-二聚体含量,同时离散剂对蛋白的结构优化,还能提高低值样本检测的精密度。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒进行详细说明。
实施例
1、试剂1、试剂2的制备:
1.1原料准备:
缓冲液:Tris、PB、DIPSO、HEPES等有效缓冲范围在7.0-8.5的缓冲液;
电解质:氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾等盐类物质;
特定表面活性剂:十八胺聚氧乙烯醚;
促凝剂:PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000;
防腐剂:叠氮钠、PC300、硫柳汞等;
离散剂:硫氰化钾、氯化胆碱、十二烷基硫酸钠,首选十二烷基硫酸钠。
1.2将缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂配制成溶液,并通过酸液或碱液调节pH为7.50,酸液采用盐酸,碱液采用NaOH溶液,得到的试剂1具有如下所述的组分浓度:
缓冲液:50-100mmol/L、电解质:0.1-0.2mmol/L、十八胺聚氧乙烯醚:1-5g/L、促凝剂:20-50g/L、离散剂:5-25g/L、防腐剂:0.8-1.2g/L。
1.3胶乳试剂的制备:
取粒径83nm的聚苯乙烯羧基微球(JSR P0114)2ml,加入8ml MES缓冲液稀释至1%浓度,加入1.8ml 1%EDC(现配现用),于37℃搅拌15min,添加8mg小直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节偶联pH,37℃搅拌偶联2h,加入4mL封闭液,其中封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制;离心分离,用40ml R2储存液超声重悬,其中R2储存液由150mmol/L甘氨酸和2%海藻糖配制,得R2-A液;
取粒径240nm的聚苯乙烯羧基微球(JSR P0220)1mL,加入9mL MES缓冲液稀释至1%浓度,加入0.77mL 1%浓度EDC(现配现用),于37℃搅拌15min,加入4mg大直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节pH,37℃搅拌偶联2h,加入4mL封闭液,其中封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制;离心分离,用100ml R2储存液超声重悬,其中R2储存液由150mmol/L甘氨酸和2%海藻糖配制,得R2-B液;
将R2-A液与R2-B液按质量比5∶1的比例混合即得试剂2。
2、本发明设置3个对照例和4个实施例,各对照例和实施例的试剂2相同,试剂1配方如表1所示:
表1各对照例和实施例的试剂1配方
实施例2:在实施例1的基础上,将十八胺聚氧乙烯醚的浓度2g/L替换成5g/L;
实施例3:在实施例1的基础上,将十二烷基硫酸钠替换为氯化胆碱,浓度不变;
实施例4:在实施例1的基础上,将十二烷基硫酸钠的浓度5g/L替换为25g/L。
3、对照例1-3及实施例1-4的性能评价
评价指标
(1)低值精密度评价:取低值样本0.5ug/mL附件的血浆样本,测试10次,计算精密度CV;
(2)线性测试:取线性全程全血样本,自制试剂1和试剂2,在日立7180全自动生化分析仪中采用2点终点法进行检测,计算测试结果与计算系数(根据实验大数据,取细胞压积系数为0.6,一般的,血浆占全血样本成分的50-60%,而根据本实验室对多数正常样本(非贫血患者全血样本)离心前全血样本测试值以及离心后血浆测试值建立的比例系数为0.6左右)的比值;用计算结果(即表3中的计算值,代表血浆理论值)与比对试剂测试血浆结果作比较,计算相对偏差;
结果如表2、3所示。
表2精密度评价数据
精密度 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
1 | 0.43 | 0.54 | 0.51 | 0.49 | 0.49 | 0.49 | 0.52 |
2 | 0.48 | 0.50 | 0.55 | 0.49 | 0.48 | 0.50 | 0.51 |
3 | 0.53 | 0.49 | 0.51 | 0.51 | 0.51 | 0.53 | 0.49 |
4 | 0.58 | 0.48 | 0.47 | 0.49 | 0.48 | 0.51 | 0.52 |
5 | 0.52 | 0.54 | 0.52 | 0.50 | 0.52 | 0.51 | 0.51 |
6 | 0.57 | 0.49 | 0.52 | 0.49 | 0.51 | 0.52 | 0.50 |
7 | 0.54 | 0.56 | 0.48 | 0.50 | 0.51 | 0.52 | 0.48 |
8 | 0.51 | 0.53 | 0.49 | 0.49 | 0.50 | 0.51 | 0.49 |
9 | 0.52 | 0.54 | 0.45 | 0.51 | 0.49 | 0.52 | 0.49 |
10 | 0.44 | 0.46 | 0.52 | 0.51 | 0.51 | 0.50 | 0.51 |
Mean | 0.512 | 0.513 | 0.502 | 0.498 | 0.500 | 0.511 | 0.502 |
STDEV | 0.050 | 0.033 | 0.029 | 0.009 | 0.014 | 0.012 | 0.014 |
CV% | 9.69% | 6.44% | 5.85% | 1.85% | 2.83% | 2.34% | 2.79% |
表2中,Mean表示平均值,STDEV表示标准偏差,CV表示变异系数;表中各个浓度值的单位为ug/ml。由表2可知:常规的试剂1对低值样本测试精密度较差,符合市面上大多试剂的现状,而实施例1中添加的离散剂和表面活性剂,能够明显改善精密度。
表3样本比对评价数据
表3中,比对试剂为宁波瑞源生物科技厂家生产的D-二聚体检测试剂,其测试的是全血样本制备成血浆样本后的D-二聚体浓度。由表3可知,对照例1对于全血样本D-二聚体测试的相对偏差在66%-100%,对照例1微量浓度值容易测出零值,导致其偏差达到100%,对照例2对于全血样本D-二聚体测试的相对偏差在16%-100%,主要集中在25%-30%,对照例3对于全血样本D-二聚体测试的相对偏差在17%-74%,主要集中在20%-25%,实施例1-4对于全血样本D-二聚体测试的相对偏差在1%-35%,主要集中在5%-13%,由此可知:添加特定表面活性剂与离散剂,能使自制试剂盒有效测定全血样本中D2聚体浓度,且对添加物添加量优化,临床比对结果也能优化。
由表1-3可知,本发明通过对试剂1进行改进,加入十八胺聚氧乙烯醚及离散剂,得到的D-二聚体测定试剂盒可有效定量测定全血样本中D-二聚体含量,并且能显著提高低值样本检测的精密度。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2,所述试剂1包含缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂,试剂1中各成分浓度为:
缓冲液:50-100mmol/L、电解质:0.1-0.2mmol/L、十八胺聚氧乙烯醚:1-5g/L、促凝剂:20-50g/L、离散剂:5-25g/L、防腐剂:0.8-1.2g/L;
所述试剂2为胶乳试剂。
2.根据权利要求1所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,所述离散剂为硫氰化钾或氯化胆碱或十二烷基硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,所述缓冲液包括Tris、PB、DIPSO和HEPES中任意一种,缓冲液有效缓冲范围在7.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,所述电解质包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,所述促凝剂包括PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒,其特征在于,所述防腐剂包括叠氮钠、PC300和硫柳汞中任意一种。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括:
称取试剂1所需原料:缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂;
将缓冲液、电解质、十八胺聚氧乙烯醚、促凝剂、离散剂和防腐剂配制成溶液,并通过酸液或碱液调节pH为7.50,得到的试剂1具有如权利要求2所述的组分浓度;
制备胶乳试剂。
8.根据权利要求7所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒的制备方法,其特征在于,所述胶乳试剂的制备方法为:
将粒径83nm的聚苯乙烯羧基微球加入MES缓冲液稀释至1%浓度,加入EDC搅拌15min,再加入小直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节偶联pH,37℃搅拌偶联2h,加入封闭液,封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制,离心分离,用R2储存液超声重悬得R2-A液;
取粒径240nm的聚苯乙烯羧基微球加入MES缓冲液稀释至1%,加入EDC于37℃搅拌15min,加入大直径鼠抗人D-D-二聚单抗,调节pH,37℃搅拌偶联2h,加入封闭液,封闭液由20%BSA与1mol/L甘氨酸混合配制,离心分离,用R2储存液超声重悬得R2-B液;
将R2-A液与R2-B液按质量比3∶1~8∶1的比例混合即得试剂2。
9.根据权利要求8所述的一种改善全血样本测值的D-二聚体测定试剂盒的制备方法,其特征在于,所述酸液为盐酸,所述碱液为NaOH溶液,所述R2储存液的化学成分包括甘氨酸和海藻糖,浓度分别为:甘氨酸150mmol/L、海藻糖20g/L。
10.如权利要求1-6中任一项所述的D-二聚体测定试剂盒在全血样本D-二聚体检测中的应用。
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- 2020-08-04 CN CN202010771207.4A patent/CN111896757B/zh active Active
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