CN111893137B - 一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法 - Google Patents

一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法，主要通过VHb基因密码子优化及表达载体的构建，构建VHb表达载体，并将表达载体利用PCR扩增线性化片段，通过电转化的方式导入细胞内，筛选获得转基因藻株；本发明获得的转基因藻株，能够不断的提高该基因对三角褐指藻在自养和兼养条件下的生长效率和高附加值产品的生产。

Description

一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养 培养的方法
技术领域
本发明涉及一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法，属生物工程技术领域。
背景技术
海洋微藻在海洋生态系统中具有重要的作用，作为初级生产者，它们是海洋生物的重要食物来源。海洋微藻种类繁多，其中三角褐指藻由于其生长速率快，油脂含量高等特点被人们所关注。其生长速率可达到0.38g/L/d，收获后油脂含量能达到48％以上，EPA(二十五碳烯酸)产率可达到36mg/L/d，近年来作为新的EPA生产来源。并且作为典型的硅藻，其岩藻黄质含量在15.42～16.51mg/g之间。但藻细胞在生长过程中，易受到高光胁迫，产生过量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，造成细胞氧损伤，导致细胞生长速率降低，并影响不饱和脂肪酸的积累。因此，利用基因工程手段对野生型微藻进行改造，提高其抗逆性，对改善三角褐指藻生长，提高岩藻黄质和EPA产量具有重要意义。
微藻的营养方式具有多样性，大多数微藻采用光合自养(Phetoautotrophy)方式，许多微藻具有利用有机碳进行兼养(Mixotrophy)和异养(Heterotrophy)生长的能力。自养的光限制因素严重制约了微藻生物量，兼养和异养能够部分或全部消除光限制，成为提高微藻产量和胞内活性物质含量的有效途径，因此微藻的兼养和异养研究成为近年来国内外藻类生物学关注的热点问题。
兼养是利用CO2和有机碳，同时进行光合作用和呼吸作用，因此在光限制条件下，大多数微藻的兼养比生长速率约等于自养和异养比生长速率之和，如：卡德藻(Tetraselmis sp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和小球藻(Chlorellavulgaris)等。兼养为微藻高密度培养提供了一条有效途径，兼养和异养有利于胞内活性物质的积累，对于开发微藻生产胞内活性物质提供了很好的途径。
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)，发现于革兰氏阴性丝状菌，是目前研究最为透彻，应用最为广泛，对其结构和功能了解的最清楚的原核生物血红蛋白。其主要存在形态有3种：氧化态、还原态和氧合态，三种形态之间可以发生相互转化。其中还原态是生理活性态，氧合态则是重要的稳定状态。还原状态的血红蛋白在577nm，544nm和420nm处有最大吸收峰。若向透明颤菌血红蛋白氧合态细胞溶液中通入CO气体，则络合成复合物，在566nm，535nm和419nm呈现特征吸收峰。透明颤菌血红蛋白的光谱吸收特性一般用来鉴定其在外源宿主中是否有表达活性。
中国专利文献CN103194459A(201310120495.7)公开了一种高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法，将透明颤菌血红蛋白编码基因导入小球藻中，转基因的小球藻生物量和叶黄素产量大于野生型。但是该专利中的小球藻是一类能够天然进行异养发酵的微藻，使用透明颤菌血红蛋白的目的类似于微生物发酵中的作用，使得氧气能够更好地供给细胞，提高有机物的利用效率。本发明专利中使用的海洋微藻为非天然异养微藻，三角褐指藻无法高效的在异养条件下生长，仅能一定程度上进行兼养培养，提高兼养效率是提高三角褐指藻生物量和岩藻黄质产量的关键，不同于以上专利，本发明专利中使用透明颤菌血红蛋白主要用于提高海洋微藻的兼养效率和降低细胞内的活性氧损伤，进而提高转基因藻种的生产效率，与现有公开专利的发明原理不同，解决的技术问题不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法。本发明通过对来源于透明颤菌血红蛋白基因进行密码子偏向性优化，以及进行多拷贝表达，来调节自养和兼养培养条件下三角褐指藻细胞内氧平衡，减少活性氧损伤，进而达到提高生物量以及附加值产物EPA和岩藻黄质产量的目的。
一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白转基因藻株的构建方法，包括如下步骤：
(1)VHb基因密码子优化及表达载体的构建
本发明对原VHb基因如SEQ ID NO.1所示，进行藻类偏好性密码子优化，优化后的VHb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示；以pPha-T1为基础表达载体，在fcp-A启动子下游插入VHb基因，构建VHb表达载体，即质粒pPha-fcp-VHb。
(2)转化株的制备
将步骤(1)构建的表达载体利用PCR扩增线性化片段，通过电转化的方式导入细胞内，筛选获得表达透明颤菌血红蛋白的转基因藻株。
根据本发明优选的，步骤(1)中将质粒pPha-T1作为模板，利用引物pPha-BB-F/R，PCR扩增构建载体所需的骨架片段；以含有VHb基因片段的质粒载体为模板，利用引物VHB-F/R扩增VHb基因片段；引物序列如下：
pPha-BB-F：
Figure BDA0002634019870000021
SEQ ID NO.4；
pPha-BB-R：
Figure BDA0002634019870000022
SEQ ID NO.5；
VHB-F：atgttagaccagcaaaccatta SEQ ID NO.6；
VHB-R：ttattcaaccgcttgagcgt SEQ ID NO.7。
序列中的斜体加粗部分表示在载体构建过程中，使用无缝连接酶所需要设计的重叠(over-lap)片段。
进一步优选的，上述PCR反应体系如下：
DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×pfu mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。
进一步优选的，PCR反应条件如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，(引物Tm值-5℃)退火30s，72℃延伸2000bp/min，重复35个循环；72℃延伸10min。
进一步优选的，基于VHb片段与载体骨架之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒进行连接，构建质粒pPha-fcp-VHb。
根据本发明优选的，步骤(2)中利用引物Trans-F-1和Trans-R-2扩增共表达VHb基因与抗性基因的线性片段，用于电转获取单拷贝转化株，引物序列如下：
Trans-F-1：gggctgcaggacgcaatggag SEQ ID NO.8；
Trans-R-2：ctcgagaaaactcatcctgtgcc SEQ ID NO.11。
进一步优选的，将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集(3～5)×108个细胞；用375mM的山梨醇洗3～5次后，向藻液中加入3～5μg VHb基因与抗性基因的线性片段，混匀后置于冰上反应10～60分钟；将反应后的藻液加入电转杯中，在2200～3600V，600～1000Ω，50～100μF条件下进行电击；电击后的藻液立即转移至10mL新鲜的f/2培养基中，避光复苏48小时；复苏后的藻液离心5分钟，弃上清，重悬于适量新鲜培养基中，涂布于含有博来霉素抗性的f/2抗性平板上，于光照培养箱中培养，待6～12周后挑选转化子。
进一步优选的，利用试剂盒对转化株进行基因组提取后，通过PCR对单拷贝转化株进行扩增验证，获得单拷贝转化藻株。
根据本发明优选的，步骤(2)中利用引物Trans-F-1和Trans-R-1扩增VHb表达元件，引物Trans-F-2和Trans-R-2扩增抗性标签元件，用于电转获取多拷贝转化株；引物序列如下：
Trans-F-1：gggctgcaggacgcaatggag SEQ ID NO.8；
Trans-R-1：ctcgagaaaactcatcctgtgcc SEQ ID NO.9；
Trans-F-2：acataccttcagcgtcgtcttca SEQ ID NO.10；
Trans-R-2：ctcgagaaaactcatcctgtgcc SEQ ID NO.11。
进一步优选的，将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集(3～5)×108个细胞；用375mM的山梨醇洗3～5次后，向藻液中加入3～5μg DNA片段，所述DNA片段的组成为VHb表达元件：抗性标签表达元件＝10:1，混匀后置于冰上反应10～60分钟；将反应后的藻液加入电转杯中，在2200～3600V，600～1000Ω，50～100μF条件下进行电击；电击后的藻液立即转移至10mL新鲜的f/2培养基中，避光复苏48小时；复苏后的藻液离心5分钟，弃上清，重悬于适量新鲜培养基中，涂布于含有博来霉素抗性的f/2抗性平板上，于光照培养箱中培养，待6～12周后挑选转化子。
进一步优选的，利用RT-PCR验证VHb基因的表达量，对多拷贝转化株进行验证，获得多拷贝转化株。
上述转基因藻株的培养方法，包括如下步骤：
将转基因藻株在温度23～25℃下培养6-8天，光照条件为前2-3天给予100μmolphotons·m-2·s-1光强，光周期为16h光照、8h黑暗，其余4-5天24h光照，光照培养和黑暗培养过程中的液体溶氧曲线使用Chlorolab-2液相氧电极进行检测。
根据本发明优选的，上述培养方法中，自养培养，选用f/2培养基。
根据本发明优选的，上述培养方法中，兼养培养，选用f/2培养基，并加入至培养基终浓度为2g/L的甘露醇、甘油或葡萄糖作为有机碳源。
进一步优选的，以甘露醇作为有机碳源。
进一步优选的，上述兼养培养中，添加至培养基终浓度为0.2g/L茶多酚以促进藻株对有机碳源的利用。
上述转基因藻株应用于生产岩藻黄质和/或EPA。
根据本发明优选的，上述转基因藻株为单拷贝转化株或多拷贝转化株。
本发明构建了基于三角褐指藻密码子优化的外源透明颤菌血红蛋白表达体系，同时该转基因藻株以甘露醇或CO2为碳源，在兼养或自养条件下进行培养，增加了三角褐指藻的生物量，以及EPA和岩藻黄质的含量。
本发明有益效果：
1、本发明在三角褐指藻中表达了VHb基因，并进一步深入的实现VHb基因的多拷贝表达，使得表达效率提高，实现了高光胁迫与兼养培养条件下，同野生型藻株相比，VHb多拷贝表达转化株的生长速率提高了223％，EPA占油脂含量提高了27％，岩藻黄质产量提高了26％；证实VHb蛋白在微藻受高光胁迫时能够减少氧化损伤，降低光呼吸作用，进而促进微藻生长与不饱和脂肪酸的积累。
2、本发明利用该转化株实现更高效的兼养培养效率，同自养相比，优化VHb基因单拷贝转化株在兼养条件下，其生物量积累提高153％，EPA占油脂含量提高21％，岩藻黄质产量提高71％。
3、本发明首次基于三角褐指藻的偏好性，对VHb基因的密码子进行优化，提高密码子适应指数CAI值由0.58提高到0.99，提高了VHb基因在三角褐指藻中的表达效率。
附图说明
图1 pPha-fcp-VHb表达载体图谱；
图2 RT-PCR验证多拷贝转化株中VHb基因表达量；
图3 CO-差式光谱验证VHb蛋白活性；
图4自养条件下转化株与野生型藻株生长曲线；
图5自养条件下OP-vhb转化株与野生型藻株岩藻黄质与EPA含量；
图6野生型和突变株在暗培养条件下和光培养条件下的溶氧曲线变化；
图7甘露醇兼养条件下转化株与野生型藻株生长曲线；
图8甘露醇兼养条件下OP-vhb转化株与野生型藻株岩藻黄质与EPA含量；
图9优化与未优化VHb基因转化株岩藻黄质与EPA含量；
图10 VHb单拷贝与多拷贝转化株岩藻黄质与EPA含量；
图11不同有机碳源培养转化株与野生型藻株的生长。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，购自中国海洋大学微藻种质库，编号MACC/B228；pPha-T1由数据库公开数据构建，GenBank:AF219942.1；VHb基因依据数据库公开数据(GenBank:KM108313.1)由北京擎科生物科技有限公司合成。
其他原料来源
甘露醇，茶多酚购自山东西唐生物科技有限公司，普通市售产品；
海水盐为购自青岛海之盐水族科技有限公司的蓝色珍品Blue Treasure海盐，普通市售产品。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为普通市售产品。
藻株编号说明
OP-vhb，优化单拷贝VHb转化株
UN-vhb，未优化单拷贝VHb转化株
OP-mul-vhb，优化多拷贝VHb转化株
WT，野生型藻株
实施例1
VHb转化株的构建方法，以及自养条件下VHb转化株的生长及高附加值产品产量的表达VHb转化株的构建方法，包括如下步骤：
(1)VHb基因密码子优化及表达载体的构建
本发明对原VHb基因如SEQ ID NO.1所示，进行藻类偏好性密码子优化，优化后的VHb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示。
以pPha-T1为基础表达载体，在fcp-A启动子下游插入VHb基因，构建VHb表达载体。将质粒pPha-T1作为模板，利用引物pPha-BB-F/R，PCR扩增构建载体所需的骨架片段。引物序列如下，见表1：
表1
pPha-BB-F
Figure BDA0002634019870000061
pPha-BB-R
Figure BDA0002634019870000062
*序列中的斜体加粗部分表示在载体构建过程中，使用无缝连接酶所需要设计的重叠(over-lap)片段。
PCR反应体系：
表2
Figure BDA0002634019870000063
PCR反应条件：
表3
Figure BDA0002634019870000064
基于VHb片段与载体骨架之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒(SeamlessCloning and Assembly Kit，北京全式金生物有限公司，CU101)进行连接，构建质粒pPha-fcp-VHb，如图1所示。
连接反应体系：
表4
Figure BDA0002634019870000071
＊10μL反应体系中，载体与DNA片段的加入量为0.01-0.25pmol，载体与各片段的摩尔比为1：2。
连接反应条件：将反应体系吹打混合均匀后，置于50℃反应15分钟。
单拷贝转化株的电转化
(2)电转化
a.利用引物Trans-F-1和Trans-R-2扩增共表达VHb基因与抗性基因的线性片段，用于电转获取单拷贝转化株。引物序列如下，见表5：
表5
Trans-F-1 gggctgcaggacgcaatggag
Trans-R-2 ctcgagaaaactcatcctgtgcc
b.藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集(3～5)×108个细胞。
c.用375mM的山梨醇洗3～5次后，向藻液中加入3～5μg DNA片段，混匀后置于冰上反应10～60分钟。
d.将反应后的藻液加入电转杯中，在2200～3600V，600～1000Ω，50～100μF条件下进行电击。电击后的藻液立即转移至10mL新鲜的f/2培养基中，避光复苏48小时；
e.复苏后的藻液离心5分钟，弃上清，重悬于适量新鲜培养基中，涂布于含有zeocin(博来霉素)抗性平板上，于光照培养箱中培养，待6～12周后挑选转化子。
(3)转化株筛选
挑取转化子于新鲜的液体培养基中，置于光照培养箱中培养8～10天，取5～10mL藻液，用Trans Direct Plant Tissue PCR Kit(北京全式金生物有限公司，AD301)处理(操作方法参照说明书)，以验证VHb单拷贝转化株。利用引物VHB-F/atgttagaccagcaaaccatta和VHB-R/ttattcaaccgcttgagcgt进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，并测序验证获得优化单拷贝VHb转化株：OP-vhb。
多拷贝转化株的电转化
与上述的不同之处在于，步骤(2)a.利用引物Trans-F-1和Trans-R-1扩增VHb表达元件，引物Trans-F-2和Trans-R-2扩增抗性标签元件(为博来霉素抗性基因表达片段)，用于电转获取多拷贝转化株。引物序列如下，见表6：
表6
Figure BDA0002634019870000081
步骤(2)c中，用375mM的山梨醇洗3～5次后，向藻液中加入3～5μg DNA片段(VHb表达元件：抗性标签表达元件＝10:1)，混匀后置于冰上反应10～60分钟；步骤(3)转化株筛选时，通过RT-PCR验证VHb多拷贝转化株。取20mL藻液离心收集藻细胞，液氮冻干后在研钵中研磨，使用RNA提取试剂盒(EasyPure Plant RNA Kit，北京全式金生物有限公司，ER301)提取并测定RNA浓度，经计算后使用反转录试剂盒(TransScript One Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix Kit，北京全式金生物有限公司AT311)进行反转录，得到的cDNA保存于-20℃。操作方法参照说明书。分别以VHb单拷贝与多拷贝转化株的cDNA为模板，利用引物VHb-RT-F/agcatggcgttaccattacc SEQ ID NO.12和VHb-RT-R/gcctgcttgacaatgtttg SEQ ID NO.13进行RT-PCR实验。设置三个实验平行，扩增程序采用三步法，见表7：
表7
Figure BDA0002634019870000082
以Actin作为内参基因，以VHb单拷贝藻株基因的表达量为对照组，基于临界循环值(Ct)对目的基因的mRNA进行定量，实验数据采用相对定量的方法，按照2-ΔΔCt方法进行计算，比较其与VHb单拷贝转化株之间的基因表达差别，通过计算表达量，以便筛选出VHb多拷贝表达转化株，当log2的值大于1时，认为造成表达量差异的原因为拷贝数的差异，将该转化株认定为多拷贝转化株，其结果如图2所示，即优化多拷贝VHb转化株：OP-mul-vhb。
未密码子优化的VHb转化株
转化株UN-vhb为VHb基因未进行密码子优化，其序列为SEQ ID NO.1，转化株OP-vhb为VHb基因进行密码子优化，其序列为SEQ ID NO.2，同理构建未优化单拷贝VHb转化株UN-vhb。
(4)转化株胞内血红蛋白活力检测
VHb蛋白为同型二聚体，每个亚基有一分子血红素。该血红素可以和CO结合，在419nm呈现特征吸收峰(参见文献：Liu C Y,Webster D A.Spectral characteristics andinterconversions of the reduced oxidized,and oxygenated forms of purifiedcytochrome o[J].Journal of Biological Chemistry,1974,249(13):4261-6.)。这是检测表达血红蛋白是否有功能的准确方法。样品预处理：将野生型和转化株藻细胞100mL分别离心收集，液氮研磨后加入PBS缓冲液(PH＝7.5)并反复冻融破碎细胞，12000g离心10min提取上清蛋白液，加入一定量的Na2S2O4进行还原处理，而后通入CO络合反应3min，将各样品在分光光度计上扫描分析400～500nm的光谱图(参见文献：Demodena J A,Gutiérrez S,Velasco J,et al.The production of cephalosporin C by Acremonium chrysogenumis improved by the intracellular expression of a bacterial hemoglobin[J].Biotechnology,1993,11(8):926-929.)。结果如图3所示。
(5)自养培养
将转化株OP-vhb与野生型藻株以相同初始OD值在温度23～25℃下培养6天，光照条件为前两天给予100μmol photons·m-2·s-1光强，光周期为16h光照、8h黑暗，其余4天24h光照，光照强度为100μmol photons·m-2·s-1。所用f/2培养基，其成分每升含量如下：
1g NaNO3，30g海水盐，4.37mg Na2EDTA，300mg Na2SiO3·7H2O，0.01mg CuSO4·5H2O，0.022mg ZnSO4·7H2O，0.01mg CoCl2·6H2O，0.18mg MnCl2·4H2O，0.006mg Na2MoO4·2H2O。
对转化株与野生型藻株的生长曲线进行比较，如图4所示。
(6)EPA的测定
参照Bigogno的方法(参见文献：BIGOGNO C,KHOZIN-GOLDBERG I,BOUSSIBA S,etal.Lipid and fatty acid composition of the green oleaginous algaParietochloris incisa,the richest plant source of arachidonic acid[J].Phytochemistry,2002,60(5):497-503.)提取油脂，将20mL微拟球藻细胞在4000g下离心收集，弃掉上清。加入6mL氯仿-甲醇(体积比为4：2)，37℃条件下震荡0.5～1h。而后加入2mL0.9％KCl充分震荡，5000g离心5min分离脂质与藻渣。吹干后的藻油加入1.5mL正己烷和4.5mL 2％H2SO4(溶于甲醇)，于85℃甲酯化反应3h，冷却后加入2mL 0.9％KCl，充分震荡后静置或离心3～5min，取上层有机相于离心管中用于气相色谱分析。
利用安捷伦7890A气相色谱进行分析，色谱柱为HP-5(30m×320μm×0.25μm)。进样口温度：250℃；进样体积：1μL；升温程序设置：120℃维持5min，随后3.5℃/min升至240℃，保持10min。EPA占脂肪酸的组成比例结果如图5所示。
(7)岩藻黄质的测定
将三角褐指藻藻细胞在4000×g速度下离心收集，用蒸馏水洗一遍，再次离心并收集藻细胞。将藻细胞重悬在乙醇中进行色素的提取(乙醇:藻液体积＝1:1；v/v)，45℃孵育2小时，每半小时震荡一次，最后，通过高速离心将提取的色素与藻渣分离。
提取出的色素中岩藻黄质含量的测定使用日立高效液相色谱仪检测系统，选择反相安捷伦C18色谱柱(2.7μm，100×4.6mm)。检测波长为445nm，流动相流速为1mL/min，进样量：5μL。流动相为乙腈和水进行梯度洗脱。乙腈比例在8min内由80％升至100％,维持这个比例洗脱3min后,将乙腈比例在5min内线性降至80％，然后再将乙腈浓度升至100％并维持15分钟。岩藻黄质的含量结果如图5所示。
(8)光照和黑暗条件下培养液中溶解氧的测定
步骤(5)中的转化株OP-vhb和野生型藻株自养培养，在第三天进行24h全高光胁迫(光照强度为100μmol photons·m-2·s-1)后，将转化株OP-vhb和野生型藻株分别取2份等量藻液，并分别在光照条件(光照强度为100μmol photons·m-2·s-1)和黑暗条件下孵育1小时，而后将2mL藻液加入Chlorolab-2液相氧电极(Hansatech，英国)的检测室内，光照条件下的藻液使用同等强度的光照继续照射15min，记录培养液的溶氧变化曲线，并计算溶氧变化曲线的斜率，记作光合放氧速率。在黑暗条件下的藻液使用避光条件继续培养15min，同样记录培养液的溶氧变化曲线，并计算溶氧变化曲线的斜率，记作呼吸速率。两种条件下的溶解氧变化如图6所示。
实施例1能够成功构建不同模式的VHb转化株，并在自养条件下VHb转化株的生长及高附加值产品产量高于野生型；VHb基因的表达，不影响藻细胞呼吸作用的效率的同时，提高光合放氧速率，降低藻细胞光呼吸作用对有机物的损耗，进而促进有机物的积累。
实施例2
在兼养条件下培养VHb表达转化株
与实施例1的不同之处在于，实施例1中步骤(5)采用的自养培养方式调整为兼养条件，将自养培养所用f/2培养基，加入至培养基终浓度为2g/L甘露醇作为有机碳源，并添加至培养基终浓度为0.2g/L茶多酚以促进对甘露醇的利用，其余条件与自养条件一致，比较转化株与野生型生长状态的差异，其生长曲线如图7所示，岩藻黄质与EPA含量如图8所示。
实施例2的检测结果证明VHb基因的表达能够促进兼养培养过程中藻细胞利用有机碳进行细胞代谢的效率，该过程也是通过提高细胞氧利用效率实现。
对比例1
同实施例2的培养条件，即在兼养条件下，未密码子优化的转化株UN-vhb与密码子优化的转化株OP-vhb进行比较。
通过对比验证本发明中密码子优化的优势，结果如图9所示。
对比例1的检测结果显示通过优化密码子能够使该基因在细胞内更好的转录翻译并行使功能。
对比例2
单拷贝转化株与多拷贝转化株
同实施例2的培养条件，即在兼养条件下，使用多拷贝转化株OP-mul-vhb与单拷贝转化株OP-vhb进行生长情况的比较，通过对比，验证本发明中使用多拷贝进行表达的优势，结果如图10所示。
对比例2的检测结果显示筛选多拷贝转化株有助于进一步提高兼氧条件下细胞的生长和高附加值产品的生产。
对比例3
不同兼养条件下培养OP-vhb转化株
与实施例2的不同之处在于，对比不同的有机碳源，使用葡萄糖，甘油，甘露醇为有机碳源进行兼养培养，对照CK为自养条件下培养，通过对比，验证本发明中的转化株，使用甘露醇作为有机碳源兼养培养的优势显著，结果如图11所示。
根据上述实施例和对比例的实验结果数据，在三角褐指藻中表达VHb基因，并进一步通过密码子优化和多拷贝筛选，能够不断的提高该基因对三角褐指藻在自养和兼养条件下的生长效率和高附加值产品的生产。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例及实施过程中的优化建议而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60
ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120
cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180
gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240
attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300
gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360
gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420
tacgctcaag cggttgaata a 441
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgctcgacc agcagaccat taacattatt aaggccaccg tccccgtcct caaggaacac 60
ggagtcacca ttaccaccac cttctacaag aacctcttcg ccaagcaccc cgaagtccgc 120
cccctcttcg acatgggacg ccaggaatcc ctcgaacagc ccaaggccct cgccatgacc 180
gtcctcgccg ccgcccaaaa catcgaaaac ctccccgcca tcctccccgc cgtcaagaag 240
attgccgtca agcactgcca ggccggagtc gccgccgccc actaccccat tgtcggacag 300
gaactcctcg gagccatcaa ggaagtcctc ggagacgccg ccaccgacga cattctcgac 360
gcctggggaa aggcctacgg agtcattgcc gacgtcttca tccaagtcga agccgacctc 420
tacgcccagg ccgtcgaata a 441
<210> 3
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu
20 25 30
Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln
35 40 45
Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala
50 55 60
Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys
65 70 75 80
Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro
85 90 95
Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala
130 135 140
Val Glu
145
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caagcggttg aataacagaa gcgtgctatc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgctggtct aacatgagcc aatctagcag 30
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgttagacc agcaaaccat ta 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttattcaacc gcttgagcgt 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggctgcagg acgcaatgga g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctcgagaaaa ctcatcctgt gcc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acataccttc agcgtcgtct tca 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctcgagaaaa ctcatcctgt gcc 23

Claims (15)

1.一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白转基因藻株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）VHb基因密码子优化及表达载体的构建
对原VHb基因如SEQ ID NO.1所示，进行藻类偏好性密码子优化，优化后的VHb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示；以pPha-T1为基础表达载体，在fcp-A启动子下游插入优化后的VHb基因，构建VHb表达载体，即质粒pPha-fcp-VHb；
（2）转化株的制备
将步骤（1）构建的表达载体利用PCR扩增线性化片段，通过电转化的方式导入细胞内，筛选获得表达透明颤菌血红蛋白的转基因藻株。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中将质粒pPha-T1作为模板，利用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，PCR扩增构建载体所需的骨架片段；以含有优化后的VHb基因片段的质粒载体为模板，利用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7扩增优化后的VHb基因片段。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述PCR反应体系如下：
DNA模板 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×pfu mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL；
PCR反应条件如下：
94 °C预变性 5 min；94 °C变性 30 s，引物Tm值-5 °C退火 30 s，72 °C延伸 2000bp/min，重复35个循环；72 °C延伸 10 min。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，基于优化后的VHb片段与载体骨架之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒进行连接，构建质粒pPha-fcp-VHb。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中利用引物SEQ ID NO.8和SEQID NO.11扩增共表达优化后的VHb基因与抗性基因的线性片段，用于电转化获取单拷贝转化株。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集（3~5）×108个细胞；用375 mM的山梨醇洗3~5次后，向藻液中加入3~5 µg 优化后的VHb基因与抗性基因的线性片段，混匀后置于冰上反应10~60分钟；将反应后的藻液加入电转杯中，在2200~3600 V，600~1000 Ω，50~100 µF条件下进行电击；电击后的藻液立即转移至10 mL新鲜的f/2培养基中，避光复苏48小时；复苏后的藻液离心5分钟，弃上清，重悬于适量新鲜培养基中，涂布于含有博来霉素抗性的f/2抗性平板上，于光照培养箱中培养，待6~12周后挑选转化子；
利用试剂盒对转化株进行基因组提取后，通过PCR对单拷贝转化株进行扩增验证，获得单拷贝转化藻株。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中利用引物SEQ ID NO.8和SEQID NO.9扩增优化后的VHb表达元件，引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11扩增抗性标签元件，用于电转获取多拷贝转化株。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集（3~5）×108个细胞；用375 mM的山梨醇洗3~5次后，向藻液中加入3~5 µg DNA片段，所述DNA片段的组成为VHb表达元件：抗性标签表达元件=10:1，混匀后置于冰上反应10~60分钟；将反应后的藻液加入电转杯中，在2200~3600 V，600~1000 Ω，50~100 µF条件下进行电击；电击后的藻液立即转移至10 mL新鲜的f/2培养基中，避光复苏48小时；复苏后的藻液离心5分钟，弃上清，重悬于适量新鲜培养基中，涂布于含有博来霉素抗性的f/2抗性平板上，于光照培养箱中培养，待6~12周后挑选转化子；
利用RT-PCR验证VHb基因的表达量，对多拷贝转化株进行验证，获得多拷贝转化株。
9.权利要求1-8任一项所述转基因藻株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将转基因藻株在温度23～25℃下培养6-8天，光照条件为前2-3天给予100 μmolphotons·m−2·s−1光强，光周期为16 h光照、8 h黑暗，其余4-5天24 h光照。
10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法中，自养培养，选用f/2培养基。
11.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法中，兼养培养，选用f/2培养基，并加入至培养基终浓度为2 g/L的甘露醇、甘油或葡萄糖作为有机碳源。
12.如权利要求11所述的培养方法，其特征在于，以甘露醇作为有机碳源。
13.如权利要求11所述的培养方法，其特征在于，所述兼养培养中，添加至培养基终浓度为0.2 g/L茶多酚以促进藻株对有机碳源的利用。
14.权利要求1-8任一项所述转基因藻株在生产岩藻黄质和/或EPA中的应用。
15.如权利要求14所述应用，其特征在于，转基因藻株为多拷贝转化株。
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