CN111893067B - 一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20358。该产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌从南极磷虾中筛选得到，其最适生长温度与最佳产酶温度均接近于自然环境中的温度，因此在发酵过程中可省去加热或冷却的过程，该菌株所产蛋白酶最适反应温度在37℃左右，并且在0‑60℃之间均有较好的催化活性（最高催化酶活的60％以上），具有低温适应性和较好的热稳定性。

Description

一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物筛选及应用领域，具体涉及一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌及其应用。
背景技术
酶普遍意义是指能够在常温下、甚至是低温条件下催化水解肽键的一类酶。低温蛋白酶是指最适催化温度在 40℃以下，并且在 20~30℃之间仍能保持较高酶活(50﹪以上)的一类蛋白水解酶，由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热或冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，在食品及洗涤行业具有广泛的应用前景。目前已发现的产低温蛋白酶菌株有来源于冰川冻土中的地衣芽孢杆菌和短小杆菌、来源于南极地区的梭状芽孢杆菌和嗜冷杆菌、来源于海洋浮冰中的科尔韦尔氏菌属、来源于寒漠地区的微小杆菌以及来源于其它寒冷环境中的沙雷氏菌、弧菌、黄单胞菌、希瓦氏菌属产黄青霉等。这些菌株所产低温蛋白酶的最适催化温度大部分均在30～40℃之间，只有少数几种的最适催化温度低于 20℃，但稳定性很差。
生活在南极极端寒冷环境下的南极磷虾Antarctickrill和Euphausiasuperba，生活温度从-1.7°C至-3°C，是南极生态系统中的关键物种。因其庞大的生物量，在南极海域生物链中以细菌、藻类与微型浮游动物为食，同时也是顶级捕食者的猎物，在南极生态系统中占据重要地位。适应低温的生物需要专门的酶来维持低温下的功能完整性，而适冷生物体内的酶相较于适温性动物在低温下具有更高的活性和催化效率。南极磷虾体内包含多种蛋白水解酶，目前的研究已经证明从南极磷虾体内分离得到的蛋白水解酶对坏死组织有降解作用，可以作为清创剂用于医疗。
自1972 年Nabou Kato等首次报道了海洋细菌Peseudomoassp. No.548产生蛋白酶后，国内外许多课题组对海洋微生物来源的蛋白酶进行了研究，主要集中在新的产酶微生物及新型蛋白酶如适冷蛋白酶、高温蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等方面。中国专利CN104818225A公开了一种低温蛋白酶生产菌：动性球菌 Planococcus sp.，其来源于南印度洋深海沉积物。中国专利CN110724701A公开了低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，该低温胰蛋白酶即使在低温下也具有良好的酶活活性。但到目前为止，还没有从南极磷虾中分离提取得到产低温蛋白酶的菌株，且从其它低温环境中分离得到的低温蛋白酶的热稳定性差，加热易分解失活。
发明内容
针对现有技术中存在的中高温蛋白酶低温适应性差及热稳定差的问题，本发明提供了一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌及其应用，该产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌从南极磷虾中筛选得到，其最适生长温度与最佳产酶温度均接近于自然环境中的温度，因此在发酵过程中可省去加热或冷却的过程，该菌株所产蛋白酶最适反应温度在37℃左右，并且在 0-60℃之间均有较好的催化活性 （最高催化酶活的 60％以上），具有低温适应性和较好的热稳定性。
本发明通过以下技术方案实现：
一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 20358。
进一步地，所述的西伯利亚微小杆菌为短杆状的革兰氏阳性菌。
本发明中，所述的产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌在生产低温蛋白酶中的应用。
进一步地，所述的低温蛋白酶由产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌发酵获得。进一步地，所述的发酵采用的发酵温度为10~20℃。
有益效果
1. 本发明产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌发酵条件易于控制，该菌株的最适生长温度与最佳产酶温度均接近于自然环境中的温度，因此在发酵过程中可省去加热或冷却的过程；
2. 本发明产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌所产的低温蛋白酶最适催化温度为37℃左右，在 30-40℃之间可保持较高的催化活性，接近人体的正常温度。低温蛋白酶在0~60℃仍保持较高的酶活活性，最高催化酶活的 60％以上，既可以适应低温环境，而且具有良好的热稳定性，扩大了其应用范围。
菌种保藏信息
保藏时间：2020年7月14日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC No.20358；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；
分类命名：西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）。
附图说明
图1筛选出的菌株照片，a为在平板式水解产生的透明圈图，b为纯化画线图形；
图2为西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）革兰氏染色显微镜照片；
图3为琼脂糖凝胶电泳图片；
图4为本发明西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）的系统发育树图；
图5酪氨酸标准曲线
图6低温蛋白酶不同温度下的相对酶活。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本发明所述的产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌来源于南极磷虾，经多次筛选后获得，分类命名为西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）。该菌株于2020年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 20358。
菌株筛选：包括采集样品、处理样品、初级筛选、复筛、测定酶活、鉴定高产菌株，菌种保藏。
1）采集样品：从山东某海鲜市场购买南极磷虾。
2）处理样品：在低温下用研钵研磨南极磷虾直至磨碎，称取3g，加入无菌水中，定容至30mL，作为原液，分装入试管，将试管置于恒温培养床中固定好，设定180r/min，定时30分钟。
3）初级筛选（平板分离）：用无菌水按照10-1～10-5 g/ml浓度梯度稀释原液分装入管，接种在准备好的分离培养平皿上,放在设定好的温度为15℃的恒温培养箱中，培养2周。在长出的菌落中，选择菌落形状比较大并且菌落周围透明圈比较大的单菌落，通过平板分离，筛选出一水解圈最大的菌株，水解圈直径与菌落直径的比值为2.1，再将选择好的的单菌落在超净工作台里划线纯化，重复3次，得到更纯的菌株；图1为筛选出的菌株在平板式水解产生的透明圈及划线纯化图形；
所述的平板分离时所用的固体培养基由表1成分和琼脂组成，琼脂按照20g/L的比例加入，pH 7.2-7.4，灭菌20min后倒板备用。
表1 培养基成分列表
Figure 810314DEST_PATH_IMAGE001
。
4）再次筛选
配制液体发酵培养基，成分与表1相同，pH 7.2-7.4，分装入三角瓶，灭菌 20min后备用,；
在容量为250mL的三角瓶中，装入100mL发酵培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，把初次筛选得到的菌株转接之后，放在15 ℃恒温培养床中，以180r/min培养5天，得到复筛的菌株；
复筛后菌株在平板上水解圈直径与菌落直径的比值的直径比2.2。
5）产低温蛋白酶菌株的鉴定
a）革兰氏染色
革兰氏染色方法步骤，涂片，固定，初染，媒染，脱色，复染，最后在显微镜下观察,显微镜图片如图2所示：菌体是蓝紫色的，单个细胞是短杆状的，排列不规则，鉴定为革兰氏阳性菌；
b）提取细菌基因组DNA
按照细菌基因组DNA提取试剂盒的原理步骤提取基因组DNA,就能获得高质量的细菌基因组DNA；
c）PCR扩增
DNA扩增反应体系（50μL）：
Mix 25μL
ddH2O 20μL
上游引物（F） 2μL
下游引物（R） 2μL
模板1μL；
PCR反应条件：
94预变性4min
94变性1min
55退火1min
72延伸2min
30个循环
72补齐10min；
d）PCR产物电泳
琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察条带(如图4所示)，该菌株16srDNA片段长3500bp左右，公司测序，16srDNA序列同数据库进行相似性比较，建立系统发育进化树，本专利微小杆菌的系统发育树图如图4所示，与数据库比较，序列相似性为99.9%，序列同源性为99.9%，可鉴定出所筛选出的菌株属于西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）。
实施例2
低温蛋白酶酶活测定
（1）酶活力测定
碱性蛋白酶的酶活性的测定方法一般使用Folin-苯酚显色法。一个酶活性单位U本实验设定在恒温37 ℃条件下每分钟水解酪蛋白能生成酪氨酸1μmol时所需要的酶量，按以下公式计算酶活值
U=A*B*C/D
U蛋白酶酶活值；
A样品吸光值与空白吸光值之差，比较标准曲线后的酪氨酸释放量（μg/mL）；
B反应放大倍数；
C酶稀释倍数；
D反应时间。
配制如实施例1表1所示的液体培养基，在容量为250mL的三角瓶中，装入100mL发酵培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，把将实施例1中筛选得到的西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）转接之后，放在15 ℃恒温培养床中，以180r/min培养5天，得发酵液。
发酵液处理，4℃，6000r/min 15min离心，得到上清液即酶液。酶液过滤后，取800μL稀释10倍（稀释液：磷酸盐缓冲液），分装，每管1ml,37℃ 10min。每管加1ml 2%干酪素缓冲液(先加TCA的做空白对照)，37℃下反应10min后加2mlTCA，离心1min，加碳酸钠溶液和福林酚试剂，发色10min，660nm测值。
表2为酪氨酸标准溶液配置方法，根据表2，取4支试管，试管中逐步加入如上溶液，37 ℃水浴，等待30min。之后测定吸收值(在660nm处)，把得到的数据绘制标准曲线，建立回归线方程，如图5所示。
Figure 14900DEST_PATH_IMAGE002
用 Folin 显色法测定了微小杆菌的酶活性，结果显示西伯利亚微小杆菌吸光值为0.531，相对酶活为8.65。
实施例3
最适酶活测定
西伯利亚微小杆菌的发酵、酶液处理步骤与实施例2相同，不同的是设置温度梯度（0-60℃，每个5℃做一次反应）下反应10min后加2mlTCA，离心1min，加碳酸钠溶液和福林酚试剂，发色10min，660nm测值。相对酶活如下表6所示。
经测定，该菌株最适酶活温度为37℃,在0-60℃也存在较高的活性，说明这种低温蛋白酶既耐高温也耐低温，说明低温蛋白酶热稳定性较好。

Claims (4)

1.一种产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum），其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 20358；
所述的西伯利亚微小杆菌为短杆状的革兰氏阳性菌。
2.一种权利要求1所述的产低温蛋白酶的西伯利亚微小杆菌在生产低温蛋白酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的低温蛋白酶由西伯利亚微小杆菌发酵获得。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵采用的发酵温度为10~20℃。
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